Summary
Aqui apresenta-se um protocolo passo-a-passo do método (LERLIC-MS / MS) de longa duração electrostática espectrometria de massa repulsão-hidrofílico interacção cromatografia em tandem. Esta é uma nova metodologia que permite pela primeira vez a quantificação e caracterização dos glutamina e asparagina isoformas de desamidação por proteómica espingarda.
Abstract
Caracterização de desamidação proteína é imperativo para decifrar o papel (s) e as potencialidades desta modificação pós-tradução da proteína (PTM) em patologia humana e outros contextos bioquímicos. A fim de realizar uma caracterização da desamidação proteína, nós desenvolvemos recentemente um longo comprimento electrostática interacção espectrometria de cromatografia em tandem romance repulsão-hidrofílico massa (LERLIC-MS / MS) que pode separar a glutamina (Gln) e asparagina isoforma (Asn) produtos de desamidao de compostos modelo para amostras biológicas altamente complexas. LERLIC-MS / MS é, portanto, a primeira estratégia de proteómica espingarda para a separação e quantificação de isoformas de desamidação Gln. Nós também demonstram, como uma novidade, que o protocolo de processamento da amostra descrito aqui estabiliza o intermediário succinimida permitindo a sua caracterização por LERLIC-MS / MS. Aplicação de LERLIC-MS / MS como mostrado neste artigo de vídeo pode ajudar a elucidar a actualmente desconhecidamatrizes n moleculares de desamidação proteína. Além disso, LERLIC-MS / MS fornece uma maior compreensão das reacções enzimáticas que envolvem desamidação em contextos biológicos distintos.
Introduction
A desamidação é uma modificação pós-tradução da proteína (PTM), que introduz uma carga negativa para o esqueleto da proteína através da modificação de asparagina (Asn) e / ou resíduos de glutamina (Gln) 1. Esta modificação, enquanto que afectam os resíduos Asn gera a produtos isoméricos ácido isoaspartic (isoAsp) e n ácido aspártico (Asp) a um comum proporção de 3: 1 2. Não obstante, esta proporção pode ser alterada pela intervenção da enzima de reparação de L-isoaspartyl metiltransferase (PIMT) 3, 4. Da mesma forma, a desamidação de resíduos Gln gera o ácido isomérica gama-glutâmico (γ-Glu) e isoformas de ácido alfa-glutâmico (α-Glu) a uma esperada razão de 1: 7 3, 5, mas esta proporção pode ser deslocado por acção de a transglutaminase ubíqua enzima 2 e outras transglutaminases, incluindo uma transglutaminase, uma mensagemnzyme recentemente identificada como associada com vesículas extracelulares no cérebro 6.
A origem de desamidação pode ser espontânea ou enzimática, o primeiro é especialmente comum em resíduos de Gln em que as transglutaminases e outras enzimas medeiam reticulação / intra-molecular entre através de transamidação (ver 3 para mais detalhes sobre Gln transamidação e suas implicações em várias crónica e doenças humanas fatais). Portanto, desamidação é um PTM que tem uma repercussão crucial sobre a estrutura e função das moléculas afectadas 4, 7, 8 e requer uma caracterização química em profundidade 3 em função das suas diversas consequências bioquímicas incluindo o seu serviço de relógio como molecular de envelhecimento 9 .
Embora desamidação de resíduos Asn tem sido relativamente bem caracterizados por proteómica espingarda de baixo para cima 1, 10, desamidação de resíduos Gln ainda não tem um método de caracterização adequada para além da análise de um desafio por compostos modelo à base de electrões fragmentação radical 11. Nós desenvolvemos recentemente um novo uma dimensão proteómica espingarda estratégia (LERLIC-MS / MS) 3 que permite a separação de Gln e Asn isoformas de desamidação em amostras biológicas complexas e compostos modelo em uma única análise. LERLIC-MS / MS baseia-se na separação de péptidos trípticos digerido usando um longo comprimento (50 cm) de coluna de permuta iónica (LAX) que trabalha no modo de cromatografia de interacção electrostática repulsão-hidrofílico (ERLIC) e acoplada a espectrometria de massa em tandem (LC- MS / MS). Esta nova estratégia de análise foi usado para caracterizar e quantificar relativamente a extensão de cada resíduo desamidada nos tecidos cerebrais humanosf "> 3. No entanto, o protocolo delineado aqui vai fornecer imagens de vídeo de LERLIC-MS / MS visa estudar as peculiaridades de desamidação proteína no contexto bioquímica de interesse.
