تحريض التمايز الخلوي والتصوير خلية واحدة من<em> فيبرايو بارايموليتيكوس</em> السباح و سوارمر الخلايا
Summary
هذا البروتوكول يتيح المجهر خلية واحدة من فيبريو باربرايموليتيكوس السباح متميزة متميزة وخلايا أسوأ. وتنتج هذه الطريقة مجموعة من الخلايا الداعمة المتاحة بسهولة لتحليل خلية واحدة ويغطي إعداد الثقافات الخلية، تحريض التمايز سوبيرمر، وإعداد العينات، وتحليل الصور.
Abstract
القدرة على دراسة توطين الخلايا من البروتينات ضروري لفهم العديد من العمليات الخلوية. في المقابل، وهذا يتطلب القدرة على الحصول على خلايا واحدة للمجهر مضان، والتي يمكن أن تكون صعبة بشكل خاص عندما خلايا التصوير التي توجد داخل المجتمعات البكتيرية. على سبيل المثال، المسببة للأمراض البشرية فيبريو باراهايموليتيكوس موجود كخلايا السباح القصيرة على شكل قضيب في الظروف السائلة التي على سطح الاتصال التفريق في سوبوبولاتيون من خلايا أسد ممدود للغاية المتخصصة للنمو على الأسطح الصلبة. تقدم هذه الورقة طريقة لأداء تحليل خلية واحدة مضان المجهري من V. بارايموليتيكوس في دولتي التفاضلية. هذا البروتوكول استنساخا جدا يستحث التمايز من V. بارايموليتيكوس في الخلية الدافع حياة دورة ويسهل انتشارها على الأسطح الصلبة. تنتج هذه الطريقة مشاعل الخلايا المتمايزة الأيسر تمتد من tوقال انه حافة مستعمرة سرب. ومن الجدير بالذكر، في طرف جدا من سرب مشاعل، توجد خلايا أسوأ في طبقة واحدة من الخلايا، والذي يسمح لنقلها السهل إلى شريحة المجهر والتصوير المجهري مضان اللاحقة من خلايا واحدة. بالإضافة إلى ذلك، يتم عرض سير العمل لتحليل الصور للتمثيل الديمغرافي للمجتمعات البكتيرية. وكدليل على المبدأ، يتم وصف تحليل توطين الخلايا من الكيميائي يشير صفائف في السباح والخلايا الداعمة من V. بارايموليتيكوس.
Introduction
البكتيريا باستمرار تجربة التغييرات على البيئة الخارجية، وقد وضعت العديد من التقنيات لتغيير وتكييف سلوكهم وفقا لذلك. واحدة من هذه الآلية تنطوي على التمايز إلى أنواع الخلايا المتميزة التي تكمل بشكل أفضل البيئة المتغيرة. التمايز غالبا ما ينطوي على تغييرات كبيرة في تنظيم دورة الخلية، مورفولوجيا الخلية، والتنظيم الزماني الزماني للخلايا. أحد الكائنات الحية التي يمكن أن تخضع للتمايز هو فيبرايو بارايموليتيكوس . V. بارايموليتيكوس ينتمي إلى فيبريوناسي ، الذي هو عائلة من بروتيوباكتيريا التي تسكن عادة المياه العذبة أو المالحة. يتم توزيع فيبريوناسي على نطاق واسع في البيئة وتشمل العديد من الأنواع التي تسبب التهابات المسالك المعوية في البشر، بما في ذلك أيضا ضمة الكوليرا. باراهايموليتيكوس هو كائن حيوي و قادر على التفريق في نوعين مختلفين من الخلايا كرد فعل لاستيعاب التغيرات فيالوسط الخارجي. في البيئات المائية، فإنه موجود كخلايا السباح القصيرة على شكل قضيب مع ساق القطبية واحدة المتمركزة في القطب الخلية القديمة. عند الاتصال السطح، يتم تشغيل التمايز في خلية سرب. سوارمر تمايز الخلايا ينطوي على اثنين من التغييرات الرئيسية: سربار خلية التشكل من خلال تثبيط انقسام الخلايا، وتحريض نظام سوط الثاني. ويؤدي ذلك إلى تكوين خلية أسماك ذات شكل قضيب بيريتريشوس وممدود للغاية، والتي يمكن أن تستمر إما في نمط حياة القطيع، حيث تؤدي أحداث الانقسام إلى خلايا أسلاف أسلاف، أو تفرق في الخلف إلى خلايا السباح.
