Summary
Dieses Protokoll beschreibt eine detaillierte Methode zur Erkennung von H2O2 Lokalisierung innerhalb Solea Senegalensis Spermien mit einem sensiblen Fluorochrom RLKV-DA für ROS, ein Leben Mitochondrien Fleck für Mitochondrien und DAPI für Kerne Visualisierung, beziehungsweise. Das Protokoll soll innerhalb von 2 h mit frischen oder aufgetauten Spermien durchgeführt werden.
Abstract
Oxidativer Stress ist einer der wichtigsten Faktoren in abnehmender Qualität der Spermien. Entwicklung von effizienten Protokolle zur Erkennung von reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) in Spermien ist von großer Bedeutung in irgendeiner Sorte, aber diese Methoden sind selten genutzte und noch weniger in teleost. Kryokonservierung ist eine nützliche Technik in der Aquakultur für verschiedene Zwecke, einschließlich gen Banking und garantierte Verfügbarkeit der Spermien im Laufe des Jahres. Einfrieren/Auftauen Verfahren könnte dazu führen, dass ROS-Produktion und schädigen die Spermien. Bedenkt, dass die potenziellen Schäden kann ein Übermaß an ROS-Produktion in Spermien je nach ihrer Lokalisation, hier eine detaillierte Methode, H2O2 erkennen und bewerten die intrazelluläre Lokalisation durch konfokale Mikroskopie führen steht zur Verfügung. Zu diesem Zweck eine Kombination von 3 Fluorochromes (2, 7-Dichlorodihydrofluorescein Diacetat (RLKV-DA), ein live Mitochondrien Fleck und 4 ', 6-Diamidino-2-Phenylindole Dihydrochloride (DAPI)) werden verwendet, um die Co Lokalisierung von H2O 2bewerten mit Samenzellen Kerne oder Mitochondrien in Solea Senegalesis Spermaproben.
Introduction
Reaktive Sauerstoff-Spezies-Produktion mit Spermienqualität verknüpft wurde vor kurzem1. ROS-Produktion in den Mitochondrien einen normalen physiologischen Prozess betrachtet werden kann, zwar oxidativer Stress durch ein Übermaß an ROS-Produktion eine klare Ursache des Schadens in Spermien auf verschiedenen Ebenen. Beim Menschen ist oxidativer Stress zugeordnet männliche Unfruchtbarkeit, Motilität und die Fähigkeit zur Rechtsfähigkeit2unterziehen zu verändern; bei Säugetieren ist Veränderung der DNA-Integrität in Tiefgefriersperma Proben auch zur Synthese von H2O23verbunden.
Kryokonservierung ist ein gängiges Verfahren für gen-banking in der Aquakultur. Diese Technologie ist besonders wichtig bei Arten mit reproduktiven Problemen wie Solea Senegalensis. Dieses wertvollen Arten auf dem Markt zeigt reproduktiven Dysfunktion bei Personen, die in Gefangenschaft aufgrund mangelnder Balz geboren. Diese Tatsache macht die Kryokonservierung von Spermien Spermien Verfügbarkeit für künstliche Befruchtung erforderlich. Jedoch könnte die Kryokonservierung eine Quelle von oxidativem Stress, die schädlich für Spermien4 sein könnte, wie Studien eine positive Wirkung von antioxidativen Supplementierung berichtet haben. ROS-Hemmung durch mitochondriale gezielte antioxidative war angeblich vorteilhaft für die Kryokonservierung von Spermien in gelbe Wels5.
Daher sind die Konzentrationen von ROS in Spermaproben wichtig zu wissen, vor allem nach Kryokonservierung6,7 , weil diese Moleküle als ein Nachteil für das Überleben der Spermien und Fruchtbarkeit8erkannt worden sind. Darüber hinaus könnte lernen die Verteilung von ROS innerhalb der Zelle entscheidend für die Höhe des potenziellen Schadens ableiten. Als Beispiel könnte niedrigen Niveau von ROS in den Mitochondrien können davon ausgegangen werden, normal und mit Spermienfunktion kompatibel, aber hohe Konzentrationen von ROS im Zellkern Indikatoren der Spermien-DNA-Schäden. H2O2 ist eines der wichtigsten ROS, die von den Mitochondrien freigesetzt werden könnten und den Kern zu durchdringen, denn es ist eine kleine und weniger Ladung-Molekül-9. Dichlorofluoresceins Diacetat (RLKV-DA) kann insbesondere intrazelluläre Peroxid emittierenden grünen Fluoreszenz zeigen. In diesem Artikel wird ein detailliertes Protokoll zur Erfassung von H2O2 intrazelluläre Lokalisation in Solea Senegalensis Spermien mit Hilfe der konfokalen Mikroskopie vorgestellt.
