Induction de la différenciation cellulaire et de l'imagerie cellulaire unique<emVibrio parahaemolyticus</em> Swimmer and Swarmer Cells
Summary
Ce protocole permet la microscopie à une seule cellule des cellules Swimmer et Swarmer Vibrio parahaemolyticus différentiellement distinctes. La méthode produit une population de cellules moustiques facilement disponibles pour une analyse cellulaire unique et couvre la préparation de cultures cellulaires, l'induction de la différenciation des mollusques, la préparation des échantillons et l'analyse d'image.
Abstract
La capacité d'étudier la localisation intracellulaire des protéines est essentielle pour la compréhension de nombreux processus cellulaires. À son tour, cela nécessite la possibilité d'obtenir des cellules individuelles pour la microscopie de fluorescence, ce qui peut être particulièrement difficile lors de l'imagerie des cellules qui existent dans les communautés bactériennes. Par exemple, le pathogène humain Vibrio parahaemolyticus existe comme de petites cellules nageuses en forme de tige dans des conditions liquides qui, lors du contact de surface, se différencient en une sous-population de cellules de bourgeons fortement allongées spécialisées dans la croissance sur des surfaces solides. Cet article présente une méthode pour effectuer une analyse de microscopie de fluorescence à une seule cellule de V. parahaemolyticus dans ses deux états différentiels. Ce protocole induit de manière très reproductible la différenciation de V. parahaemolyticus dans un cycle de vie de la cellule gonflante et facilite leur prolifération sur les surfaces solides. La méthode produit des étincelles de cellules de bourgeons différenciées s'étendant de tIl se dirigea vers la colonie d'essaims. Notamment, à la pointe même des évasements d'essaim, les cellules de mollusque existent dans une seule couche de cellules, ce qui permet leur transfert facile vers une lame de microscope et une microscopie à fluorescence ultérieure d'une seule cellule. En outre, le flux de travail de l'analyse d'image pour la représentation démographique des sociétés bactériennes est présenté. En tant que preuve de principe, on décrit l'analyse de la localisation intracellulaire des réseaux de signalisation chimiotaxique dans les cellules nageuses et moustiques de V. parahaemolyticus.
Introduction
Les bactéries connaissent constamment des changements dans leur environnement externe et ont développé plusieurs techniques pour modifier et adapter leurs comportements en conséquence. Un tel mécanisme implique une différenciation en types de cellules distinctes qui complètent mieux l'environnement altéré. La différenciation implique souvent des changements majeurs dans la régulation du cycle cellulaire, de la morphologie cellulaire et de l'organisation spatio-temporelle des cellules. Un organisme qui peut subir une différenciation est Vibrio parahaemolyticus . V. parahaemolyticus appartient aux Vibrionaceae , qui est une famille de protéobactéries qui habitent habituellement des eaux fraîches ou salées. Les vibrionaceae sont largement distribués dans l'environnement et comprennent plusieurs espèces qui causent des infections intestinales chez les humains, y compris le Vibrio cholerae.V. Parahaemolyticus est un organisme dimorphique et peut se différencier en deux types cellulaires distincts en réponse à des changementsMilieu externe. Dans les environnements aqueux, il existe comme une petite cellule nageuse en forme de tige avec un seul flagelle polaire positionné à l'ancien pôle cellulaire. Lors du contact de surface, la différenciation dans une cellule de nerf est déclenchée. La différenciation cellulaire de Swarmer implique deux changements majeurs: la morphogenèse des cellules moustiques par l'inhibition de la division cellulaire et l'induction d'un deuxième système de flagelles. Il en résulte la formation d'une cellule de bourgeons peritrichous et hautement allongée, qui peut soit continuer le style de vie des mollusques, où les événements de division donnent naissance à des cellules moustiques de descendance, soit différencier de nouveau dans des cellules nageuses.
