Induktion af celledifferentiering og single cell imaging af<em> Vibrio parahaemolyticus</em> Svømmer og sværmerceller

Summary

Denne protokol muliggør enkeltcellemikroskopi af de forskelligt adskilte Vibrio parahaemolyticus svømmer- og sværmerceller. Fremgangsmåden frembringer en population af swarmerceller, der er let tilgængelige til enkeltcelleanalyse og dækker fremstilling af cellekulturer, induktion af swarmer differentiering, prøvepræparation og billedanalyse.

Abstract

Evnen til at studere intracellulær lokalisering af proteiner er afgørende for forståelsen af ​​mange cellulære processer. Til gengæld kræver dette evnen til at opnå enkelte celler til fluorescensmikroskopi, hvilket kan være særligt udfordrende, når billeddannende celler, som eksisterer inden for bakterielle samfund. For eksempel eksisterer det humane patogen Vibrio parahaemolyticus som korte stavformede svømmerceller i flydende forhold, som ved overfladekontakt differentieres i en subpopulation af stærkt langstrakte sværmerceller specialiseret til vækst på faste overflader. Dette papir præsenterer en metode til at udføre single cell fluorescensmikroskopi analyse af V. parahaemolyticus i sine to differentierede tilstande. Denne protokol inducerer meget reproducerbar differentiering af V. parahaemolyticus i en livscyklus for sværmerceller og letter deres spredning over faste overflader. Fremgangsmåden frembringer flares af differentierede swarmerceller, der strækker sig fra tHan kant af sværm-koloni. Især i spidsen af ​​sværgflekserne findes sværmerceller i et enkelt lag af celler, hvilket muliggør deres nemme overførsel til et mikroskopglas og efterfølgende fluorescensmikroskopi afbildning af enkeltceller. Derudover er workflow af billedanalyse til demografisk repræsentation af bakterielle samfund præsenteret. Som et principprincip beskrives analysen af ​​den intracellulære lokalisering af kemotaxis-signaleringsarrayer i svømmer- og svømmerceller af V. parahaemolyticus.

Introduction

Bakterier oplever konstant ændringer i deres ydre miljø og har udviklet flere teknikker til at ændre og tilpasse deres adfærd i overensstemmelse hermed. En sådan mekanisme indebærer differentiering i forskellige celletyper, der bedre supplerer det ændrede miljø. Differentiering involverer ofte store ændringer i reguleringen af ​​cellecyklussen, cellemorfologi og den spatiotemporale organisation af cellerne. En organisme der kan undergå differentiering er Vibrio parahaemolyticus . V. parahaemolyticus tilhører Vibrionaceae , som er en familie af proteobakterier, der normalt beboer frisk eller saltvand. Vibrionaceae er bredt fordelt i miljøet og omfatter flere arter, der forårsager intestinale infektioner hos mennesker, også inklusive Vibrio cholerae. V. Parahaemolyticus er en dimorf organisme og er i stand til at differentiere i to forskellige celletyper som et svar for at imødekomme ændringer i detsEksternt miljø. I vandige omgivelser eksisterer den som en kort stangformet svømmercelle med et enkelt polært flagellum placeret ved den gamle cellepæl. Ved overfladekontakt udløses differentiering i en sværmercelle. Swarmer celledifferentiering involverer to store ændringer: swarmercellemorfogenese gennem inhibering af celledeling og induktion af et andet flagella system. Dette resulterer i dannelsen af ​​en peritrich og stærkt forlænget stangformet sværmercelle, som enten kan fortsætte sværmerens livsstil, hvor divisionshændelser resulterer i afkom swarmerceller eller alternativt differentierer tilbage til svømmerceller.

Flere faktorer er blevet rapporteret at inducere eller påvirke swarmer differentiering. Den primære stimulus ser ud til at være drevet af mekanosensing, hvor V. parahaemolyticus bruger polar flagellum som en taktil sensor, som detekterer inhibering af rotationen ved overfladekontakt, men flere andre faktorer er involveret somBrønd ¹ I laboratoriet kan rotation af det polære flagellum inhiberes kunstigt ved tilsætning af phenamil, som blokerer den natriumkanal-drevne flagellære rotation og derved fremkalde sværmer differentiering ² . Desuden blev Vibrio alginolyticus i et tidligere forsøg induceret at sværmme på fast medium, når celler blev formeret på vækstmedium i en Petri-skål forseglet med klart plastikbånd. Alkalisk-mættet filterpapir forhindret sværmer under disse betingelser, hvilket tyder på, at en eller flere flygtige syrer kan være involveret i induktion af sværmer. Således forsegles petriskålen med plastikbånd, der sandsynligvis er tilladt for akkumulering af flygtige syrer, dannet som biprodukter af cellulær metabolisme inden for pladens hovedplade. Den samme effekt blev opnået, når H202 blev tilsat til vækstmediet i uforseglede petriskåle med henblik på kunstigt at fremstille flygtige syrer ved hydrolysering af mediekomponenter <supClass = "xref"> 3 ^{, 4 , 5} . Ikke desto mindre er identiteten af ​​sådanne flygtige syrer forblev ukendt. Det har desuden vist sig, at overskydende tilgængelighed af calcium ⁶ og jernbegrænsning ⁷ begge forøger sværmer differentiering og proliferation over faste overflader. Celler kan sultes for jern ved at tilsætte forbindelsen 2,2'-bipyridyl til vækstmediet, som har vist sig at påvirke swarmer differentiering ⁸ . De faktorer, der er kendt for at regulere differentiering, implementeres nu i udformningen af ​​en protokol, som reproducerbart inducerer V. parahaemolyticus differentiering i sværmerceller og deres proliferation på faste agaroverflader.