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Protocol
Hinweis: Fluorochrom Inkubation und konfokale Analyse dauert mindestens 2-3 h für ein Steuerelement und einer behandelten Probe. Datenverarbeitung ist in dieser Berechnung nicht enthalten. Benötigten Materialien finden Sie in der Tabelle der Materialien. Dieses Protokoll kann auf frische oder kryokonservierten Samenzellen angewendet werden. Solea Senegalensis ist eine Fischart, die in kaltem Wasser, arbeiten immer unter kalten Bedingungen (4-7 ° C) laicht. Siehe Abbildung 1 für einen allgemeinen Überblick über das Protokoll.
1. vorbereitende Arbeiten vor dem Experiment
- Bereiten Sie eine 1 mM, die Mitochondrien Fleck Stammlösung in analysenrein DMSO.
- Bereiten Sie eine 1 μg/mL 4 ', 6-Diamidino-2-Phenylindole Dihydrochloride (DAPI) Stammlösung in entionisiertem Wasser.
- Bereiten Sie eine 200 mOsm/kg-Ringer-Lösung (116 mM NaCl, 2,9 mM KCl, 1,8 mM CaCl2, 5 mM HEPES, pH 7,7)
- Bereiten Sie einen 4 mM 2, 7-Dichlorodihydrofluorescein-Diacetat (RLKV-DA)-Stammlösung in analysenrein Methanol.
Hinweis: Halten Sie die Stammlösungen in Aliquote bei-20 ° C bis benötigt. - Legen Sie die Microcentrifuge bei 4-7 ° C.
2. Probenvorbereitung vor der Fluorochrom Inkubation
Hinweis: Schonende Behandlung von Spermien ist wünschenswert, beim Pipettieren und resuspending.
- Arbeiten mit kryokonservierten Zellen bereiten Sie ein Wasserbad Auftauen bei 40 ° C für Solea Senegalensis Spermien10 vor. Tauchen Sie die Stroh Proben im Wasserbad für 7 s.
- Mit einer Schere um zu schneiden, die Probe in ein Microfuge Gefäß entleeren und 1000 X g, 4-7 ° C für 1 min zentrifugieren.
- Entfernen Sie Seminalplasma oder Seminalplasma mit Kryoprotektanten aus der kryokonservierten Probe durch pipettieren, um jede Komponente zu verwerfen, die die Färbung Protokoll stören könnten.
- Aufschwemmen der Zellen in 50-100 μL von 4 ° C 200 mOsm/kg Ringer-Lösung.
- Bestimmen Sie die Samenzellenkonzentration mit einem Neubauer oder eine ähnliche Zählkammer unter eine stereoskopische Mikroskop.
- Verdünnen Sie die Zellsuspension bis auf 1 bis 2 x 106 Zellen/mL in einem Endvolumen von 0,5 mL bei 4 ° C Ringer-Lösung.
(3) Fluorochrom Inkubation
Hinweis: Bei schlechten Lichtverhältnissen, vor allem in Lösung müssen Fluorochromes behandelt werden.
- Hinzufügen von 3.125 μl der Stammlösung RLKV-DA (endgültige Konzentration in der Probe: 25 μM) zu den Arbeiten Probenverdünnung. 40 min in Dunkelheit10bei 4-7 ° C inkubieren.
- Nach 30 min hinzufügen 0,5 μL der Vorratslösung DAPI (endgültige Konzentration in der Probe: 2 μM) und 0,5 μL der Mitochondrien Stammlösung Fleck (endgültige Konzentration in der Probe: 100 nM) auf die Probe. Inkubieren Sie beide Fluorochromes für 10 Minuten im Dunkeln.