DECLARAÇÃO DE ÉTICA
Todos os procedimentos deste protocolo ter sido aprovado pelo conselho de revisão institucional da Universidade Tecnológica de Nanyang, em Cingapura e foram realizados de acordo com as diretrizes institucionais.
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Protocol
1. Embalagem O ani-intercâmbio de longa-metragem Coluna (LAX) Capilar
(Nota: Embora a coluna LAX pode estar em casa-embalados como descrevemos neste protocolo, LAX colunas estão também disponíveis comercialmente, ver Tabela de Materiais e Reagentes para mais detalhes).
- Suspender 50 mg de material de embalagem de permuta aniónica fraca em 3,5 mL de tampão de embalagem (Tabela 1) para preparar a suspensão.
- Montar a extremidade da coluna capilar (50 cm de comprimento - 200 um de diâmetro interno (ID) tubo) utilizando uma fêmea-para-encaixe fêmea, um ferule e uma porca fêmea. Coloque um ecrã de 1/16" OD de 1 micron de tamanho de poros no interior do encaixe fêmea-para-feminino (Nota:. O ecrã utilizado aqui deve ter tamanho de poro mais pequeno do que o tamanho de partícula do material de embalagem para evitar a fuga do material a partir da coluna).
- Embalar o capilar com a pasta, usando uma bomba de pressão operado a 4500 psi. (Nota: Embale o column até que o material de embalagem é visível na entrada da coluna).
- Montar a outra extremidade da coluna capilar como descrito no ponto 1.2.
Preparação 2. Amostra
Este protocolo descreve a aplicação de LERLIC-MS / MS para analisar tecidos cerebrais humanos como modelo proteoma. (Nota: Em caso de utilizar outros tecidos ou amostras proteomic, os procedimentos de preparação da amostra deve ser adaptado.)
- homogeneização do tecido:
uma. tecidos cerebrais de lavagem (50 a 100 mg) com solução de tampão fosfato de 1x, durante cinco minutos, três vezes.
b. Homogeneizar o tecido em 1: 1: 2,5 tecido / esferas metálicas / tampão de homogeneização SDC (Tabela 2) proporção (w / w / v) durante 5 min a 4 ° C em tubos de cofre-bloqueio com a máxima intensidade utilizando um homogeneizador de tecidos. (Nota: tampão de homogeneização SDC podem incluir inibidores de protease como anteriormente indicado em 3)
c. Centrifugar o homogenado de tecido, obtida from o passo anterior, a 10000 x g, 4 ° C durante 10 minutos e recolher o sobrenadante para um novo tubo de 1,5 mL.
d. Repetir os passos bc para os peletes remanescentes e combinar os sobrenadantes tantas vezes quanto necessário, até que nenhum sedimento é observada. (Nota: Se você tem de repetir os passos bc mais de duas vezes, mover a amostra e as contas para um novo tubo de seguro-lock para evitar a perda de amostra durante a etapa de centrifugação).
e. Quantificar a concentração de proteína dos homogenatos obtidos por ensaio de ácido bicinconínico (BCA) 12. - O desoxicolato de sódio (SDC) -assisted em solução de digestão tríptica 13 de homogeneizados de cérebro.
uma. Adicionar uma concentração final de ditiotreitol 10 mM (DTT) (utilizando a solução estoque indicado em Solução 5 da Tabela 3) para o homogenato obtido para iniciar a redução de ligações dissulfureto proteína.
b. Incubar o homogeneizado durante 30 minutos num banhopré-programada para 60 ° C.
c. Adicionar ao homogenato numa concentrao final de iodoacetamida 20 mM (IAA), utilizando a solução estoque indicado em Solução 7 da Tabela 4.
d. Incubar o homogeneizado contendo IAA à temperatura ambiente no escuro durante 45 min.
e. Dilui-se a homogenato de cérebro de dois-se dobra usando tampão de diluição (solução a 6 da Tabela 3).
f. Incubar a amostra por um segundo passo de redução durante 30 min a 37 ° C.
g. Adicionar tripsina de grau de sequenciação modificado dissolvido em Solução 2 da Tabela 2 a 1:50 proporção entre proteína e para a enzima (w / w).
h. Digerir o homogeneizado com tripsina por incubação durante a noite a 30 ° C.