V. parahaemolyticus differentiering indebærer store ændringer i reguleringen af ​​celledeling, cellulær morfologi og positionering af makromolekylære maskiner såsom flagellA og chemotaxis apparater – processer, som alle kræver den specifikke lokalisering af proteiner i overensstemmelse med cellecyklussen. Evnen til at studere den intracellulære lokalisering af sådanne proteiner er således afgørende for forståelsen af ​​de ovennævnte cellulære processer. For at udføre sådanne undersøgelser kræves fluorescensmikroskopi på enkeltceller. Dette kan være særligt udfordrende, når billeddannelsesceller findes inden for tætte bakteriepopulationer, som det er tilfældet med sværmerceller. Der har været forsøg på at fremkalde sværmer differentiering i flydende medier, som potentielt kunne danne enkeltceller til mikroskopi undersøgelser. Og selvom disse celler på et transkriptionsniveau delvis har induceret swarmer-differentieringsprogrammet, undergår de ikke de samme særskilte morfologiske forandringer som fuldt differentierede swarmerceller dyrket på fast medium ⁸ . Dette papir tilbyder en robust og reproducerbar protokol for en metode til at inducere sværmerLl differentiering på en agaroverflade. Protokollen producerer en population af let tilgængelige sværmerceller, der er tilgængelige for enkeltcellemikroskopi og efterfølgende analyse. Desuden muliggør protokollen lokaliseringsstudier af fluorescensmærkede proteiner i både svømmer- og sværmercelletyperne (sektioner 1, 2, 3, 4). Desuden beskriver protokollen den efterfølgende arbejdsgang om, hvordan man behandler og analyserer de genererede data fra fluorescensmikroskopi eksperimenter, som muliggør demografisk analyse af bakterielle samfund (afsnit 5).

Protocol

1. Fremstilling af elektrokompetente V. parahaemolyticusceller og elektroporation af plasmid-DNA i svømmerceller BEMÆRK: Følgende afsnit i protokollen tillader fremstilling af elektrokompetente celler og den efterfølgende elektroporation af plasmid-DNA i svømmerceller. Dette trin er vigtigt, hvis fluorescerende proteiner eksploderes ectopisk fra et plasmid. Strim ud V. parahaemolyticus celler fra en -80 ° C glycerol stamme på en frisk LB agar plad…

Representative Results

Induktion af differentiering og generation af sværmende kolonier Figur 1 giver et skema over de vigtige trin involveret i fremstilling af sværmende kolonier af V. parahaemolyticus ( figur 1A-C ). En svømmerkultur blev spottet på swarm-agar og inkuberet ved 24 ° C, hvilket inducerede sværmer differentiering og proliferation over den faste agaroverflade. Et repræsentativt…

Discussion

Dette papir rapporterer en metode til mikroskopisk billeddannelse af V. parahaemolyticus swarmerceller efterfulgt af downstream-analyser beregnet til at løse og kvantificere den subcellulære lokalisering og andre træk ved de undersøgte fluorescensmærkede proteiner. Selv om der findes flere værktøjer til mikroskopi billedbehandling og analyse ^{14 , 15 , 16 , 17 ,} <sup …

Materials

Media components
LB-medium	Roth	X968.3
Difco Agar, granulated	BD	214510	For preparation of LB agar with LB-medium
Difco Heart Infusion Agar	BD	244400	For preparation of HI agar swarming plates
Agarose NEEO, ultra quality	Roth	2267.3	For preparation of microscopy agarose pads
Name	Company	Catalog Number	Comments
Additives
L-arabinose	Roth	5118.3	Used to induce pBAD derivatives
2,2`-Bipyridyl	Sigma Aldrich	D216305-25G	For preparation of HI agar swarming plates
Calcium chloride dihydrate	Roth	5239.1	For preparation of HI agar swarming plates
Ampicillin sodium salt	Roth	K029.3
Chloramphenicol	Roth	3886.3
PBS buffer	–	–	Standard recipe for Phosphate-buffered saline
D(+) Sucrose	Roth	4621.1	For preparation of electrocompetent cells
Glycerol	Roth	3783.5	For preparation of electrocompetent cells
Name	Company	Catalog Number	Comments
Hardware
Petri dish 150x20mm with cams	Sarstedt	82.1184.500	For preparation of HI agar swarming plates
kelvitron t (B 6420)	Heraeus	–	Used for drying HI agar swarming plates
Gene Pulser Xcell Microbial System	BioRad	1652662	Used for elctroporation of plasmid DNA
Name	Company	Catalog Number	Comments
Software
MetaMorph Offline (version 7.7.5.0)	Molecular Devices	–	Used for microscopy image analysis
Excel	Microsoft	–	Used for microscopy data analsis