Indução de diferenciação celular e imagens de células<em> Vibrio parahaemolyticus</em> Células Swimmer e Swarmer

Summary

Este protocolo permite a microscopia de célula única do nadador Vibrio parahaemolyticus diferencialmente diferenciado e células swarmer. O m�odo produz uma popula�o de c�ulas swarmer facilmente dispon�eis para a an�ise de uma �ica c�ula e abrange a prepara�o de culturas de c�ulas, indu�o de diferencia�o de swarmer, prepara�o de amostra e an�ise de imagem.

Abstract

A capacidade de estudar a localização intracelular de proteínas é essencial para a compreensão de muitos processos celulares. Por sua vez, isto requer a capacidade de obter células únicas para microscopia de fluorescência, o que pode ser particularmente desafiador quando imagens de células que existem dentro de comunidades bacterianas. Por exemplo, o agente patogénico humano Vibrio parahaemolyticus existe como células de nadador em forma de bastão curto em condições líquidas que, ao contacto com a superfície, se diferenciam numa subpopulação de células swarmer altamente alongadas, especializadas para crescimento em superfícies sólidas. Este artigo apresenta um método para realizar a análise de microscopia de fluorescência de célula única de V. parahaemolyticus em seus dois estados diferenciais. Este protocolo induz com muita reprodutibilidade a diferenciação de V. parahaemolyticus num ciclo de vida de células mais swarmer e facilita a sua proliferação sobre superfícies sólidas. O método produz flares de células de swarmer diferenciadas que se estendem de tEle borda do enxame-colônia. Notavelmente, na própria ponta do enxame-flares, swarmer células existem em uma única camada de células, o que permite a sua fácil transferência para um microscópio slide e posterior fluorescência microscopia imagiologia de células únicas. Além disso, é apresentado o fluxo de trabalho de análise de imagem para a representação demográfica de sociedades bacterianas. Como prova de princípio, é descrita a análise da localização intracelular de matrizes de sinalização de quimiotaxia em nadadores e células swarmer de V. parahaemolyticus.

Introduction

As bactérias experimentam constantemente mudanças em seu ambiente externo e desenvolveram várias técnicas para mudar e adaptar seu comportamento de acordo. Um desses mecanismos envolve a diferenciação em diferentes tipos de células que melhor complementam o ambiente alterado. A diferenciação muitas vezes envolve grandes mudanças na regulação do ciclo celular, morfologia celular e organização espaciotemporal das células. Um organismo que pode sofrer diferenciação é Vibrio parahaemolyticus . V. parahaemolyticus pertence às Vibrionaceae , que é uma família de proteobactérias que habitualmente habitam água fresca ou salgada. Vibrionaceae são amplamente distribuídos no ambiente e incluem várias espécies que causam infecções do trato intestinal em seres humanos, incluindo também Vibrio cholerae.V. Parahaemolyticus é um organismo dimórfico e é capaz de se diferenciar em dois tipos de células distintas como resposta para acomodar mudançasMeio externo. Em ambientes aquosos, existe como uma célula de nadador em forma de bastão com um único flagelo polar posicionado no antigo pólo da célula. No contato superficial, a diferenciação em uma célula swarmer é acionada. A diferenciação celular de Swarmer envolve duas alterações principais: a morfogénese das células mais vivas através da inibição da divisão celular e a indução de um segundo sistema de flagelos. Isto resulta na formação de uma célula swarmer em forma de bastão peritricos e altamente alongada, que pode continuar o estilo de vida do swarmer, onde os eventos de divisão resultam em células de progenitor swarmer, ou alternativamente diferenciar de volta para as células nadadoras.

Vários fatores têm sido relatados para induzir ou influenciar a diferenciação de swarmer. O estímulo primário parece ser conduzido por mechanosensing onde V. parahaemolyticus usa o flagelo polar como um sensor tátil que detecta a inibição da rotação em contato de superfície, mas vários outros fatores estão envolvidos comoPoço ¹ . No laboratório, a rotação do flagelo polar pode ser artificialmente inibida pela adição de fenamil, que bloqueia a rotação flagelar accionada pelo canal de sódio, induzindo assim a diferenciação do swarmer ² . Além disso, em um estudo anterior, Vibrio alginolyticus foi induzido a enxamear em meio sólido quando as células foram propagadas em meio de crescimento em uma placa de Petri selada com fita de plástico transparente. O papel de filtro saturado com alcali impediu o enxameamento nestas condições, sugerindo assim que um ou mais ácidos voláteis poderiam estar envolvidos na indução do enxame. Assim, vedar a placa de Petri com fita plástica permitiu provavelmente a acumulação de ácidos voláteis, formados como subprodutos do metabolismo celular, dentro do espaço da cabeça da placa. O mesmo efeito foi conseguido quando H ₂ O ₂ foi adicionado ao meio de crescimento em placas de Petri não seladas de modo a produzir artificialmente ácidos voláteis por hidrólise de componentes de meios <supClass = "xref"> 3 ^{, 4 , 5} . No entanto, a identidade de tais ácidos voláteis permanece desconhecida. Além disso, tem sido demonstrado que a disponibilidade excessiva de cálcio ⁶ e limitação de ferro ⁷ aumenta a diferenciação e proliferação de swarmer sobre superfícies sólidas. As células podem ser privadas de ferro por adição do composto 2,2'-Bipyridyl ao meio de crescimento, que tem sido mostrado para influenciar a diferenciação swarmer [ ^8] . Os factores conhecidos para regular a diferenciação são agora implementados na concepção de um protocolo que induz reprodutivamente a diferenciação de V. parahaemolyticus em células swarmer e a sua proliferação em superfícies sólidas de agar.

