Summary
このプロトコルは、やっぱりアオモンイトトンボ精子核の ROS は、ミトコンドリアのライブ ミトコンドリア染色 DAPI の敏感な螢光色素 DCFH-DA を使用して内 H2O2の局在を検出するための詳細な方法についてを記述します。可視化、それぞれ。プロトコルは、新鮮なまたは解凍精子と 2 h 内で実行する設計されています。
Abstract
酸化ストレスは、精子の質を減少させる重要な要因の 1 つです。どんな種の重要度が高いは、精子の活性酸素種 (ROS) を検出するための効率的なプロトコルの開発が、これらのメソッドは、使用頻度の低いと硬骨魚も少ない。凍結保存は遺伝子銀行を含め、さまざまな目的のため養殖の便利なテクニックを年間を通じて精子可用性を保証します。凍結/融解手順や原因になる活性酸素産生精子細胞に損傷を与えます。考えると、将来の損害が活性酸素産生の過剰の原因、ローカリゼーション、ここによって精子の H2O2を検出し、共焦点顕微鏡による細胞内局在化を評価する詳細な方法について提供しています。この目的のため 3 螢 (2 ', 7 ' Dichlorodihydrofluorescein セルロースジ アセテート (DCFH DA)、ライブ ミトコンドリア染色と 4 ', 6-Diamidino-2-phenylindole 二塩酸塩 (DAPI)) の組み合わせは、2 H2O の共局在の評価に使用されます。精子核やミトコンドリアソレア senegalesis精子サンプル。
Introduction
活性酸素種の生産は、精子の質とリンクされている最近1。ミトコンドリアの活性酸素産生には、通常の生理学的なプロセスを考えることができる、さまざまなレベルで精子の損傷の明確な原因は活性酸素産生の過剰による酸化ストレス。人間、酸化ストレスは、男性不妊症、運動性や受精2を受けるための能力を変更することに関連付けられています。哺乳類で、凍結精子サンプルの DNA の完全性の変化は H2O23の合成にも関連しています。
凍結保存は養殖で銀行の遺伝子のための一般的な手法です。この技術はやっぱりアオモンイトトンボなど生殖器の問題を持つ種で特に重要です。市場でこの貴重な種は、求愛の不足のため飼育下で生まれた個体の生殖機能障害を示しています。この事実は、精子の凍結保存を人工受精精子の可用性を持っている必要になります。しかし、凍結は、酸化ストレスと抗酸化サプリメントの有益な効果が報告されての精子4有害なことができるのソース可能性があります。ミトコンドリアをターゲットとした抗酸化作用による活性酸素抑制は黄色いナマズ5精子凍結保存用伝え有益であった。
したがって、精子サンプル中の ROS のレベルは、これらの分子は、精子の生存と不妊治療8の欠点として認識されているので、特に凍結6、7の後知ることが重要。さらに、細胞内 ROS の分布を調査、潜在的な損傷のレベルを推測する重要な可能性があります。例として通常、精子機能と互換性のある、ミトコンドリアにおける活性酸素の低レベルを想定できるが、核内活性酸素の高レベルは、精子の DNA 損傷の指標かもしれない。H2O2は、ミトコンドリアから解放されることができる、小さなおよび電荷レス分子9だから核を浸透最も関連性の高い活性酸素の 1 つです。ジクロルフルオレッセン ジアセテート (DCFH DA) 具体的には緑色の蛍光を発光細胞内の過酸化水素を明らかにできます。この記事は、やっぱりアオモンイトトンボ精子共焦点顕微鏡を用いた H2O2細胞内の局在を検出するための詳しいプロトコルが表示されます。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
注: 螢光色素インキュベーションと共焦点解析コントロールと扱われたサンプルの少なくとも 2-3 時間になります。データ処理は、この時間の計算には含まれません。必要な材料は、材料テーブルで見つけることができます。このプロトコルは、新鮮なまたは凍結精子に適用できます。やっぱりアオモンイトトンボ冷たい水、冷たい条件 (4 〜 7 ° C) の下で常に仕事で産卵する魚の種であります。プロトコルの一般的なビューは、図 1を参照してください。
1 実験前に準備作業
- ミトコンドリア染色 1 mM 原液分析学年 DMSO を準備します。
- 1 μ g/mL 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole 二塩酸塩 (DAPI) 脱イオン水で原液を準備します。
- 200 mOsm/kg リンゲル液 (116 mM NaCl、KCl、2.9 mM 1.8 mM CaCl2, 5 mM HEPES、pH 7.7) の準備します。
- 4 mM 2 ', 7 ' dichlorodihydrofluorescein ジアセテート (DCFH DA) 分析グレードのメタノールで原液を準備します。
注: は、-20 ° c まで必要な因数でストックのソリューションを維持します。 - 4-7 ° C で、遠心を設定します。
2. 螢光色素の孵化前にサンプル準備
注: ピペッティングと再、精子の穏やかな処理が望ましいです。
- 凍結保存した細胞を扱う場合水のお風呂が、やっぱりアオモンイトトンボ精子1040 ° C で融解することを備えることができます。7 槽のわらのサンプルを浸す s。
- カットするはさみを使用して、および microfuge の管にサンプルを空にして 4-7 ° C、1 分 1000 x g で遠心分離機します。
- 汚損のプロトコルを妨げることができる任意のコンポーネントを破棄する分注して凍結サンプルから精液または凍結と精漿を削除します。
- 50-100 μ L の 4 ° C 200 mOsm/kg リンガー液で細胞を再懸濁します。