(4) Probenvorbereitung für die konfokale Mikroskopie
- Nach der Inkubationszeit Zentrifugieren der Zellsuspension bei 1000 X g, 4-7 ° C für 1 min.
- Verwerfen Sie den Überstand sorgfältig durch pipettieren.
- Fügen Sie eine 10-20 μl 200 mOsm/kg Ringer-Lösung.
- Platz 5 μl einer konzentrierten Zellsuspension drop auf einer Folie.
- Sorgfältig, legen Sie eine Abdeckung über die Vorbereitung und mit Lack zu versiegeln. Sobald der polnischen trocken ist, ist die Vorbereitung für die konfokale Mikroskopie bereit.
5. konfokale Setup vor dem Experiment
Hinweis: Je nach dem Mikroskop konnte RLKV-DA "verbrennen". Die besten Voraussetzungen mit einer nicht-wertvolle Probe zuerst zu etablieren.
- Schalten Sie das Mikroskop, Laser, Kamera und den Computer unter dem Mikroskop.
- Erregung Laser unter Berücksichtigung der Anregung und Emission Maxima jedes Fluorochrom festgelegt:
- Für DAPI, verwenden eine Erregung bis zu 358 nm und eine Emission maximal 465 nm.
- Für den mitochondrialen Fleck verwenden eines Anregung maximal 644 nm und eine Emission maximal 662 nm.
- Für RLKV-DA, verwenden eine Erregung bis zu 504 nm und eine Emission maximal 525 nm.
- Beginn der Arbeit mit 25 X Objektiv auf die Spermien konzentrieren. Wählen Sie den DAPI-Kanal zu konzentrieren, weil diese Fluorochrom die höchste Intensität meldet. Nachdem die Zellen konzentriert sind, verwenden Sie ein 63 X oder 100 X Objektiv für eine gründliche Bewertung weil Solea Senegalensis Spermien etwa 2 μm beträgt.
- Optimieren Sie für jeden Kanal die Lochkamera, die Verstärkung und die Spannung. Passen Sie auf die gleiche Weise den digital Offset um Hintergrund zu verringern an. Nachdem alle Parameter für die verwendeten Fluorochrom optimiert sind, speichern Sie die Einstellungen. Für eine routinemäßige Experiment für eine einzige Samenzelle Solea Senegalensis wir verwendet die folgenden (diese Parameter können in jedem Experiment ändern): Loch 1 und die Gewinn-Spannung von 750 V.
6. Erwerb von Bildern
- Wählen Sie die gewünschte Qualität-Bedingungen für die Bildaufnahme. Definieren Sie Übernahme Einstellungen wie Bildformat, Bit-Tiefe, leichte Blechdicke zu, und wählen Sie einzelne beidseitige Beleuchtung. Für eine routinemäßige Experiment für einen einzigen Solea Senegalensis Spermien verwendet wir folgende (diese Parameter können in jedem Experiment ändern): Rahmengröße von 1024 px; Bits pro Pixel 16; Scan-Geschwindigkeit von 2-4).
- Öffnen Sie und zentrieren Sie den Scan-Bereich zu beginnen und nehmen ein Bild des Feldes.
- Mit dem Crop-Werkzeug, wählen Sie die Region von Interesse und live.
- Einstellen Sie mit Hilfe des Werkzeugs Range Indikator den digital Offset um den Hintergrund zu verringern. Dies gilt für jeden Kanal und nehmen Sie das Bild.
- Überprüfen Sie die Qualität der einzelnen Kanäle für jede Fluorochrom und deren Kombinationen.
7. erstellen ein 3D Bild Video
- Z-Stapel Erwerb Einstellungen.
- Wählen Sie in der Software Z-Stapel.
- Wählen Sie die einzelne Zelle, einer Gruppe von Zellen oder Interessenbereich und konzentrieren Sie es zu.
- Die Z-Stapel mit den Optionen "Erste Scheibe" und "Letzte Schicht" abzugrenzen und den Z-Schritt zum Intervall bis 0,2 µm mit Hilfe der Feinfokus zu etablieren. Wählen Sie DAPI Kanal konzentrieren, denn diese Fluorochrom möglicherweise die höchste Intensität und Sie können problemlos den ganzen Kopf der Spermien auswählen. Wählen Sie den optimalen Aufnahmeparameter für jeden Kanal und führen Sie das Experiment.