Eu. Extingue-se a digestão enzimática no dia seguinte por adição de 0,5% de concentração final de ácido fórmico (FA). (Nota: A adição de FA irá provocar a precipitação dos sais SDC em condições ácidas).
j. Suavemente vortex as amostras contendo SDC precipitates.
k. Sedimentar para baixo os sais SDC por centrifugação das amostras a 12000 x g, 4 ° C durante 10 min.
eu. Recolhe-se o sobrenadante e transferir o líquido para um novo tubo limpo. (Nota: Tome cuidado durante a pipetagem desta etapa para não re-suspender e / ou recolher sais do sedimento SDC).
m. Re-dissolver o sedimento em SDC SDC tampão dissolvendo re-(Tabela 5) sob agitação em vórtice vigorosa durante 1 min.
n. Repita os passos jl duas vezes para recuperar peptídeos precipitados e combinam-se os sobrenadantes. (Nota:. Ver Serra et al 2016 13 para mais detalhes sobre o SDC-assistida em solução protocolo digestão tríptica adaptado aqui.) - A dessalinização de triptico digerido amostras.
uma. Realizar a dessalinização de amostras digeridas utilizando um cartucho de 1 g de C-18. (Nota: O uso de um cartucho de grande volume (5 mL), independentemente da quantidade de proteína obtida garantias de limpeza adequada dos restantes sais SDC nas amostras antesa injecção de LC-MS / MS).
b. Realizar o condicionamento do cartucho C-18, 1 g com 5 mL de acetonitrilo (ACN).
c. Passa 5 mL de tampão de limpeza (Tabela 6) por 1g do cartucho C-18 de ar para remover qualquer solvente orgânico remanescente.
d. Carregar a amostra para o cartucho de 1 g de C-18.
e. Realizar 3 - 5 etapas de limpeza para a amostra na coluna 1 g C-18 utilizando 5 mL de solução tampão de limpeza a cada passo.
f. Eluir os péptidos dessalinizada a partir de 1 g a C-18 do cartucho, utilizando 5 mL de tampão de eluição (Quadro 7).
g. Secam-se os péptidos eluidos em um concentrador de vácuo.
c. Reconstituir a amostra seca em um volume final de 200 uL de tampão de eluição. (Nota:. Uso vigorosa e longa (> 10 min), seguido por agitação em vórtex ultra-sons subsequente num banho de ultra-sons durante 30 minutos para re-suspender completamente os péptidos secos em tampão de injecção)
d. Ajustar o volume de injecção da amostra para LERLIC-MS / MS para analisar entre 1 e 3 ug de proteína.
3. Uma dimensão LERLIC-MS / MS Separação
- condições de cromatografia líquida:
fases móveis:
A: FA a 0,1% em água (Tabela 8).
B: 0,1% de FA em ACN (Tabela 9)
Caudal: 0,4 mL / min
Coluna: coluna capilar LAX (50 cm de comprimento - 200 um ID)
uma. Utilizar o seguinte 1,200 min de gradiente: 95% de B durante 40 min, 95-85% de B durante 434 min, 85-70% de B durante 522 min, 70-35% de B durante 124 min, 35-3% de B durante 45 min , isocrática a 3% de B durante 5 min, 3-95% de B ao longo de 7 min e mantido isocrática a 95% de B durante 23 min.
b. Realizar a separação de péptidos que utilizam o capilar LAX como indicado em Serra & Gallart-Palau et al. 3, utilizando ultra-alta pressão de cromatografia líquida. - configuração do espectrômetro de massa:
uma. Configurar os detalhes do evento de digitalização para executar aquisição de dados alternada between Fourier completo transformar-espectrometria de massa (FT-MS) e espectrometria de massa em tandem transformar-Fourier (FT-MS / MS) com os seguintes parâmetros:
a.1. modo de aquisição de dados: positiva
a.2 parâmetros FT-MS:
Intervalo de massa: 350 - 2000 m / z
Resolução: 60.000
Microscans: 1 por espectro
Controle automático de ganho: 1 × 10 6
a.3 parâmetros FT-MS / MS:
modo de fragmentação: de alta energia de dissociação colisão (HCD)
Intervalo de massa a.4: 150 - 2000 m / z
a.5 Resolução: 30.000
a.6 iões topo N: 10
Microscans: 1 por espectro
Cobrança Estado:> 2+
largura isolamento: 2 Da
A.7 controle de ganho automático: 1 × 10 6
b. Realizar a detecção de espectrometria de massa dos péptidos, tal como indicado em 3 utilizando um espectrómetro de massa Orbitrap equipado com uma fonte de iões de nanoelectrospray trabalhando a 1,5 kV.