A diferenciação de V. parahaemolyticus envolve grandes alterações na regulação da divisão celular, morfologia celular e posicionamento de máquinas macromoleculares como flagellA e aparelhos de quimiotaxia – processos que requerem a localização específica de proteínas de acordo com o ciclo celular. Assim, a capacidade de estudar a localização intracelular de tais proteínas é essencial para a compreensão dos processos celulares acima mencionados. Para realizar tais estudos, a microscopia de fluorescência em células individuais é necessária. Isto pode ser particularmente desafiador quando imagens de células que existem dentro de populações bacterianas densas, como é o caso de células swarmer. Tem havido tentativas de induzir a diferenciação de swarmer em meios líquidos, que poderiam potencialmente gerar células individuais para estudos de microscopia. E embora a nível transcricional estas células tenham induzido parcialmente o programa de diferenciação de swarmer, não sofrem as mesmas alterações morfológicas distintas que as células swarmer totalmente diferenciadas crescidas em meio sólido ⁸ . Este trabalho oferece um protocolo robusto e reprodutível de um método para induzir ceLl em uma superfície de ágar. O protocolo produz uma população de células swarmer facilmente acessíveis prontamente disponíveis para microscopia de célula única e análise subsequente. Além disso, o protocolo permite estudos de localização de proteínas fluorescentemente marcadas em ambos os tipos de células nadadoras e swarmer (seções 1, 2, 3, 4). Além disso, o protocolo descreve o fluxo de trabalho subseqüente sobre como processar e analisar os dados gerados a partir de experiências de microscopia de fluorescência, o que permite a análise demográfica de sociedades bacterianas (seção 5).

Protocol

1. Preparação de células V. parahaemolyticus electro-competentes e electroporação de ADN plasmídico em células nadadoras NOTA: A seguinte secção do protocolo permite a preparação de células electro-competentes e a subsequente electroporação de ADN plasmídico em células nadadoras. Este passo é importante se as proteínas fluorescentes estiverem sendo ectopicamente expressas a partir de um plasmídeo. Eliminar as células de V. parahae…

Representative Results

Indução de diferenciação e geração de colônias de enxames A Figura 1 proporciona um esquema dos passos importantes envolvidos na produção de colónias em enxame de V. parahaemolyticus ( Figura 1A-C ). Uma cultura de nadador foi manchada em agar-enxerto e incubada a 24 o C, induzindo diferenciação e proliferação de swarmer sobre a superfície sólida de agar. Uma i…

Discussion

Este artigo relata um método para a obtenção de imagens por microscopia de células de V. parahaemolyticus swarmer, seguido por análises a jusante destinadas a resolver e quantificar a localização subcelular e outras características das proteínas marcadas com fluorescência estudadas. Apesar de existirem várias ferramentas para o processamento e análise de imagens em microscopia ^{14 , 15 , 16 ,} <sup…

Materials

Media components
LB-medium	Roth	X968.3
Difco Agar, granulated	BD	214510	For preparation of LB agar with LB-medium
Difco Heart Infusion Agar	BD	244400	For preparation of HI agar swarming plates
Agarose NEEO, ultra quality	Roth	2267.3	For preparation of microscopy agarose pads
Name	Company	Catalog Number	Comments
Additives
L-arabinose	Roth	5118.3	Used to induce pBAD derivatives
2,2`-Bipyridyl	Sigma Aldrich	D216305-25G	For preparation of HI agar swarming plates
Calcium chloride dihydrate	Roth	5239.1	For preparation of HI agar swarming plates
Ampicillin sodium salt	Roth	K029.3
Chloramphenicol	Roth	3886.3
PBS buffer	–	–	Standard recipe for Phosphate-buffered saline
D(+) Sucrose	Roth	4621.1	For preparation of electrocompetent cells
Glycerol	Roth	3783.5	For preparation of electrocompetent cells
Name	Company	Catalog Number	Comments
Hardware
Petri dish 150x20mm with cams	Sarstedt	82.1184.500	For preparation of HI agar swarming plates
kelvitron t (B 6420)	Heraeus	–	Used for drying HI agar swarming plates
Gene Pulser Xcell Microbial System	BioRad	1652662	Used for elctroporation of plasmid DNA
Name	Company	Catalog Number	Comments
Software
MetaMorph Offline (version 7.7.5.0)	Molecular Devices	–	Used for microscopy image analysis
Excel	Microsoft	–	Used for microscopy data analsis