وقد تم الإبلاغ عن عدة عوامل لتحفيز أو التأثير على التمايز أسوأ. ويبدو أن الحافز الأساسي يقودها ميكانوسنسينغ حيث V. بارايموليتيكوس يستخدم العلم القطبي كمستشعر اللمس الذي يكشف عن تثبيط دوران على اتصال السطح، ولكن هناك عدة عوامل أخرى تشارك كماحسنا 1 . في المختبر، دوران الساق القطبية يمكن أن يتم تثبيطها بشكل مصطنع بإضافة فيناميل، الذي يحجب دوران الصفيحة التي تحركها الصوديوم، مما يؤدي إلى تمايز الأسوار 2 . وعلاوة على ذلك، في دراسة سابقة، فيبريو ألجينوليتيكوس كان يحرض على سرب على وسائل الاعلام الصلبة عندما تم نشر الخلايا على وسط النمو في طبق بتري مختومة بشريط بلاستيكي واضح. ومنعت ورقة المرشح المشبعة بالقلويات من الاحتشاد في ظل هذه الظروف، مما يوحي بأن واحدا أو أكثر من الأحماض المتطايرة قد يكون ضالعا في تحريض الاحتكاك. وبالتالي، فإن ختم طبق بتري مع الشريط البلاستيك المرجح للسماح لتراكم الأحماض المتطايرة، التي شكلت من قبل منتجات ثانوية من التمثيل الغذائي الخلوي، داخل مساحة الرأس من لوحة. وقد تحقق نفس التأثير عندما أضيف H2 O 2 إلى وسط النمو في أطباق بيتري غير مختومة من أجل إنتاج الأحماض المتطايرة بشكل مصطنع عن طريق هدروليسينغ المكونات الإعلامية <supكلاس = "كريف"> 3 ، 4 ، 5 . ومع ذلك، لا تزال هوية هذه الأحماض المتطايرة غير معروفة. وعلاوة على ذلك، فقد تبين أن توافر الفائض من الكالسيوم 6 والحد من الحديد 7 على حد سواء تعزيز التمايز أسوأ وانتشار على الأسطح الصلبة. يمكن تجويع الخلايا للحديد بإضافة مركب 2،2'-بيبيريديل إلى وسط النمو، والذي ثبت أنه يؤثر على تمايز الأسوار 8 . يتم الآن تنفيذ العوامل المعروفة لتنظيم التمايز في تصميم بروتوكول الذي يحفز على نحو متكاثر V. التمايز بارايموليتيكوس في الخلايا الأبقار وانتشارها على السطوح أجار الصلبة.