- Führen Sie das Z-Stapel-Experiment. Die Kanäle aufgeteilt und die Lokalisierung von jedes Signal innerhalb der Zellen zu beobachten.
- Z-Stapel-Prozess.
- Volumen-Rendering: Sobald das Experiment beendet ist, wählen Sie die Optionen der Z-Stapel-Verarbeitung-Software und wählen Sie das Volume Option rendern. Wählen Sie die Anzahl der Schritte und den Grad der Drehung (360°). Speichern Sie die Datei mit einem video-Erweiterung.
- Stereo Anaglyph: Stereo Anaglyph in den Optionen wählen Prozessfenster. Dieses Tool ermöglicht es, um ein 3D-Bild mit Kanäle teilen video zu erstellen.
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Representative Results
Konfokale Mikroskopie ist eine ideale Methode zur intrazellulären ROS-Auswertung in teleost Spermien. Die Kombination der drei Fluorochromes (DAPI, Mitochondrien Fleck und RLKV-DA) präsentiert in dieser Studie (Abbildung 1) bietet viele nützliche Informationen, die in der Grundlagenforschung aufgebracht werden kann und kann Anwendungen bei der Verbesserung von Verfahren, die in industrielle Aquakultur Anlagen, z. B. Kryokonservierung Protokolle. Verschiedene Arten von Analysen können durchgeführt werden, um intrazelluläre ROS Präsenz und andere Parameter zu korrelieren: Motilität, Rentabilität, verschiedene Muster zwischen guten und schlechten Züchter, Aktivierung der Motilität oder saisonale Sperma Variationen unter vielen anderen. In der vorliegenden Arbeit werden zwei unterschiedliche Muster der intrazellulären H2O2 Verteilung innerhalb der Spermien angezeigt: genützten mit Mitochondrium oder Verbreitung im Zellkern (Abbildungen 2, 3). Diese Spermien zeigen niedrige mögliche Schäden durch ROS produziert zeigte RLKV-DA Kennzeichnung nur in den Mitochondrien, während die DNA-Schäden leiden zeigte RLKV-DA Kennzeichnung auch in den Kernen. Konfokale Mikroskopie Software ermöglicht nützliche Videos zu erstellen und bieten einfache und schnelle NS1 Graphen.
Abbildung 1 . Allgemeiner Überblick über das Protokoll. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 2 . Beispiel für konfokale Bildaufnahme. A. Schema der Probe B. DAPI-Kanal (Kennzeichnung DsDNA). C. Mitochondrien Fleck Kanal (Kennzeichnung Mitochondrium). D. Mitochondrien Fleck Kanal mit DAPI Kanal zusammengeführt. E. DCFA-DH-Kanal (Kennzeichnung intrazellulären H2O2). F. DCFA-DH Kanal mit DAPI Kanal zusammengeführt. G. Zusammenführung der drei Kanäle. Abkürzungen: n: Kerne, Mt: Mitochondrien, f: Flagellum und mb: Membran. Maßstab: 5 μm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 3 . Verschiedene Muster von intrazellulären H2O2 in Solea Senegalensis Spermien (Volume Rendering). Daraus resultierende Kanäle von Spermien mit intrazellulären ROS in der nuklearen Fossa und Mitochondrium (A, C, E). Daraus resultierende Kanäle von Spermien mit intrazellulären H2O2 auch in den Kernen (B, D, F). A und B: DAPI. C und D: RLKV-DA. E und F: Mitochondrien zu beflecken. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
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Discussion
Es ist bekannt, dass Mitochondrien wichtigen Organellen für die Beweglichkeit der Spermien und Funktion sind. Diese Organellen sind gleichzeitig direkt an ROS-Produktion beteiligt. Interessanterweise sind kontrollierte ROS für richtige Sperma Funktion1benötigt. Positive Beziehungen zwischen Fruchtbarkeit und oxidativen Stress sind Säugetiere11 erwiesen, aber übermäßigen Niveaus beeinflussen Spermien Qualität12. Ein entscheidender Faktor, die entscheidend für eine positive oder negative Auswirkungen könnte ist nicht nur ROS Ebenen, sondern auch ROS intrazelluläre Lokalisation. Einer der die schädlichen Wirkungen von ROS DNA-Schaden9 produziert und daher die nukleare Anwesenheit von ROS könnte ein Indikator für mögliche Schäden im Zellkern während ROS Ebenen in Mitochondrien normal sein könnte. Es ist notwendig, bestehende quantitative Methoden (z.B. Durchflusszytometrie) mit Techniken wie konfokale Mikroskopie zu ergänzen, die Auskunft über ROS intrazelluläre Lokalisation könnte.