- ノイバウアーや実体顕微鏡下で似たようなカウントの商工会議所と精子の濃度を決定します。
- 1 - 2 106セル/mL 4 ° C リンガー液 0.5 mL の最終巻で x を細胞懸濁液を希釈します。
3. 螢光色素インキュベーション
注: 螢は、低光の条件、特に溶液中で処理しなければなりません。
- DCFH DA 原液の 3.125 μ L を追加 (サンプルの最終濃度: 25 μ M) 作業サンプル希釈します。4-7 ° C で闇10で 40 分間インキュベートします。
- 30 分後の DAPI 原液 0.5 μ L を追加 (最終濃度サンプル: 2 μ M) とミトコンドリア染色原液 0.5 μ (サンプルの最終濃度: 100 nM) のサンプルに。暗闇の中で 10 分間両方の螢を孵化させなさい。
4. 共焦点の顕微鏡検査のための試料
- 培養時間後 1000 x g、1 分の 4-7 ° C の細胞懸濁液を遠心します。
- ピペットで上澄みを慎重に廃棄します。
- 200 mOsm/kg リンガー液の 10-20 μ L を追加します。
- 濃縮細胞懸濁液の場所 5 μ L は、スライドにドロップします。
- 慎重に、スライドを準備上のカバーを置く、ポーランド語でそれを封印します。ポーランドが乾燥して準備は共焦点の顕微鏡検査のための準備です。
5 実験前共焦点のセットアップ
注: 顕微鏡によって DCFH DA が「焼かれる」。まず非貴重なサンプルに最適な条件を確立します。
- 顕微鏡、レーザー、カメラ、顕微鏡を実行しているコンピューターをオンにします。
- 各螢光色素の励起と放射の最大値を考慮して励起レーザーを設定します。
- DAPI、用励振最大 358 nm、排出量最大 465 nm。
- ミトコンドリア染色用励振最大 644 nm、排出量最大 662 nm。
- DCFH-DA を使用して励起最大 504 nm、排出量最大 525 nm。
- 精子に集中する 25 X 目的と作業を開始します。この螢光色素は、最高の強度を報告するために焦点を DAPI チャネルを選択します。セルを集中している、かつて用 63 X または 100 × 対物徹底的な評価ソレア アオモンイトトンボ精子サイズが約 2 μ m なので。
- 各チャネルのピンホール、利得と電圧を最適化します。同じように、背景を減らすためにデジタル オフセットを調整します。すべてのパラメーターは、使用される螢光色素に最適な一度設定を保存します。単一のルーチン試験のソレア アオモンイトトンボ精子細胞を用いて (これらのパラメーターは、各実験で変化があります) 次: 1 の利得電圧 750 V のピンホール。
6. 画像の取得
- 画像獲得の目的の品質条件を選択します。ビット深度、イメージ形式、光シート厚さのような取得設定を定義し、単一の両面照明を選択します。単一のルーチン試験のソレア アオモンイトトンボ精子使用 (これらのパラメーターは、各実験で変化があります) 次: フレーム; 1024 px のサイズビット/ピクセル 16;スキャン速度が 2-4)。
- 開き、開始フィールドの画像を撮影してスキャン領域を中央にします。
- トリミング ツールを使用すると、関心領域を選択し、押しますライブ。
- 範囲インジケーター ツールの助けを借りて、背景を減らすためにデジタル オフセットを調整します。チャンネルごとにこれを行うし、イメージを取る。
- 各チャンネルごとの螢光と、その組み合わせの品質を確認します。
7. 3 D イメージ ビデオを作成します。
- Z スタック取得設定。
- ソフトウェアで Z スタック オプションを選択します。
- 単一のセル、セルのグループまたは関心領域を選択し、フォーカスをします。
- Z スタック '最初スライス' と '最後のスライス' オプションを区切るし、良い焦点の助けを借りて、0.2 μ m 間隔に z ステップを確立します。最高の強度を報告ことがありますこの螢光色素と精子の頭全体を簡単に選択できるため、集中する DAPI チャネルを選択します。各チャンネルに最適なアクイジション ・ パラメーターを選択し、実験を実行します。
- Z スタック実験を実行します。チャンネルを分割し、各シグナルの細胞内の局在を観察します。
- Z スタック プロセス。
- ボリューム レンダリング: 実験が終わったら、Z スタック処理ソフトウェアのオプションを選択し、ボリュームのレンダリング オプションを選択します。ステップと回転度 (360 °) の数を選択します。動画の拡張子を持つファイルを保存します。
- ステレオ: オプションでステレオを選択プロセス ウィンドウ。このツールは、チャンネルの分割とビデオの 3 D 画像を作成することができます。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
共焦点顕微鏡は、魚類の精子細胞内 ROS の評価のための理想的な方法です。(図 1) 本論文で示した 3 つの螢 (DAPI、ミトコンドリア染色、DCFH DA) の組み合わせは、基礎研究に適用することができますし、改善で使用されるプロシージャにアプリケーションを持つことができます多くの有用な情報を提供します凍結プロトコルなどの産業水産植物細胞内 ROS の存在とその他のパラメーターを関連付けるために実施される各種の解析: 運動性、生存率、良いと悪いブリーダーの活性化運動や他の多くの間で季節精子バリエーションのさまざまなパターン。現在の仕事で精子内細胞内の H2O2配布の 2 つの異なるパターンが表示されます: ミトコンドリアや核 (図 2 3) の普及と併置されています。ROS による低潜在的な損傷を示すこれらの精子は、DNA 損傷に苦しむそれらは示した DCFH DA は核のラベルもミトコンドリアでのみ DCFH DA のラベルを示した。共焦点顕微鏡のソフトウェアは役に立つ動画を作成し、簡単かつ高速の共存のグラフを提供することができます。