V. بارايموليتيكوس التمايز ينطوي على تغييرات كبيرة في تنظيم انقسام الخلايا، مورفولوجيا الخلوية، وتحديد المواقع من الآلات الجزيئية مثل فلاجيلأ و الكيميائي الأجهزة – العمليات التي تتطلب كل توطين محددة من البروتينات وفقا لدورة الخلية. وبالتالي، فإن القدرة على دراسة توطين الخلايا من هذه البروتينات أمر ضروري لفهم العمليات الخلوية المذكورة أعلاه. من أجل إجراء مثل هذه الدراسات مضان المجهري على خلايا واحدة مطلوب. هذا يمكن أن يكون تحديا بشكل خاص عندما خلايا التصوير الموجودة داخل السكان البكتيرية الكثيفة، كما هو الحال بالنسبة للخلايا أسوأ. كانت هناك محاولات للحث على التمايز أسوأ في وسائل الإعلام السائل، والتي يمكن أن تولد خلايا واحدة للدراسات المجهري. وعلى الرغم من أن على مستوى النسخي هذه الخلايا قد تسببت جزئيا برنامج تمايز أسراب، فإنها لا تخضع لنفس التغييرات المورفولوجية متميزة كما خلايا سربار متباينة تماما نمت على المتوسطة الصلبة 8 . تقدم هذه الورقة بروتوكول قوي وقابلة للتكرار من طريقة للحث على سربار مليرة لبنانية التمايز على سطح أجار. بروتوكول ينتج السكان من الخلايا التي يسهل الوصول إليها بسهولة أكثر سربار متاحة بسهولة للمجهر الخلية واحدة والتحليل اللاحق. وعلاوة على ذلك، بروتوكول تمكن دراسات التعريب من البروتينات فلورزنتلي المسمى في كل من السباح وأنواع الخلايا أسوأ (أقسام 1، 2، 3، 4). بالإضافة إلى ذلك، يصف البروتوكول سير العمل اللاحقة على كيفية معالجة وتحليل البيانات التي تم إنشاؤها من التجارب المجهري مضان، والذي يسمح للتحليل الديموغرافي للمجتمعات البكتيرية (القسم 5).
Protocol
Representative Results
Discussion
هذه الورقة تقارير طريقة التصوير المجهري للخلايا بارايموليتيكوس V. بارايموليتيكوس ، تليها التحليلات المصب تهدف إلى حل وتحديد توطين تحت الخلوية وغيرها من الميزات من البروتينات فلورزنتلي المسمى درس. على الرغم من وجود العديد من الأدوات لمعالجة الصور المجهرية وتحل…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وأيد هذا العمل جمعية ماكس بلانك.
Materials
| Media components | |||
| LB-medium | Roth | X968.3 | |
| Difco Agar, granulated | BD | 214510 | For preparation of LB agar with LB-medium |
| Difco Heart Infusion Agar | BD | 244400 | For preparation of HI agar swarming plates |
| Agarose NEEO, ultra quality | Roth | 2267.3 | For preparation of microscopy agarose pads |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Additives | |||
| L-arabinose | Roth | 5118.3 | Used to induce pBAD derivatives |
| 2,2`-Bipyridyl | Sigma Aldrich | D216305-25G | For preparation of HI agar swarming plates |
| Calcium chloride dihydrate | Roth | 5239.1 | For preparation of HI agar swarming plates |
| Ampicillin sodium salt | Roth | K029.3 | |
| Chloramphenicol | Roth | 3886.3 | |
| PBS buffer | – | – | Standard recipe for Phosphate-buffered saline |
| D(+) Sucrose | Roth | 4621.1 | For preparation of electrocompetent cells |
| Glycerol | Roth | 3783.5 | For preparation of electrocompetent cells |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Hardware | |||
| Petri dish 150x20mm with cams | Sarstedt | 82.1184.500 | For preparation of HI agar swarming plates |
| kelvitron t (B 6420) | Heraeus | – | Used for drying HI agar swarming plates |
| Gene Pulser Xcell Microbial System | BioRad | 1652662 | Used for elctroporation of plasmid DNA |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Software | |||
| MetaMorph Offline (version 7.7.5.0) | Molecular Devices | – | Used for microscopy image analysis |
| Excel | Microsoft | – | Used for microscopy data analsis |
References
- McCarter, L., Hilmen, M., Silverman, M. Flagellar dynamometer controls swarmer cell differentiation of V. parahaemolyticus. Cell. 54 (3), 345-351 (1988).
- Kawagishi, I., Imagawa, M., Imae, Y., McCarter, L., Homma, M. The sodium-driven polar flagellar motor of marine Vibrio as the mechanosensor that regulates lateral flagellar expression. Mol. Microbiol. 20 (4), 693-699 (1996).