Plusieurs facteurs ont été rapportés pour induire ou influencer la différenciation des mollusques. Le stimulus primaire semble être conduit par des mechanosensing où V. parahaemolyticus utilise le flagelle polaire comme capteur tactile qui détecte l'inhibition de la rotation lors du contact de surface, mais plusieurs autres facteurs sont impliqués commeBien 1 . En laboratoire, la rotation du flagelle polaire peut être inhibée artificiellement par addition de phénamil, ce qui bloque la rotation flagellaire entraînée par le canal de sodium, induisant ainsi une différenciation des fléaux 2 . En outre, dans une étude antérieure , Vibrio alginolyticus a été induit à emmêler sur des milieux solides lorsque les cellules ont été propagées sur un milieu de croissance dans une boîte de Petri scellée avec un ruban adhésif transparent. Le papier filtre saturé alcalin a empêché de grouiller dans ces conditions, ce qui suggère qu'un ou plusieurs acides volatils pourraient être impliqués dans l'induction de l'essaimage. Ainsi, l'étanchéité de la boîte de Petri avec un ruban plastique permettait vraisemblablement l'accumulation d'acides volatils, formés comme sous-produits du métabolisme cellulaire, dans l'espace de tête de la plaque. Le même effet a été obtenu lorsque le H 2 O 2 a été ajouté au milieu de croissance dans des boîtes de Petri non scellées afin de produire artificiellement des acides volatils en hydrolysant les composants du média <supClasse = "xref"> 3 , 4 , 5 . Néanmoins, l'identité de ces acides volatils reste inconnue. En outre, il a été démontré que la disponibilité excessive de calcium 6 et de la limitation du fer 7 augmentait la différenciation et la prolifération des mollusques sur les surfaces solides. Les cellules peuvent être affamées pour le fer en ajoutant le composé 2,2'-Bipyridyle au milieu de croissance, ce qui a montré que cela influence la différenciation des mollusques 8 . Les facteurs connus pour réguler la différenciation sont maintenant mis en œuvre dans la conception d'un protocole qui induit de manière reproductible la différenciation de V. parahaemolyticus dans des cellules de moustaches et leur prolifération sur des surfaces solides d'agar.
La différenciation de V. parahaemolyticus implique des changements majeurs dans la régulation de la division cellulaire, la morphologie cellulaire et le positionnement de machines macromoléculaires telles que flagellA et chimiotaxis – processus qui nécessitent tous une localisation spécifique des protéines selon le cycle cellulaire. Ainsi, la capacité d'étudier la localisation intracellulaire de ces protéines est essentielle à la compréhension des processus cellulaires susmentionnés. Pour effectuer de telles études, il faut une microscopie à fluorescence sur des cellules individuelles. Cela peut être particulièrement difficile lors de l'imagerie des cellules qui existent dans des populations bactériennes denses, comme c'est le cas pour les cellules moustiques. Il a été tenté d'induire une différenciation des mollusques dans les milieux liquides, ce qui pourrait générer des cellules individuelles pour des études de microscopie. Et bien que, au niveau de la transcription, ces cellules ont induit partiellement le programme de différenciation des mollusques, elles ne subissent pas les mêmes changements morphologiques distincts que les cellules de bourgeons complètement différenciées cultivées sur un milieu solide 8 . Cet article offre un protocole robuste et reproductible d'une méthode pour induire un coccinelleSur une surface de gélose. Le protocole produit une population de cellules gonflées facilement accessibles facilement disponibles pour une microscopie à une seule cellule et une analyse ultérieure. En outre, le protocole permet des études de localisation des protéines marquées par fluorescence à la fois dans les types de cellules nageuses et moustiques (sections 1, 2, 3, 4). En outre, le protocole décrit le flux de travail ultérieur sur la façon de traiter et d'analyser les données générées à partir d'expériences de microscopie de fluorescence, ce qui permet une analyse démographique des sociétés bactériennes (section 5).
Protocol
Representative Results
Discussion
Cet article rapporte une méthode pour l'imagerie microscopique de cellules de moustiquaires V. parahaemolyticus , suivie d'analyses en aval destinées à résoudre et quantifier la localisation subcellulaire et d'autres caractéristiques des protéines étudiées fluorescentes. Bien que plusieurs outils existent pour le traitement et l'analyse de l'image microscopique 14 , 15 , 16 , <sup…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu par la Société Max Planck.
Materials
| Media components | |||
| LB-medium | Roth | X968.3 | |
| Difco Agar, granulated | BD | 214510 | For preparation of LB agar with LB-medium |
| Difco Heart Infusion Agar | BD | 244400 | For preparation of HI agar swarming plates |
| Agarose NEEO, ultra quality | Roth | 2267.3 | For preparation of microscopy agarose pads |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Additives | |||
| L-arabinose | Roth | 5118.3 | Used to induce pBAD derivatives |
| 2,2`-Bipyridyl | Sigma Aldrich | D216305-25G | For preparation of HI agar swarming plates |
| Calcium chloride dihydrate | Roth | 5239.1 | For preparation of HI agar swarming plates |
| Ampicillin sodium salt | Roth | K029.3 | |
| Chloramphenicol | Roth | 3886.3 | |
| PBS buffer | – | – | Standard recipe for Phosphate-buffered saline |
| D(+) Sucrose | Roth | 4621.1 | For preparation of electrocompetent cells |
| Glycerol | Roth | 3783.5 | For preparation of electrocompetent cells |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Hardware | |||
| Petri dish 150x20mm with cams | Sarstedt | 82.1184.500 | For preparation of HI agar swarming plates |
| kelvitron t (B 6420) | Heraeus | – | Used for drying HI agar swarming plates |
| Gene Pulser Xcell Microbial System | BioRad | 1652662 | Used for elctroporation of plasmid DNA |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Software | |||
| MetaMorph Offline (version 7.7.5.0) | Molecular Devices | – | Used for microscopy image analysis |
| Excel | Microsoft | – | Used for microscopy data analsis |
References
- McCarter, L., Hilmen, M., Silverman, M. Flagellar dynamometer controls swarmer cell differentiation of V. parahaemolyticus. Cell. 54 (3), 345-351 (1988).