図 1.プロトコルの概要。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2.共焦点画像の例です。A.試料B法DAPI チャネル (dsDNA のラベル)。C.ミトコンドリア染色 (ミトコンドリア ラベリング) チャネル。+ミトコンドリア染色 DAPI チャネルと結合チャネルです。E. DCFA DH チャンネル (細胞内の H2O2のラベル)。F. DCFA DH チャンネルは DAPI チャンネルと合併。G.は、3 つのチャンネルのマージします。略語: n: 核、 mt: ミトコンドリア、 f: 鞭毛とmb: 膜。スケール バー: 5 μ m。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 3.さまざまなパターンの細胞内の H2O2 でやっぱりアオモンイトトンボ精子 (ボリューム レンダリング).精子核窩とミトコンドリア (A, C, E) の細胞内 ROS を示す結果チャンネル。(B, D, F) 核内の細胞内の H2O2を示す精子の結果チャネル。AおよびB: DAPI。CとD: DCFH の DAEおよびF: ミトコンドリア染色します。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
精子の運動性と機能キー細胞小器官であるミトコンドリアが知られています。これらの細胞小器官は、同時に直接活性酸素産生に関与しています。興味深いことに、適切な精子機能1活性酸素の制御のレベルが必要です。肯定的な哺乳類11不妊と酸化ストレスとの関係が示されているが、過剰なレベルに影響を与える精子品質12。正または負の効果に決定的なことができる 1 つの重要な要因は、ROS レベルだけでなく、活性酸素の細胞内局在性です。活性酸素の有害な影響の 1 つは DNA 損傷9を生産したがって ROS レベルがミトコンドリアの正常であるに対し ROS の核の存在核潜在的な損傷の指標となる可能性があります。共焦点顕微鏡 ROS の細胞内局在性に関する情報を提供できるような技術と既存の定量法 (例えば, フローサイトメトリー) を補完する必要があります。
共焦点顕微鏡は、活性酸素の細胞内の局在化を視覚化する最適なオプションです。ライブ ミトコンドリア染色 DAPI など特定の螢の使用によりミトコンドリアと核の可視化、それぞれ、DCFH DA とこれらの分子の組み合わせにより過酸化の細胞内局在。
プロトコルの中で重要なステップは、螢光色素インキュベーションと共焦点のセットアップです。両方の手順を実行する必要があります最適化して再現性と一貫性のある結果を得るため慎重に行います。精液の使用によってこれらの 2 つのレベルでの方法論の変更を行わなければなりません。したがって、螢光色素インキュベーションは、適応する必要があります。精子サンプル間に有意差の温度と貯蔵条件およびプロトコルのほとんどは、哺乳類に最適します。
魚類精子のサンプル、ソレア アオモンイトトンボ精子のために特にのためのプロトコルの説明ここでは、(図 1)。核とミトコンドリアの成功したラベルは説明したプロトコルを使用して実行されているし、DCFH DA (図 2) を使用してロスの存在を明らかにされています。結果を示すことの共局在の H2O2は、核やミトコンドリアによって精子のサンプル (図 3) で発見されています。以前に説明したよう核内活性酸素の高レベルを表示する精子の割合が高いとこれらのサンプルは、DNA 損傷になりやすいでしょう。このプロトコルはユニークな制限、高価な機器 (共焦点顕微鏡) の要件が、凍結保存の目的のための核内 ROS の低い存在と精子サンプルの選択で今後のユーティリティを持つことが。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
著者が明らかに何もありません。
Acknowledgments
AQUAGAMETE FA 1205 コスト行動に感謝いたします。この作品は AGL201568330 C2 1 R プロジェクト (MINECO/フェダー) によって財政上支えられます。デイヴィッド g. Valcarce 資金が供給された軍事政権・ デ ・ カスティーリャ ・ イ ・ レオン (EDU1084/2012 年) とフォンド社会 Europeo。著者は、博士アナ リアサ Stolt 海ファーム社、博士パウリノ ・ デ ・ ラパス、博士・ イグナシオ ・ マルティネス モンテロとホセ ・ ラモン ・ Guiérrez を認めます。我々 はビデオ撮影にポーラ フェルナンデス Colado をありがとうも。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2′,7′-Dichlorodihydrofluorescein diacetate (DCFH-DA) | Sigma-Aldrich | D6883 | |
| 4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Sigma-Aldrich | D9542 | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | C1016 | |
| Confocal Microscopy | Zeiss | LSM800 | |
| Cover slips | Thermo Fisher Scientific | 12-541B | |
