암 세포 침윤 및 위성 종양 형성을 탐색하는 문화 분석 세 가지 차원
Summary
Cancer cells are embedded in a collagen gel and then sandwiched in an acellular fibrin gel to generate a 3D culture system in which the invasiveness and formation of satellite tumors may be monitored.
Abstract
단일 층에서 포유 동물 세포 배양 널리 다양한 생리 학적 및 분자 과정을 연구하는 데 사용됩니다. 그러나 성장 세포를 연구하는이 방법은 종종 원치 않는 아티팩트를 생성합니다. 따라서, 주로 세포 외 기질 성분을 사용하여 3 차원 (3D) 환경에서 세포 배양이 때문에 생체 조직 또는 기관에서 고유로 그 유사성 흥미로운 대안으로 나타났다. 우리는 피브린 겔 이루어지는 의사 차 macrospherical 종양 및 (ⅱ) 주연 무 세포 격실 콜라겐 겔 연기에 포함 된 암 세포를 함유하는 중앙 구획 개의 구획, 즉 (i)를 이용하여 3 차원 세포 배양 시스템을 개발 즉, 센터에서 사용되는 다른 세포 외 매트릭스 성분이있는 암세포 마이그레이션 (내습 전면) 및 / 또는 보조 위성을 나타내는 종양 microspherical 종양을 형성 할 수있다. 주변 구획 위성 종양의 형성은이 현저 차원 배양 시스템의 차별화 네이티브 종양 세포의 공지 공격성 또는 전이성 기원 상관. 이 세포 배양 방법은 암 세포의 침윤과 운동성, 세포 외 기질의 상호 작용 및 항암 약물의 특성을 평가하는 방법으로 평가하는 것으로 간주 될 수있다.
Introduction
암 세포 침공 / 마이그레이션 및 후속 전이 설립의 기본 및 생물 의학 특성을 조사하는 강렬한 연구 1, 2의 주제이다. 전이 암의 최종 단계이며, 임상 관리하기 어려운 남아있다. 세포 및 분자 수준에서의 전이에 대한 이해는보다 효율적인 치료 (3)의 개발을 가능하게한다.
전이성 세포의 여러 특성은 자신의 stemness 및 마이그레이션 내에서 기본 종양 5 침공 전이 상태 (예를 들면, 상피 – 중간 엽 전이를) 획득 가능성을 포함하여 시험 관내 4 탐험 할 수 있습니다. 그것은 거의 혈액 / 림프 순환의 기여를 배제하기 때문에, 내습 / 전이 과정의 시험 관내 평가는 도전하고있다. 콜라겐 젤에 종양 조각을 삽입의 Organotypic 문화는 기존에 가지고교활한 암의 공격성을 모니터링하는 데 사용되었다. 종양의 복잡도가 보존되어 있지만 (예를 들면, 비 – 암성 세포의 존재), 종양 절편 샘플링 변동 제한된 확산 매체에 노출 및 기질 세포 (6)의 과도한 성장한다. 대안적인 방법은 3 차원 셀 환경을 모방 세포 외 기질 (ECM)의 구성 요소 내에서의 암세포 성장에있다. 콜라겐 겔 및 / 또는 기저막 유래 매트릭스 유방암 세포주의 증식 차원 세포 배양의 가장 특징으로하는 실시 예 사이이다. 특정 3 차원 세포 배양 환경을 사용하여 표준 조건 하에서 성장 유방암 세포에 대해 관찰 된 무질서 조립체 유방 꽈리 및 관상 구조 7-10의 자연 형성에 역전 될 수있다. 또한, 선암종 암세포 유래의 다세포 종양 타원체의 형성은 (서로 다른 기술을 이용하여 군집예를 들면, 현재 가장 일반적으로 사용되는 3 차원 세포 배양 분석법 11-13을 구성하는) 매립 한천, 타원체, 플로팅 방울 매달려. 그러나 이러한 분석은 구 상체를 형성 할 수있는 암 세포주의 제한된 세트에 의해 이러한 조건에서 세포를 연구 할 수 짧은 기간에 의해 제한된다.
이러한 시각화 방법에서, 우리는 본 명세서에서 관심있는 암세포 대안 기저막 유래 매트릭스로 피복 될 수있는 의사 원발 종양의 체외 형성을 허용하기 위해 콜라겐 겔에 포함 된 정교한 3D 세포 배양 분석을 소개한다. 형성되면, 가상 기본 종양 후 암세포 두 매트릭스 구획과의 계면을 통과 할 수있는 무 세포 기질 (본 경우 피브린 겔)에 끼워진다 (도 1 참조). 흥미롭게 공격적인 암세포와 함께 의사 원발 종양 유래 이차 종양 같은 구조가 나타나지섬유소 젤. 이러한 3 차원 배양 시스템은 예를 들어, 항암제, 유전자 발현 및 세포 – 세포 및 / 또는 세포 ECM 상호 14-16 조사하는 필요한 유연성을 제공한다.
그림 1 :.. 방법의 개요 암 연구를위한 모델로 3D 세포 배양 시스템을 생성하는 방법의 도식 요약 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
Protocol
Representative Results
Discussion
중요한 기술적 각주, 갭 중앙과 주변 겔 사이의 계면에 존재하지 않는 것이 중요하다. 그렇지 않으면 / 마이그레이션 피브린 겔 침투하는 전지의 용량을 줄일 수있다. 트롬빈 적절히 희석되지 않은 경우 콜라겐과 피브린 겔 사이의 공간은 배양의 처음 24 시간 동안 형성 할 수도있다. 콜라겐 겔을 초래할 수 시험 세포주 모두시켜 겔 사이에 형성하기 위해 상대적으로 큰 공간을 일으키는 동안 배양 …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Work partially funded by Prostate Cancer Canada (grant # D2014-4 to SG and CJD) and the Canadian Institutes of Health Research (grant # MOP-111069 to SG). We would like to thank Dr. Richard Poulin for editorial assistance and Mrs. Chanel Dupont for technical assistance.
Materials
| Freeze-dried collagen | Sigma-Aldrich | C7661 | from rat tail tendon (soluble dispersion) or home-made (see Rajan et al., ref.#14) |
| Fibrinogen (freeze-dried) | Sigma-Aldrich | F8630 | Type I-S, 65-85% protein with ≥75% of protein is clottable |
| Thrombin | EMD Chemicals Inc. | 605157 | Gibbstown, NJ; NIH units/mg dry weight |
| Growth factor-reduced Matrigel | Corning | 356234 | Previously from BD Biosciences |
| Aprotinin | Sigma-Aldrich | A6279 | solution at 5-10TIU/ml (Trypsin Inhibitor Unit) |
| Micro-spoons | Fisher Scientific | 2140115 | Fisherbrand Handi-Hold Microspatula |
| 96 well plate, round base | Sarstedt | 3925500 | |
| 24 well plate | Sarstedt | 3922 | |
| Dulbecco's modified Eagle's Medium | Sigma Chemical, Co. | D5546 | DMEM |
| Fetal Bovine Serum | VWR | CAA15-701 | FBS, Canadian origin. |
| Trypsin-EDTA | Sigma Chemical, Co. | T4049 | |
| Hank’s Balanced Salt Solution | Sigma Chemical, Co. | H8264 | HBSS |
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