Konfokale Mikroskopie ist eine optimale Option, die intrazelluläre Lokalisation von ROS zu visualisieren. Die Verwendung von speziellen Fluorochromes wie live Mitochondrien Fleck und DAPI ermöglicht die Visualisierung der Mitochondrien und Kern bzw. und die Kombination dieser Moleküle mit RLKV-DA können die intrazelluläre Lokalisation von Peroxid.
Die entscheidenden Schritte innerhalb des Protokolls sind Fluorochrom Inkubation und konfokale Setup. Beide Schritte sollten optimiert und sorgfältig durchgeführt, um reproduzierbare und konsistente Ergebnisse zu erhalten. Auf diesen beiden Ebenen je nach dem Seminalplasma verwendet sollte Methodik Modifikationen durchgeführt werden. Fluorochrom Inkubation sollte daher angepasst werden. Temperaturen und Lagerbedingungen deutlich unterscheiden zwischen Spermaproben, und die meisten der Protokolle sind optimiert für Säugetiere.
Hier wird ein Protokoll für teleost Spermaproben, besonders für Solea Senegalensis Spermien beschrieben (Abbildung 1). Erfolgreiche Kennzeichnung der Zellkerne und Mitochondrien sind mit dem beschriebenen Protokoll durchgeführt worden und ROS Präsenz hat zeigen, mit RLKV-DA (Abbildung 2). Die Ergebnisse zeigen, dass Co Lokalisierung von H2O2 in die Zellkerne oder Mitochondrien abhängig von der Spermaprobe (Abbildung 3) gefunden wurden. Wie zuvor erläutert wäre diese Proben mit einem hohen Anteil von Spermien, die hohe Konzentrationen von ROS im Zellkern anzeigen anfällig für DNA-Schäden. Dieses Protokoll hat eine eindeutige Einschränkung, die Anforderung von teuren Geräten (confocal Mikroskop), aber es könnte zukünftige Dienstprogramm bei der Auswahl der Spermaproben mit geringe Präsenz von ROS im Zellkern für Kryokonservierung Zwecke haben.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts preisgeben.
Acknowledgments
Wir danken AQUAGAMETE FA 1205 COST Action. Diese Arbeit wurde von AGL201568330-C2-1-R-Projekt (MINECO/FEDER) finanziell unterstützt. David G. Valcarce wurde finanziert durch die Junta de Castilla y León (EDU1084/2012) und Fondo soziale Europeo. Autoren anerkennen Dr. Ana Riaza und Stolt Sea Farm S.A., Dr. Paulino de Paz, Dr. Ignacio Martínez Montero und José Ramón Guiérrez. Wir danken auch Paula Fernández Colado für Videografie.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2′,7′-Dichlorodihydrofluorescein diacetate (DCFH-DA) | Sigma-Aldrich | D6883 | |
| 4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Sigma-Aldrich | D9542 | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | C1016 | |
| Confocal Microscopy | Zeiss | LSM800 | |
| Cover slips | Thermo Fisher Scientific | 12-541B | |
| DMSO, Analytical Grade | Sigma-Aldrich | W387520 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P9541 | |
| Methanol, Analytical Grade | Sigma-Aldrich | 34860 | |
| MitoTrackerDeep Red | Thermo Fisher Scientific | M22426 | |
| Microcentrifuge (refrigerated) | Thermo Fisher Scientific | 75002441 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| Neubauerchamber | Sigma-Aldrich | BR717810 | |
| Slides | Thermo Fisher Scientific | 10143562BEF |
References
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