Análise 4. Dados
- Execute proteem busca de base de dados para o LERLIC-MS / MS de dados usando os seguintes parâmetros utilizando um software de proteómica específico obtido: (Nota: Ver 3 para mais detalhes).
uma. tolerância de iões: 10 ppm
b. tolerância iões fragmento: 0,05 Da
c. Taxa de falso Discovery (FDR): 1%
d. Base de dados: banco de dados Humano UniProt
e. modificações fixos: Carbamydomethylation em Cys
f. modificações variáveis (se exigido pelo software): oxidação (Met), Desamidação (Asn e Gln). - Caracterização confiante e quantificação de produtos desamidados isoméricas em dados LERLIC-MS / MS:
uma. Exportação de resultados de pesquisa de banco de dados de LERLIC-MS / MS para um software spreedsheet para análise.
b. Encontrar e extrair toda a lista de péptidos desamidados e os seus homólogos não desamidados.
c. Utilizando a lista dos péptidos obtidos como referência, extrair os cromatogramas iónicos (XICS) destes péptidos utilizando um software apropriado a 5 ppm de tolerância massa. (Nota:Veja 3 para mais detalhes sobre o software usado para a extração de XICS.)
d. Inspeccione visualmente os XICS obtidos para identificar a separados eluição dupla pico dos produtos isoméricos como indicado 3. (Nota: produtos isoméricos destes péptidos identificados a nível MS / MS pode ser facilmente encontrado orientada pela presença de dois tempos de retenção diferentes no resultado da pesquisa do banco de dados.)
e. A quantificação relativa dos produtos isoméricos de cada local desamidada / péptido tem que ser executada com base na área do pico de cada isómero identificados nas XICS obtidos.
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Representative Results
A desamidação de resíduos Gln e Asn é considerada uma modificação da proteína degenerativa (DPM) implicados em várias doenças crónicas e fatais 14. Tem sido demonstrado que esta PTM pode prever a meia-vida e degradativas estados de anticorpos e outras moléculas no corpo humano e origens biológicas semelhantes 1, 15. O significado de desamidação proteína, na verdade, ultrapassa o contexto biomédico, portanto, esta alteração está presente em diversas proteomas 16, 17 e alguns estudos demonstraram o potencial de desamidação no momento para executar datação precisa de pinturas e arqueológica permanece 18, 19 . Embora significado e funcionalidade de desamidação proteína em diversas origens têm sido afirmada por muito tempo, ore foi até muito recentemente a falta de avanço técnico no caminho para alcançar uma caracterização detalhada deste PTM 3.
Aplicação de LERLIC-MS / MS 3, como representado na Figura 1, fornece pela primeira vez e em uma separação única execução resolvido de Gln e Asn desamidados isoformas de proteomas ou modelo complexos compostos, mesmo para aqueles péptidos que mostram duas independente Asn e Gln desamidados proteoforms.
Figura 1: Diagrama de LERLIC-MS / MS de fluxo de trabalho para a separação e quantificação de Gln e Asp desamidação os produtos de amostras complexas por Shotgun Proteomics. LERLIC-MS / MS envolve a extracção da proteína e a digestão enzimática antes da separação de uma dimensão de péptidos por LC-MS / MS utilizando uma coluna capilar LAX. Analise de XICS permitir a identificação de produtos isoméricos de desamidação eluiram a diferentes tempos de retenção com base na sua diferente acidez 3, 20, 21. MS / MS permite a discriminação entre péptidos desamidados e não desamidada e identificação confiantes do resíduo desamidada. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Resíduos Gln intermédios enzimaticamente modificados de transamidação que indicam uma relação invertido γ / α-glutamil (Figura 2) pode ser descoberta e caracterizada por LERLIC-MS / MS, o que pode ter implicações importantes no estudo de proteinopathy em doenças neurodegenerativas, 3, 22, 23 , 24. Além disso, como relatado anteriormente em Serra & Gallart-Palau 2016, várias proteínas de substrato PIMT desconhecido apresentando um rácio isoAsp / Asp invertido em resíduos Asn desamidados podem também ser identificados em tecidos humanos por LERLIC-MS / MS 3.
