תלת ממדי Assay תרבות לחקור הפולשנות תאים סרטניים היווצרות גידולים בלוויין
Summary
Cancer cells are embedded in a collagen gel and then sandwiched in an acellular fibrin gel to generate a 3D culture system in which the invasiveness and formation of satellite tumors may be monitored.
Abstract
תרבית תאים יונקת monolayers נעשתה שימוש נרחב ללמוד תהליכים פיסיולוגיים ומולקולריים שונים. עם זאת, גישה זו ללמוד תאי גדלים מניבים לעתים חפצים לא רצויים. לכן, תרבית תאים בסביבה תלת ממדי (3D), לעתים קרובות תוך שימוש ברכיבים תאים מטריקס, הגיחה כחלופה מעניינת בשל דמיון הקרוב אל הילידים ברקמות vivo או איבר. פתחנו מערכת תרבית תאי 3D באמצעות שני תאים, כלומר (אני) תא מרכזי המכיל תאים סרטניים מוטבעים מתנהג ג'ל קולגן כגידול macrospherical פסאודו-יסודי (ii) תא היקפי תא ללא עשוי ג'ל הפיברין, כלומר מרכיב תא מטריקס שונה מאלה ששמשו במרכז, שבו תאים סרטניים יכולים לנדוד (מול פלישה) ו / או יוצרים גידולי microspherical המייצג גידולים משניים או בלווין. ההיווצרות של גידולי לווין בתא הפריפריה היאלהפליא בקורלציה פי מידת האגרסיביות ידוע או מוצא גרורתי של תאים סרטניים הילידים, מה שהופך מערכת התרבות 3D זה ייחודי. גישת תרבית תאים זה עשוי להיחשב להעריך הפולשנות תאים סרטניים תנועתיות, אינטראקציות מטריקס-תאיים תא כשיטה להעריך נכסי תרופה אנטי-סרטניים.
Introduction
חקירת המאפיינים הבסיסיים ואת הביו-רפואיים של פלישת תאים סרטניים / הגירה והקמת גרורות הבאה היא הנושא של 1,2 מחקר אינטנסיבי. גרורה היא לשלב הסופי של הסרטן והניהול הקליני שלה נותר חמקמק. הבנה טובה יותר של גרורות ברמות התאיות ומולקולריות תאפשר הפיתוח של טיפולים יעילים יותר 3.
מספר מאפיינים של תאים גרורתי יכולים להיחקר במבחנה 4 כולל stemness והפוטנציאל שלהם לרכוש מדינה מעברת (למשל, מעבר mesenchymal-epithelioid) להגר ולפלוש בתוך מן הגידול הראשוני 5. עם זאת, ההערכה חוץ גופית של תהליכים הפלישה / גרורות כבר אתגר שכן הוא כמעט אינו כולל את התרומה של זרימת הדם / הלימפה. תרבויות Organotypic מטמיעי שברי גידול ג'ל קולגן יש לשנים קודמותערמומי נעשה שימוש כדי לפקח תוקפנות הסרטן. למרות המורכבות של גידולים נשמרות (למשל, הנוכחות של תאים לא סרטניים), שברי גידול נחשפות דיפוזיה בינוני מוגבל, כדי וריאצית דגימה, וכדי גידול יתר של תאי סטרומה 6. שיטה חלופית מורכבת בגידול תאים סרטניים בתוך מרכיבי תאי מטריקס (ECM), אשר מחק את סביבת התא תלת ממדי (3D). הריבוי של שורות תאי סרטן שד ג'ל קולגן ו / או מרתף קרום נגזר מטריקס הוא בין הדוגמות המאופיינות ביותר של תרבית תאי 3D. באמצעות סביבות תרבות תא ספציפיות 3D, ההרכבה לא המאורגנת שנצפתה עבור תאי סרטן השד גדלו בתנאים סטנדרטיים יכולה להיות הפוכה להיווצרות הספונטנית של acini החלב כגלילים 7-10. יתר על כן, היווצרות spheroids הגידול רב-תאיים שמקורם בתאי סרטן אדנוקרצינומה התקהלו שימוש בטכניקות שונות (למשל, תלוי טיפות, צוף spheroids, אגר embedment) מהווה כיום את assay תרבית תאי 3D הנפוץ ביותר 11-13. עם זאת, assay זה הוא מוגבל על ידי הקבוצה המוגבלת של שורות תאי הסרטן שיכול ליצור spheroids ועל ידי התקופה הקצרה הזמינה ללמוד תאים בתנאים אלה.
