Hücresel Farklılaşma ve Tek Hücreli Görüntüleme İndüksiyonu<emVibrio parahaemolyticus</em> Yüzücü ve Swarmer Hücreleri
Summary
Bu protokol, farklı olarak farklı Vibrio parahaemolyticus yüzücü ve swarmer hücrelerinin tek hücreli mikroskobu sağlar. Yöntem, tek hücreli analiz için kolayca bulunabilen bir swarmer hücreleri popülasyonu üretir ve hücre kültürlerinin hazırlanmasını, swarmer farklılaşmasının indüksiyonunu, numunenin hazırlanmasını ve görüntü analizini kapsar.
Abstract
Proteinlerin hücre içi lokalizasyonunu inceleme kabiliyeti birçok hücresel sürecin anlaşılması için gereklidir. Buna karşılık, bu, bakteri toplulukları içinde varolan hücreleri görüntülerken özellikle zorlayıcı olabilen floresan mikroskopisi için tekli hücreler elde etme yeteneğini gerektirir. Örneğin, insan patojeni Vibrio parahaemolyticus sıvı koşullar altında kısa çubuk şeklindeki yüzücü hücreler olarak bulunur ve yüzey teması üzerine katı yüzeyler üzerinde büyümek için uzmanlaşmış oldukça genişlemiş swarmer hücrelerin bir alt popülasyonuna ayrılır. Bu yazıda V. parahaemolyticus'un iki farklı durumundaki tek hücreli floresans mikroskobu analizini gerçekleştirmek için bir yöntem sunulmaktadır. Bu protokol, V. parahaemolyticus'un daha canlı bir hücre yaşam döngüsüne çok reproducibly farklılaşmasına neden olur ve katı yüzeyler üzerindeki proliferasyonunu kolaylaştırır. Metod, t lekelerinden uzanan farklı swarmer hücrelerinin fişeklerini üretir.O sürü koloni kenarında. Özellikle, sürü alevlerinin ucunda, daha sürükleyici hücreler, tek bir hücrenin katmanında bulunur; bu da, bir mikroskop lamına kolay aktarılmalarına ve daha sonra tek hücrelerin izlenmesi için flüoresans mikroskobu görüntülemelerine olanak tanır. Ek olarak, bakteri toplumlarının demografik temsili için görüntü analizinin iş akışı sunulmaktadır. Prensip olarak, V. parahaemolyticus'un yüzücü ve swarmer hücrelerindeki kemotaksis sinyal dizilerinin hücre içi lokalizasyonunun analizi açıklanmaktadır.
Introduction
Bakteriler sürekli olarak dış ortamlarında değişiklikler yaşarlar ve davranışlarını buna göre değiştirmek ve uyarlamak için çeşitli teknikler geliştirdiler. Böyle bir mekanizma, değişen çevreyi daha iyi tamamlayan farklı hücre türlerine farklılaşmayı içerir. Farklılaşma çoğunlukla hücre döngüsünün düzenlenmesinde, hücre morfolojisindeki ve hücrelerin zamansal organizasyonunda büyük değişiklikler içerir. Farklılaşabilen bir organizma Vibrio parahaemolyticus'tur . V. parahaemolyticus genellikle taze veya tuzlu suda yaşayan bir proteobakteriler ailesi olan Vibrionaceae'ye aittir. Vibrionaceae , çevrede yaygın olarak bulunur ve insanlarda bağırsak yolları enfeksiyonlarına neden olan çeşitli türleri içerir; ayrıca Vibrio cholerae.V de dahildir. Parahaemolyticus dimorfik bir organizmadır ve değişikliklere uyum sağlamak için iki farklı hücre tipine cevap olarak cevap verebilirDış çevre. Sulu ortamlarda, eski hücre direğine yerleştirilmiş tek bir polar flagellum ile kısa çubuk şeklinde bir yüzücü hücre bulunur. Yüzey teması üzerine, daha yapışkan bir hücrede farklılaşma tetiklenir. Swarmer hücre farklılaşması iki önemli değişiklik içerir: hücre bölünmesinin önlenmesi yoluyla swarmer hücre morfogenezi ve ikinci bir flagella sisteminin indüksiyonu. Bu, bölünmüş olayların döl hücreleri hücrelerinde sonuçlandığı veya alternatif olarak yüzücüler hücrelerine geri dönüştürebildiği, kiraz yaşam biçimine devam edebilen, peritrik ve oldukça uzatılmış uzunlamasına çubuk şeklinde bir swarmer hücresinin oluşumuyla sonuçlanır.