Figura 2: Inspeção de XICS e identificação de Duplo Tempos de Retenção na MS / MS Nível para os péptidos desamidados Permitir Caracterização de Gln e Asn Deamidated isômeros e Identificação de Produtos das reacções enzimáticas cruciais que ocorrem em Desamidação. uma. Detalhe da XIC mostrando os dois picos correspondentes aos isómeros γ / α-glutamilo do péptido FQMPDQGMTSADDFFEQ # GTK a partir da proteína do cérebro DPYL2 dihydropyrimidinase A proteína relacionada com 2. O invertido γ / α-glutamil proporção detected em que o péptido indica a implicação potencial da espécie γ contendo-glutamil na reacção transglutamination como uma transglutaminase γ-glutamil intermediário. O resíduo desamidada foi verificada por MS / MS em ambos os tempos de retenção, b. a 389,1 min correspondente ao péptido e c α-contendo-glutamil. a 401,4 min correspondente ao péptido γ contendo-glutamil. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Como novidade deste trabalho, verificou-se que LERLIC-MS / MS permite a caracterização da succinimida intermédia (Figura 3). O uso de pH ácido suave durante o processamento de amostras estabiliza a succinimida intermediário em modificado resíduos Asn 25. Portanto, LERLIC-MS / MS permite estudo de todo o proteoma do succinimide intermediário, uma modificação lábil e mal compreendidos com implicações fisiológicas e patológicas significativas 26.
Figura 3: Identificação da Succinimida Intermediário em resíduos Asn por LERLIC-MS / MS. uma. Espectro do péptido Asn desamidados YASICQQN # GIVPIVEPEILPDGDHDLKR a partir da proteína do cérebro ALDO C frutose-bisfosfato-aldolase resíduo C. Desamidado é indicado como Deam-Asn. b. Espectro do péptido YASICQQN # GIVPIVEPEILPDGDHDLKR, que neste caso mostra um deslocamento de massa de -17 Da no anteriormente desamidados resíduo de Asn (SCC-Asn), devido à perda de amónio que ocorrem durante a formação do intermediário succinimida. Por favor clique aqui para ver uma versão maior do thé figura.
| Componente | Montante para 100 ml |
| isopropanol | 90 ml |
| agua | 10 ml |
Tabela Composição do tampão 1. Embalagem (90% de isopropanol).
| Solução 1: 1 M de acetato de amónio. | |
| Componente | Montante para 50 ml |
| Acetato de amónio | 3,86 g |
| Água (perfazer 50 mL) | ~ 50 mL |
| Solução 2: 100 mM de acetato de amónio. | |
| Componente | Montante para 50 ml |
| solução 1 | 5 ml |
| agua | 45 ml |
| Solução 3: 10% de desoxicolato de sódio. | |
| Componente | Montante para 1 ml |
| deoxicolato de sódio | 0,1 g |
| agua | 1 mL |
| Solução 4: tampão de homogeneização SDC (acetato de amónio 100 mM contendo 1% de desoxicolato de sódio). | |
| Componente | Montante para 10 ml |
| solução 2 | 9 ml |
| solução 3 | 1 mL |
Tabela 2. SDC Homogeneização composição do tampão (100 mM de acetato de amónio contendo 1% de desoxicolato de sódio). Prepare as solu açõesção de 1 M de acetato de amónio (solução 1) e dilui-se para obter 100 mM de acetato de amónio (Solução 2). Adicionalmente, preparar a solução stock de 10% de desoxicolato de sódio (Solução 3). Preparar o tampão de homogeneização SDC como descrito em Solução 4.