בטכניקה דמיינה זו, אנו בזאת להציג assay תרבות מתוחכם תא 3D שבו תאים סרטניים של עניין מוטבעים ג'ל קולגן לאפשר במבחנת היווצרות גידול פסאודו-יסודיים שניתן מצופה לחלופין עם מטריצת קרום הנגזרות במרתף. מרגע היווצרותם, הגידול פסאודו-יסודיים ואז היא דחוקה מטריקס acellular (ג'ל הפיברין במקרה הנוכחי), אשר מאפשר את התאים הסרטניים לחצות את הממשק בין שני תאי מטריקס (ראה איור 1). מעניין, מבני גידול דמוי משני שמקורם מן הגידול פסאודו-יסודי יחד עם תאי סרטן אגרסיביים מופיעיםג'ל הפיברין. מערכת כזו תרבות 3D מציעה את הגמישות הנדרשת כדי לחקור, למשל, תרופות נגד סרטן, ביטוי גנים תאים תאים ו / או תא-ECM אינטראקציות 14-16.
איור 1:.. סקירה כללית של שיטת סיכום סכמטי של השיטה כדי ליצור את מערכת תרבית תאי 3D כמודל ללימודי סרטן אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
Protocol
Representative Results
Discussion
בתור הערת שוליים טכני חשוב, זה חיוני כי אין פער קיים בממשק בין מרכזי הג'לים הפריפריה. אחרת, זה עלול להפחית את היכולת של התאים לנדוד / לפלוש הג'ל הפיברין. רווח בין קולגן ג'לים הפיברין עלול להיווצר במהלך תרבות 24 שעות של הראשון אם תרומבין לא דוללו כראוי. אפשר גם כי שור…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Work partially funded by Prostate Cancer Canada (grant # D2014-4 to SG and CJD) and the Canadian Institutes of Health Research (grant # MOP-111069 to SG). We would like to thank Dr. Richard Poulin for editorial assistance and Mrs. Chanel Dupont for technical assistance.
Materials
| Freeze-dried collagen | Sigma-Aldrich | C7661 | from rat tail tendon (soluble dispersion) or home-made (see Rajan et al., ref.#14) |
| Fibrinogen (freeze-dried) | Sigma-Aldrich | F8630 | Type I-S, 65-85% protein with ≥75% of protein is clottable |
| Thrombin | EMD Chemicals Inc. | 605157 | Gibbstown, NJ; NIH units/mg dry weight |
| Growth factor-reduced Matrigel | Corning | 356234 | Previously from BD Biosciences |
| Aprotinin | Sigma-Aldrich | A6279 | solution at 5-10TIU/ml (Trypsin Inhibitor Unit) |
| Micro-spoons | Fisher Scientific | 2140115 | Fisherbrand Handi-Hold Microspatula |
| 96 well plate, round base | Sarstedt | 3925500 | |
| 24 well plate | Sarstedt | 3922 | |
| Dulbecco's modified Eagle's Medium | Sigma Chemical, Co. | D5546 | DMEM |
| Fetal Bovine Serum | VWR | CAA15-701 | FBS, Canadian origin. |
| Trypsin-EDTA | Sigma Chemical, Co. | T4049 | |
| Hank’s Balanced Salt Solution | Sigma Chemical, Co. | H8264 | HBSS |
References
- Alizadeh, A. M., Shiri, S., Farsinejad, S. Metastasis review: from bench to bedside. Tumour Biol. 35 (9), 8483-8523 (2014).
- Roudsari, L. C., West, J. L. Studying the influence of angiogenesis in in vitro cancer model systems. Adv Drug Deliv Rev. , (2016).
- Bill, R., Christofori, G. The relevance of EMT in breast cancer metastasis: Correlation or causality. FEBS Lett. 589 (14), 1577-1587 (2015).
- Kimlin, L. C., Casagrande, G., Virador, V. M. In Vitro Three-Dimensional (3D) Models in Cancer Research: an Update. Mol Carcinog. 52 (3), 167-182 (2013).
- Obenauf, A. C., Massagué, J. Surviving at a Distance Organ-Specific Metastasis. Trends Cancer. 1 (1), 76-91 (2015).
- Sykes, J. A., Fogh, J. Separation of Tumor Cells from Fibroblasts. Human Tumor Cells In Vitro. 1, 1-22 (1975).
- Lang, S. H., Stark, M., Collins, A., Paul, A. B., Stower, M. J., Maitland, N. J. Experimental Prostate Epithelial Morphogenesis in Response to Stroma and Three-Dimensional Matrigel Culture. Cell Growth Differ. 12 (12), 631-640 (2001).
- Debnath, J., Muthuswamy, S. K., Brugge, J. S. Morphogenesis and Oncogenesis of MCF-10A Mammary Epithelial Acini Grown In Three-Dimensional Basement Membrane Cultures. Methods. 30 (3), 256-268 (2003).