Swarmer farklılaşmasını başlatan veya etkileyen çeşitli faktörlerin bildirildiği bildirilmiştir. Birincil uyarı, V. parahaemolyticus'un , polar lekeliği, yüzey temasında rotasyonun inhibisyonunu tespit eden bir dokunmatik sensör olarak kullandığı mekanosensing tarafından yönlendirilir gibi görünür; ancak, diğer birçok faktör,Iyi 1 . Laboratuarda, polar flagellumun dönüşü, sodyum kanalına bağlı bayraker rotasyonunu bloke eden fenamil ilavesiyle yapay olarak inhibe edilebilmekte ve böylelikle swarmer diferansiyasyonunu indükleyebilmektedir 2 . Ayrıca, daha önceki bir çalışmada, hücreler berrak plastik bantlarla mühürlenmiş bir Petri kabı içindeki büyüme ortamı üzerinde çoğaldığında Vibrio alginolyticus , katı medyada sürüklenmeye teşvik edildi. Alkali doymuş filtre kağıdı, bu koşullar altında yığılmayı engelledi ve bu nedenle, bir veya daha fazla uçucu asitin, kınlama indüksiyonunda rol oynayabileceğini düşündürdü. Böylece, Petri kabını plastik bant ile sızdırmazlık, plakanın baş alanı içinde, hücresel metabolizmanın yan ürünleri olarak oluşan uçucu asitlerin birikmesine muhtemelen izin verdi. Aynı etki, ortam bileşenlerini hidrolize ederek yapay olarak uçucu asitler üretmek için H2O2 büyütülmüş ortama yapıştırılmamış Petri kaplarında ilave edildiğinde elde edilmiştir <supClass = "xref"> 3 , 4 , 5 . Bununla birlikte, bu uçucu asitlerin kimliği hala bilinmiyor. Dahası, kalsiyumun aşırı miktarda bulunması 6 ve demir sınırlamanın 7 hem katı yüzeylerde swarmer farklılaşmasını ve çoğalmasını arttırdığı gösterilmiştir. Hücreler, pulverideki farklılaşmayı etkilediği gösterilen büyüme ortamına 2,2'-Bipiridil bileşiği eklenerek demir için aç bırakılabilir 8 . Farklılaşmayı düzenleyen bilinen faktörler, artık V. parahaemolyticus'un swarmer hücrelere diferansiyasyonunu ve katı agar yüzeylerinde proliferasyonunu teşvik eden bir protokolün tasarımında uygulanmaktadır.