| Solução 5: 1 M DTT | |
| Componente | Montante para 10 ml |
| ditiotreitol | 77 mg |
| Solução 2 (Ver Tabela 2) | 0,5 ml |
| Solução 6: O tampão de diluição | |
| Componente | Montante para 10 ml |
| solução 5 | 0,1 ml |
| Solução 2 (Ver Tabela 2) | 9,9 ml |
Tabela 3. Tampão de Diluição Composição (100 mM de acetato de amónio contendo ditiotreitol 10 mM (DTT)). Preparar a solução stock de 1 M DTT (solução 5) e subsequentemente preparar o tampão de diluição como detalhado na Solução 6.
| Solução 7: 1 H IAA | |
| Componente | Montante para 10 ml |
| IAA | 93 mg |
| Solução 2 (Ver Tabela 2) | 0,5 ml |
Tabela 4. Tampão A alquilação Composição (100 mM de acetato de amónio contendo iodoacetamida 20 mM (IAA)). Preparar a solução stock de 1 M de IAA (Solução 7).
| Componente | Montante para 50 ml |
| hidróxido de amónio | 0,25 ml |
| agua | 24,75 mL |
Tabela 5. SDC redissolução composição do tampão (0,5% de hidróxido de amónio).
| Componente | Montante para 100 ml |
| ácido trifluoroacético | 0,1 ml |
| agua | 99,9 mL |
Tabela 6. Limpa-se tampão (0,1% de ácido trifluoroacético).
| Componente | Montante para 100 ml |
| Acetonitrilo | 75 ml |
| Ácido fórmico | 0,1 ml |
Tabela 7. A eluição Tampão (75% de acetonitrilo, 0,1% ácido fórmico).
| Componente | Quantidade para 1000 ml |
| Ácido fórmico | 1 mL |
| agua | 999 ml |
Tabela 8. Fase Móvel Uma composição.
| Componente | Quantidade para 1000 ml |
| Ácido fórmico | <td> 1 mL|
| Acetonitrilo | 999 ml |
Tabela 9. Móvel Fase B Composição.
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Discussion
Neste vídeo-artigo apresentamos um protocolo passo-a-passo de LERLIC-MS / MS 3, um método para realizar uma caracterização em profundidade e para determinar com precisão a extensão da desamidação da proteína e os processos enzimáticos envolvidos nesta modificação de proteínas. LERLIC-MS / MS baseia-se no uso de um longo comprimento (50 cm) LAX sob o princípio de cromatografia electrostática repulsão-hidrofílico interacção (ERLIC) 27. A utilização de uma coluna de longa duração, tal como mostrado no nosso estudo três, maximiza o potencial de ERLIC a péptidos separadas de acordo com o seu ponto isoeltrico 27.
LERLIC-MS / MS representa uma estratégia de separação unidimensional romance espingarda, um fluxo de trabalho que poupa tempo-em-mãos durante o processamento da amostra, embora necessita de um gradiente de 1,200 min, tal como indicado em 3 para obter os melhores resultados em proteomas altamente complexas. A 60 min gradient em LERLIC-MS / MS pode também alcançar uma separação óptima das isoformas de desamidação em Gln compostos modelo para a primeira vez em proteómica espingarda 3. Com base nestas duas aplicações, especula-se que a segunda separação dimensão realizada por capilar LAX poderia ser acoplado a um meio de cromatografia de fase reversa primeira dimensão sob uma abordagem cromatografia multidimensional para a análise de amostras de complexidade média, um fluxo de trabalho usado anteriormente pelo nosso grupo 10.
A preparação da amostra para a análise de desamidação proteína é um passo crucial que requer uma atenção cuidadosa para evitar a ocorrência de desamidação artefatual em resíduos de Asn em grande medida uma. Hao et al. encontrado que a digestão tríptica sob pH acídico suave impede significativamente a aparição de desamidação artefatual durante a preparação da amostra 28. Temos usado neste estudo nosso SDC-assistida em solução trydigestão PTIC 13, um método em que o processamento da amostra é realizada a um pH de 6. Por outro lado, condições ácidas mais fortes pode desafiar a capacidade de digestão de tripsina, quando o pH é mantido inferior a 6 29. Abordar esta questão, muito recentemente Liu et al. relataram uma estratégia digestão óptima que permite a digest bem sucedida e prevenção da ocorrência de desamidação artefatual em resíduos de Asn por substituição da tripsina por Glu-C, a pH 4,5 30. A implementação do método de digestão relatado por Liu et ai. 30 para analisar Asn desamidação por LERLIC-MS / MS pode ser uma estratégia potencial que requer a verificação experimental.