- Kawagishi, I., Imagawa, M., Imae, Y., McCarter, L., Homma, M. The sodium-driven polar flagellar motor of marine Vibrio as the mechanosensor that regulates lateral flagellar expression. Mol. Microbiol. 20 (4), 693-699 (1996).
- Ulitzur, S. Induction of swarming in Vibrio parahaemolyticus. Arch. Microbiol. 101 (4), 357-363 (1974).
- Ulitzur, S. Effect of temperature, salts, pH, and other factors on the development of peritrichous flagella in Vibrio alginolyticus. Arch. Microbiol. 104 (3), 285-288 (1975).
- Ulitzur, S. The mechanism of swarming of Vibrio alginolyticus. Arch. Microbiol. 104 (1), 67-71 (1975).
- Gode-Potratz, C. J., Chodur, D. M., McCarter, L. L. Calcium and iron regulate swarming and type III secretion in Vibrio parahaemolyticus. J. Bacteriol. 192 (22), 6025-6038 (2010).
- McCarter, L., Silverman, M. Iron regulation of swarmer cell differentiation of Vibrio parahaemolyticus. J. Bacteriol. 171 (2), 731-736 (1989).
- Gode-Potratz, C. J., Kustusch, R. J., Breheny, P. J., Weiss, D. S., McCarter, L. L. Surface sensing in Vibrio parahaemolyticus triggers a programme of gene expression that promotes colonization and virulence. Mol. Microbiol. 79 (1), 240-263 (2011).
- Heering, J., Ringgaard, S. Differential Localization of Chemotactic Signaling Arrays during the Lifecycle of Vibrio parahaemolyticus. Front Microbiol. 7 (November), 1-12 (2016).
- Cameron, T. A., Anderson-Furgeson, J., Zupan, J. R., Zik, J. J., Zambryski, P. C. Peptidoglycan synthesis machinery in Agrobacterium tumefaciens during unipolar growth and cell division. mBio. 5 (3), (2014).
- Development Core Team, R. F. F. S. C. R: A Language and Environment for Statistical Computing. R Foundation for Statistical Computing. 1, 2673 (2008).
- Ringgaard, S., et al. ParP prevents dissociation of CheA from chemotactic signaling arrays and tethers them to a polar anchor. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (2), E255-E264 (2014).
- Ringgaard, S., Schirner, K., Davis, B. M., Waldor, M. K. A family of ParA-like ATPases promotes cell pole maturation by facilitating polar localization of chemotaxis proteins. Genes Dev. 25, 1544-1555 (2011).
- Vischer, N. O. E., et al. Cell age dependent concentration of Escherichia coli divisome proteins analyzed with ImageJ and ObjectJ. Front Microbiol. 6 (JUN), (2015).
- Schneider, C. a., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat. Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
- Sliusarenko, O., Heinritz, J., Emonet, T., Jacobs-Wagner, C. High-throughput, subpixel precision analysis of bacterial morphogenesis and intracellular spatio-temporal dynamics. Mol. Microbiol. 80 (3), 612-627 (2011).
- Ducret, A., Quardokus, E. M., Brun, Y. V. MicrobeJ, a tool for high throughput bacterial cell detection and quantitative analysis. Nat. Microbiol. 1, 16077 (2016).
- Carpenter, A. E., et al. CellProfiler: image analysis software for identifying and quantifying cell phenotypes. Genome Biol. 7 (10), R100 (2006).
- Morales-Soto, N., et al. Preparation, Imaging, and Quantification of Bacterial Surface Motility Assays. J. Vis. Exp. (98), e52338 (2015).
- Paintdakhi, A., et al. Oufti: An integrated software package for high-accuracy, high-throughput quantitative microscopy analysis. Mol. Microbiol. 99 (4), 767-777 (2016).
- de Jong, I. G., Beilharz, K., Kuipers, O. P., Veening, J. -. W. Live Cell Imaging of Bacillus subtilis and Streptococcus pneumoniae using Automated Time-lapse Microscopy. J. Vis. Exp. (53), e1-e6 (2011).