| DMSO, Analytical Grade | Sigma-Aldrich | W387520 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P9541 | |
| Methanol, Analytical Grade | Sigma-Aldrich | 34860 | |
| MitoTrackerDeep Red | Thermo Fisher Scientific | M22426 | |
| Microcentrifuge (refrigerated) | Thermo Fisher Scientific | 75002441 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| Neubauerchamber | Sigma-Aldrich | BR717810 | |
| Slides | Thermo Fisher Scientific | 10143562BEF |
References
- Amaral, S., et al. Mitochondrial functionality and chemical compound action on sperm function. Curr Med Chem. , (2016).
- Morielli, T., O'Flaherty, C. Oxidative stress impairs function and increases redox protein modifications in human spermatozoa. Reproduction. 149 (1), 113-123 (2015).
- Gürler, H., et al. Effects of cryopreservation on sperm viability, synthesis of reactive oxygen species, and DNA damage of bovine sperm. Theriogenology. , (2016).
- Zhu, Z., et al. Vitamin E Analogue Improves Rabbit Sperm Quality during the Process of Cryopreservation through Its Antioxidative Action. PLoS One. 10 (12), e0145383 (2015).
- Fang, L., et al. Inhibition of ROS production through mitochondria-targeted antioxidant and mitochondrial uncoupling increases post-thaw sperm viability in yellow catfish. Cryobiology. 69 (3), (2014).
- Thomson, L. K., Fleming, S. D., Aitken, R. J., De Iuliis, G. N., Zieschang, J. A., Clark, A. M. Cryopreservation-induced human sperm DNA damage is predominantly mediated by oxidative stress rather than apoptosis. Hum Reprod. 24 (9), 2061-2070 (2009).
- Kim, S. H., Yu, D. H., Kim, Y. J. Effects of cryopreservation on phosphatidylserine translocation, intracellular hydrogen peroxide, and DNA integrity in canine sperm. Theriogenology. 73 (3), (2010).
- Guthrie, H. D., Welch, G. R. Effects of reactive oxygen species on sperm function. Theriogenology. 78 (8), 1700-1708 (2012).
- Aitken, R. J., Jones, K. T., Robertson, S. A. Reactive oxygen species and sperm function--in sickness and in health. J Androl. 33 (6), (2012).
- Valcarce, D. G., Robles, V. Effect of captivity and cryopreservation on ROS production in Solea senegalensis spermatozoa. Reproduction. 152 (5), (2016).
- Gibb, Z., Lambourne, S. R., Aitken, R. J. The paradoxical relationship between stallion fertility and oxidative stress. Biol Reprod. 91 (3), (2014).
- Cabrita, E., et al. Factors enhancing fish sperm quality and emerging tools for sperm analysis. Aquaculture. 432, 389-401 (2014).