O protocolo descrito neste vídeo-artigo tem um grande potencial para caracterizar adicionalmente e quantificar actualmente desconhecidos matrizes relação isoforma que definem o envolvimento de desamidação proteína com o envelhecimento e doenças humanas. PeleThermore, aplicação de LERLIC-MS / MS em outras origens biológicas ajudará a determinar as potencialidades e riscos de desamidação proteína como uma modificação de relógio molecular.
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Este trabalho foi em parte apoiado por subsídios do Ministério da Educação de Cingapura (Tier 2: Conceder ARC9 / 15), National Medical Research Council of Singapore (NMRC-OF-IRG-0003-2016) e NTU-NHG Aging Research Grant ( Grant ARG / 14017). Nós gostaríamos de expressar nossa gratidão e mais sinceros agradecimentos ao Dr. Andrew Alpert e equipe PolyLC para gentilmente nos cedeu os materiais de embalagem que tornaram possível este estudo.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PolyCAT 3 µm 100-Å (bulk material) | PolyLC Inc. | Special order | |
| Long-length ion exchange capillary column 50 cm - 200 µm ID | PolyLC Inc. | Special order | |
| PEEKsil Tubing 1/16" OD x 200 µm ID x 50 cm length | SGE Analytical Science under Trajan Scientific Australia | 620050 | |
| Female-to-female fitting for 1/16" OD tubbing | Upchurch Scientific | UPCHF-125 | |
| Female nut for microferule | Upchurch Scientific | UPCHP-416 | |
| Microferule | Upchurch Scientific | UPCHF-132 | |
| Pressure Bomb NanoBaume | Western Fluids Engineering | SP-400 | |
| Shimadzu Prominence UFLC system | Shimadzu | Prominence UFLC | |
| Bullet Blender | Next Advance | BBX24 | |
| Safe-lock tubes | Eppendorf | T9661-1000EA | |
| Stainless steel beads. 0.9 – 2.0 mm. 1 lb. Non-sterile. | Next Advance | SSB14B | |
| Table-top centrifuge | Hettich Zentrifugen | Rotina 380 R | |
| Standard Digital Heated Circulating Bath, 120VAC | PolyScience 8006 6L | 8006A11B | |
| Sep-pack c18 desalting cartridge 50 mg | Waters | WAT020805 | |
| Vacumm concentrator | Eppendorf | Concentrator Plus System | |
| Dionex UltiMate 3000 UHPLC | Dionex | UltiMate 3000 UHPLC | |
| Orbitrap Elite mass spectrometer | Thermo Fisher Scientific Inc. | ORBITRAP ELITE | |
| Michrom Thermo CaptiveSpray | Michrom-Bruker Inc. | TCSI-SS2 | |
| Incubator INCUCELL | MMM Group | INCUCELL111 | |
| Sequencing-grade modified trypsin | Promega | V5111 | |
| Protease inhibitor cocktail tablets | Roche | 11836170001 (ROCHE) | |
| Phosphate buffer solution 10x (diluted to 1x) | Sigma-Aldrich | P5493 | |
| Ammonium acetate | Sigma-Aldrich | A1542 | |
| Sodium deoxycholate | Sigma-Aldrich | D6750 | |
| Dithiothreitol | Sigma-Aldrich | D0632 | |
| Iodoacetamide | Sigma-Aldrich | i6125 | |
| Formic acid | Sigma-Aldrich | F0507 (HONEYWELL) | |
| Ammonium hydroxide | Sigma-Aldrich | 338818 (HONEYWELL) | |
| Acetonitrile HPLC grade | Sigma-Aldrich | 675415 | |
| Isopropanol HPLC grade | Sigma-Aldrich | 675431 | |
| Water HPLC grade | Sigma-Aldrich | 14263 |
References
- Hao, P., Adav, S. S., Gallart-Palau, X., Sze, S. K. Recent advances in mass spectrometric analysis of protein deamidation. Mass Spectrom Rev. , (2016).
- Geiger, T., Clarke, S. Deamidation, isomerization, and racemization at asparaginyl and aspartyl residues in peptides. Succinimide-linked reactions that contribute to protein degradation. J Biol Chem. 262 (2), 785-794 (1987).
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