- Shaw, L. M. Tumor cell invasion assays. Methods Mol. Biol. 294, 97-105 (2005).
- Nelson, C. M., Bissell, M. J. Modeling Dynamic Reciprocity: Engineering Three-Dimensional Culture Models of Breast Architecture, Function, and Neoplastic Transformation. Semin Cancer Biol. 15 (5), 342-352 (2005).
- Hedlund, T. E., Duke, R. C., Miller, G. J. Three-Dimensional Spheroid Cultures of Human Prostate Cancer Cell Lines. Prostate. 41 (3), 154-165 (1999).
- Le, V. M., Lang, M. D., Shi, W. B., Liu, J. W. A Collagen-Based Multicellular Tumor Spheroid Model for Evaluation of the Efficiency of Nanoparticle Drug Delivery. Artif. Cells Nanomed Biotechnol. 15, 1-5 (2014).
- Neto, A. I., et al. A Novel Hanging Spherical Drop System for the Generation of Cellular Spheroids and High Throughput Combinatorial Drug Screening. Biomater Sci. 3 (4), 581-585 (2015).
- Janvier, R., Sourla, A., Koutsilieris, M., Doillon, C. J. Stromal Fibroblasts are Required for PC-3 Human Prostate Cancer Cells to Produce Capillary-like Formation of Endothelial Cells in a Three-dimensional Co-culture System. Anticancer Res. 17 (3A), 1551-1557 (1997).
- Doillon, C. J., Gagnon, E., Paradis, R., Koutsilieris, M. Three-dimensional Culture System as a Model for Studying Cancer Cell Invasion Capacity and Anticancer Drug Sensitivity. Anticancer Res. 24 (4), 2169-2177 (2004).
- Gobeil, S., Zhu, X., Doillon, C. J., Green, M. R. A Genome-Wide shRNA Screen Identifies GAS1 as a Novel Melanoma Metastasis Suppressor Gene. Genes Dev. 22 (21), 2932-2940 (2008).
- Rajan, N., Habermehl, J., Coté, M. F., Doillon, C. J., Mantovani, D. Preparation Of Ready-To-Use, Storable And Reconstituted Type I Collagen From Rat Tail Tendon For Tissue Engineering Applications. Nat Protoc. 1 (6), 2753-2758 (2007).
- Horie, M., et al. Characterization of Human Lung Cancer-associated Fibroblasts in Three-dimensional In Vitro Co-culture Model. Biochem Biophys Res Commun. 423 (1), 158-163 (2012).
- Banyard, J., et al. Identification of Genes Regulating Migration and Invasion Using a New Model of Metastatic Prostate Cancer. BMC Cancer. 30 (14), 387 (2014).
- Palumbo, J. S., Degen, J. L. Fibrinogen and Tumor Cell Metastasis. Haemostasis. 31, 11-15 (2001).
- Dvorak, H. F. Tumor Stroma, Tumor Blood Vessels, and Antiangiogenesis Therapy. Cancer J. 21 (4), 237-243 (2015).
- Luoto, K. R., Kumareswaran, R., Bristow, R. G. Tumor Hypoxia as a Driving Force in Genetic Instability. Genome Integr. 4 (1), 5 (2013).
- Das, V., Bruzzese, F., Konečný, P., Iannelli, F., Budillon, A., Hajdúch, M. Pathophysiologically Relevant In Vitro Tumor Models for Drug Screening. Drug Discov Today. 20 (7), 848-855 (2015).
- Longati, P., et al. 3D Pancreatic Carcinoma Spheroids Induce a Matrix-rich, Chemoresistant Phenotype Offering a Better Model for Drug Testing. BMC Cancer. 13 (95), (2013).
- Tan, P. H., Chia, S. S., Toh, S. L., Goh, J. C., Nathanm, S. S. Three-dimensional Spatial Configuration of Tumour Cells Confers Resistance to Chemotherapy Independent of Drug Delivery. J Tissue Eng Regen Med. , (2013).
- Koutsilieris, M., Reyes-Moreno, C., Choki, I., Sourla, A., Doillon, C., Pavlidis, N. Chemotherapy Cytotoxicity of Human MCF-7 and MDA-MB 231 Breast Cancer Cells is Altered by Osteoblast-Derived Growth Factors. Mol Med. 5 (2), 86-97 (1999).
- Lang, N. R., et al. Biphasic Response of Cell Invasion to Matrix Stiffness in Three-Dimensional Biopolymer Networks. Acta Biomater. 13, 61-67 (2015).