- Ulitzur, S. Induction of swarming in Vibrio parahaemolyticus. Arch. Microbiol. 101 (4), 357-363 (1974).
- Ulitzur, S. Effect of temperature, salts, pH, and other factors on the development of peritrichous flagella in Vibrio alginolyticus. Arch. Microbiol. 104 (3), 285-288 (1975).
- Ulitzur, S. The mechanism of swarming of Vibrio alginolyticus. Arch. Microbiol. 104 (1), 67-71 (1975).
- Gode-Potratz, C. J., Chodur, D. M., McCarter, L. L. Calcium and iron regulate swarming and type III secretion in Vibrio parahaemolyticus. J. Bacteriol. 192 (22), 6025-6038 (2010).
- McCarter, L., Silverman, M. Iron regulation of swarmer cell differentiation of Vibrio parahaemolyticus. J. Bacteriol. 171 (2), 731-736 (1989).
- Gode-Potratz, C. J., Kustusch, R. J., Breheny, P. J., Weiss, D. S., McCarter, L. L. Surface sensing in Vibrio parahaemolyticus triggers a programme of gene expression that promotes colonization and virulence. Mol. Microbiol. 79 (1), 240-263 (2011).
- Heering, J., Ringgaard, S. Differential Localization of Chemotactic Signaling Arrays during the Lifecycle of Vibrio parahaemolyticus. Front Microbiol. 7 (November), 1-12 (2016).
- Cameron, T. A., Anderson-Furgeson, J., Zupan, J. R., Zik, J. J., Zambryski, P. C. Peptidoglycan synthesis machinery in Agrobacterium tumefaciens during unipolar growth and cell division. mBio. 5 (3), (2014).
- Development Core Team, R. F. F. S. C. R: A Language and Environment for Statistical Computing. R Foundation for Statistical Computing. 1, 2673 (2008).
- Ringgaard, S., et al. ParP prevents dissociation of CheA from chemotactic signaling arrays and tethers them to a polar anchor. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (2), E255-E264 (2014).
- Ringgaard, S., Schirner, K., Davis, B. M., Waldor, M. K. A family of ParA-like ATPases promotes cell pole maturation by facilitating polar localization of chemotaxis proteins. Genes Dev. 25, 1544-1555 (2011).
- Vischer, N. O. E., et al. Cell age dependent concentration of Escherichia coli divisome proteins analyzed with ImageJ and ObjectJ. Front Microbiol. 6 (JUN), (2015).
- Schneider, C. a., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat. Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
- Sliusarenko, O., Heinritz, J., Emonet, T., Jacobs-Wagner, C. High-throughput, subpixel precision analysis of bacterial morphogenesis and intracellular spatio-temporal dynamics. Mol. Microbiol. 80 (3), 612-627 (2011).
- Ducret, A., Quardokus, E. M., Brun, Y. V. MicrobeJ, a tool for high throughput bacterial cell detection and quantitative analysis. Nat. Microbiol. 1, 16077 (2016).
- Carpenter, A. E., et al. CellProfiler: image analysis software for identifying and quantifying cell phenotypes. Genome Biol. 7 (10), R100 (2006).
- Morales-Soto, N., et al. Preparation, Imaging, and Quantification of Bacterial Surface Motility Assays. J. Vis. Exp. (98), e52338 (2015).
- Paintdakhi, A., et al. Oufti: An integrated software package for high-accuracy, high-throughput quantitative microscopy analysis. Mol. Microbiol. 99 (4), 767-777 (2016).
- de Jong, I. G., Beilharz, K., Kuipers, O. P., Veening, J. -. W. Live Cell Imaging of Bacillus subtilis and Streptococcus pneumoniae using Automated Time-lapse Microscopy. J. Vis. Exp. (53), e1-e6 (2011).