V. parahaemolyticus farklılaşması, hücre bölünmesinin düzenlenmesinde, hücresel morfolojide ve flagell gibi makromoleküler makinelerin konumlandırılmasında büyük değişiklikler içerirA ve kemotaks aparatları – bunların hepsi, proteinlerin hücre döngüsüne göre spesifik lokalizasyonunu gerektiren süreçler. Dolayısıyla, bu proteinlerin hücre içi lokalizasyonunu inceleme kabiliyeti, yukarıda sözü edilen hücresel süreçlerin anlaşılması için gereklidir. Bu tür çalışmaları yapmak için tekli hücrelerde flüoresan mikroskobu gereklidir. Swarmer hücrelerinde olduğu gibi, yoğun bakteri popülasyonlarında bulunan hücreleri görüntülerken bu özellikle zorlayıcı olabilir. Mikroskopi çalışmaları için potansiyel olarak tek hücreler üretebilen sıvı ortamda swarmer farklılaşmasına neden olan girişimler yapılmıştır. Transkripsiyonel bir seviyede bu hücreler kısmen swarmer-differentiation programını başlatmış olsalar da, katı ortam 8 üzerinde yetiştirilen tam olarak ayırt edilmiş swarmer hücreleri gibi aynı morfolojik değişikliklere maruz kalmazlar. Bu makale, swarmer ce'yi indüklemek için sağlam ve tekrarlanabilir bir protokol sunmaktadır.Bir agar yüzeyinde farklılaşma. Protokol, tek hücreli mikroskopi ve takip eden analiz için kolaylıkla erişilebilen bir swarmer hücreleri popülasyonu hazırlar. Ayrıca, protokol hem yüzücü hem de swarmer hücre türlerinde (bölüm 1, 2, 3, 4) floresan etiketli proteinlerin yerini belirleme çalışmalarını mümkün kılar. Ek olarak, protokol, bakteri toplumlarının demografik analizine olanak tanıyan flüoresan mikroskopi deneylerinden elde edilen verilerin nasıl işleneceği ve analiz edileceği üzerine sonraki iş akışını tanımlamaktadır (bölüm 5).
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu yazıda, V. parahaemolyticus swarmer hücrelerinin mikroskopik görüntülemesi için bir yöntem ve bunun ardından, çalışılan floresanla işaretlenmiş proteinlerin subselüler lokalizasyonunu ve diğer özelliklerini çözmek ve nicelleştirmek üzere akış aşağı analizler sunulmaktadır. Mikroskopi görüntü işleme ve analizi için 14 , 15 , 16 , 17 , <sup …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma Max Planck Topluluğu tarafından desteklendi.
Materials
| Media components | |||
| LB-medium | Roth | X968.3 | |
| Difco Agar, granulated | BD | 214510 | For preparation of LB agar with LB-medium |
| Difco Heart Infusion Agar | BD | 244400 | For preparation of HI agar swarming plates |
| Agarose NEEO, ultra quality | Roth | 2267.3 | For preparation of microscopy agarose pads |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Additives | |||
| L-arabinose | Roth | 5118.3 | Used to induce pBAD derivatives |
| 2,2`-Bipyridyl | Sigma Aldrich | D216305-25G | For preparation of HI agar swarming plates |
| Calcium chloride dihydrate | Roth | 5239.1 | For preparation of HI agar swarming plates |
| Ampicillin sodium salt | Roth | K029.3 | |
| Chloramphenicol | Roth | 3886.3 | |
| PBS buffer | – | – | Standard recipe for Phosphate-buffered saline |
| D(+) Sucrose | Roth | 4621.1 | For preparation of electrocompetent cells |
| Glycerol | Roth | 3783.5 | For preparation of electrocompetent cells |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Hardware | |||
| Petri dish 150x20mm with cams | Sarstedt | 82.1184.500 | For preparation of HI agar swarming plates |
| kelvitron t (B 6420) | Heraeus | – | Used for drying HI agar swarming plates |
| Gene Pulser Xcell Microbial System | BioRad | 1652662 | Used for elctroporation of plasmid DNA |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Software | |||
| MetaMorph Offline (version 7.7.5.0) | Molecular Devices | – | Used for microscopy image analysis |
| Excel | Microsoft | – | Used for microscopy data analsis |
References
- McCarter, L., Hilmen, M., Silverman, M. Flagellar dynamometer controls swarmer cell differentiation of V. parahaemolyticus. Cell. 54 (3), 345-351 (1988).
- Kawagishi, I., Imagawa, M., Imae, Y., McCarter, L., Homma, M. The sodium-driven polar flagellar motor of marine Vibrio as the mechanosensor that regulates lateral flagellar expression. Mol. Microbiol. 20 (4), 693-699 (1996).
- Ulitzur, S. Induction of swarming in Vibrio parahaemolyticus. Arch. Microbiol. 101 (4), 357-363 (1974).
- Ulitzur, S. Effect of temperature, salts, pH, and other factors on the development of peritrichous flagella in Vibrio alginolyticus. Arch. Microbiol. 104 (3), 285-288 (1975).
- Ulitzur, S. The mechanism of swarming of Vibrio alginolyticus. Arch. Microbiol. 104 (1), 67-71 (1975).
- Gode-Potratz, C. J., Chodur, D. M., McCarter, L. L. Calcium and iron regulate swarming and type III secretion in Vibrio parahaemolyticus. J. Bacteriol. 192 (22), 6025-6038 (2010).
- McCarter, L., Silverman, M. Iron regulation of swarmer cell differentiation of Vibrio parahaemolyticus. J. Bacteriol. 171 (2), 731-736 (1989).
- Gode-Potratz, C. J., Kustusch, R. J., Breheny, P. J., Weiss, D. S., McCarter, L. L. Surface sensing in Vibrio parahaemolyticus triggers a programme of gene expression that promotes colonization and virulence. Mol. Microbiol. 79 (1), 240-263 (2011).
- Heering, J., Ringgaard, S. Differential Localization of Chemotactic Signaling Arrays during the Lifecycle of Vibrio parahaemolyticus. Front Microbiol. 7 (November), 1-12 (2016).
- Cameron, T. A., Anderson-Furgeson, J., Zupan, J. R., Zik, J. J., Zambryski, P. C. Peptidoglycan synthesis machinery in Agrobacterium tumefaciens during unipolar growth and cell division. mBio. 5 (3), (2014).
- Development Core Team, R. F. F. S. C. R: A Language and Environment for Statistical Computing. R Foundation for Statistical Computing. 1, 2673 (2008).
- Ringgaard, S., et al. ParP prevents dissociation of CheA from chemotactic signaling arrays and tethers them to a polar anchor. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (2), E255-E264 (2014).
- Ringgaard, S., Schirner, K., Davis, B. M., Waldor, M. K. A family of ParA-like ATPases promotes cell pole maturation by facilitating polar localization of chemotaxis proteins. Genes Dev. 25, 1544-1555 (2011).
- Vischer, N. O. E., et al. Cell age dependent concentration of Escherichia coli divisome proteins analyzed with ImageJ and ObjectJ. Front Microbiol. 6 (JUN), (2015).
- Schneider, C. a., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat. Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
- Sliusarenko, O., Heinritz, J., Emonet, T., Jacobs-Wagner, C. High-throughput, subpixel precision analysis of bacterial morphogenesis and intracellular spatio-temporal dynamics. Mol. Microbiol. 80 (3), 612-627 (2011).
- Ducret, A., Quardokus, E. M., Brun, Y. V. MicrobeJ, a tool for high throughput bacterial cell detection and quantitative analysis. Nat. Microbiol. 1, 16077 (2016).
- Carpenter, A. E., et al. CellProfiler: image analysis software for identifying and quantifying cell phenotypes. Genome Biol. 7 (10), R100 (2006).
- Morales-Soto, N., et al. Preparation, Imaging, and Quantification of Bacterial Surface Motility Assays. J. Vis. Exp. (98), e52338 (2015).
- Paintdakhi, A., et al. Oufti: An integrated software package for high-accuracy, high-throughput quantitative microscopy analysis. Mol. Microbiol. 99 (4), 767-777 (2016).
- de Jong, I. G., Beilharz, K., Kuipers, O. P., Veening, J. -. W. Live Cell Imaging of Bacillus subtilis and Streptococcus pneumoniae using Automated Time-lapse Microscopy. J. Vis. Exp. (53), e1-e6 (2011).
