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JoVE Journal Cancer Research
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Cancer Research

Identifizierung und Charakterisierung von metastasierendem Faktoren durch Gentransfer in die neuartige RIP-Tag; RIP-tva Mausmodell

Published: October 16, 2017 doi: 10.3791/55890
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Pathology and Laboratory Medicine, Weill Cornell Medicine

Summary

Wir präsentieren ein Protokoll, um eine neuartige somatische Gentherapie-Transfer-System unter Verwendung RIP-Tag zu demonstrieren; RIP-tva Maus-Modell für die Funktion von Genen in Metastasen zu untersuchen. Die Vogelgrippe Retroviren liefern wir Intracardiacally um Gentransfer in Pre-maligne, nicht-invasive Läsionen des Pankreas β-Zellen bei Erwachsenen Mäusen zu gewährleisten.

Abstract

Metastasiertem Krebs entfallen 90 % der Todesfälle bei Patienten mit soliden Tumoren. Es ist dringend notwendig, die Treiber von Krebsmetastasen besser zu verstehen und neue therapeutische Targets zu identifizieren. Um molekularen Ereignisse zu untersuchen, die das Fortschreiten von primären Krebs, Metastasen zu fahren, haben wir eine Bitransgenic-Maus-Modell, RIP-Tag entwickelt; RIP-tva. In diesem Mausmodell treibt die Ratte Insulin Promotor (RIP) Ausdruck der SV40 T-Antigen (Tag) und der Rezeptor für Untergruppe ein Virus der Vogelgrippe noch (tva) in pankreatische β-Zellen. Die Mäuse entwickeln neuroendokrine Tumoren der Bauchspeicheldrüse mit 100 % Penetranz durch klar definierte Stadien, die ähnlich wie menschliche Tumorgenese mit Stufen einschließlich Hyperplasie, Adenom, Angiogenese und invasives Karzinom. Weil RIP-Tag; RIP-tva Mäuse entwickeln keine Metastasen, genetische Veränderung, die Metastasierung fördern leicht identifizierbar. Somatische Gentransfer in tva exprimierenden, wuchernden pankreatische β prämaligne Läsionen durch intrakardiale Injektion von Vogelgrippe Retroviren beherbergen die gewünschte genetische Veränderung erreicht wird. Ein Titer von > 1 x 108 infektiösen Einheiten pro ml als angemessen für in-Vivo -Infektion angesehen. Darüber hinaus können Vogelgrippe Retroviren infizieren Zelllinien aus Tumoren in RIP-Tag; RIP-tva Mäuse mit hohem Wirkungsgrad. Die Zell-Linien können auch verwendet werden, metastasierendem Faktoren charakterisieren. Hier zeigen wir wie Sie nutzen dieses Mausmodell und Zell-Linien, um die Funktionen von Kandidatengenen im Tumor Metastasen zu beurteilen.

Introduction

Die meisten Krebsarten entstehen durch somatische Mutationen 1. Konventionelle gentechnisch veränderter Mausmodelle (GEMM) haben bedeutende Einblicke in den Beitrag von bestimmten genetischen Veränderungen, die auf Tumorgenese 2zur Verfügung gestellt. Sie haben jedoch mehrere Einschränkungen. Der größte Nachteil dieser Modelle ist, dass sie nicht die sporadische Natur der Tumorbildung im Menschen replizieren, in dem nur einige Zellen innerhalb eines Gewebes genetische Veränderungen erwerben. Die Mutationen in transgenen und Knockout-Mäuse sind auch Keimbahn mit auf die Entwicklung auswirken. Darüber hinaus ist erzeugen diese Maus-Modellen teuer und zeitaufwändig.

Metastasierung ist ein wichtiges Thema im Bereich der Krebs. Modellierung von Metastasen war schwierig in GEMM. Spontane Metastasierung ist selten in der Maus. Penetranz ist variabel und Latenz ist lang in GEMM Metastase 3. Experimentelle Metastasierung Modelle beschäftigen direkte Injektion von Zellen in den Blutkreislauf von Mäusen, so dass die ersten Schritte in der metastasierten Kaskade beseitigt werden.

Um einige der oben genannten Einschränkungen bei der Untersuchung von metastasierendem Faktoren in Mausmodellen zu überwinden, haben wir eine Bitransgenic-Maus-Modell, RIP-Tag entwickelt; RIP-tva4. Die Strategie basiert auf der Kombination der Verwendung von einem Mausmodell hoch synchronisiert Tumor Progression, RIP-Tag 5, und der Rezeptor für Vogelgrippe noch Untergruppe-A-Virus, tva 6,7. Dieses RIP-Tag; RIP-tvaMaus-Modell ermöglicht es Gene somatisch zu einem einzigen Bitransgenic Maus Stamm eingeführt werden. Mit dem SV40 T Antigen unterdrücken die Tumor unterdrückende Funktionen der Rb und p53 entwickeln Mäuse neuroendokrine Pankreastumoren in ähnlicher Weise zu menschlichen Tumorgenese mit Stufen einschließlich Hyperplasie, Adenom, Angiogenese und invasives Karzinom. Diese RIP-Tag -Modell wurde sehr lehrreich für unser Verständnis der Kennzeichen von Krebs, nicht beschränkt auf neuroendokrine Tumoren der Bauchspeicheldrüse. Es hat auch in präklinischen Studien 8eingesetzt.

Wir präsentieren ein Protokoll für somatische Gentransfer durch Injektion von Vogelgrippe Retroviren Intracardiacally in RIP-Tag; RIP-tva Mäuse. Erfolgreiche Infektion mit RCASBP-abgeleitete Geflügelpest Retroviren erfordert aktiv wuchernden Zielzellen. Daher wählten wir RIP-Tag; RIP-tva Mäuse 7 Wochen alt, wann Hyperplasie entwickelt sich bei etwa 50 % von den pankreatischen kleinen Inseln. Linke ventrikuläre intrakardiale Injektion von hohen Titer Viren ist erforderlich, um eine Infektion Wirkungsgrad von 10-20 % 4. Diese Lieferung Methode reduziert die signifikante Verdünnung der Viruspartikel im Umlauf bevor Viren pankreatische kleinen Inseln erreichen.

Mit diesem Ansatz haben wir bereits gezeigt, dass Bcl-xL Krebsmetastasen unabhängig von seinen Anti-Apoptotic Funktion 4,9 fördert. Diese Anti-apoptotische unabhängig metastasierendem Funktion wurde nicht beobachtet, wenn Bcl-xL über ein Transgen in allen pankreatische β-Zellen im gesamten tumorigenic Ontogenese in der RIP-Tag zum Ausdruck kam; RIP-Bcl-xL Maus Modell 10. Deshalb bietet unsere Maus-Modell eine einmalige Gelegenheit, zu identifizieren und zu charakterisieren, Gene Funktionen ausgedrückt in einem späteren Stadium der Tumorgenese. Denn 2-4 % der Inseln entwickeln sich zu Tumoren in der RIP-Tag; RIP-tva Bitransgenic Mäuse ohne Virusinfektion und nicht alle prämaligne Läsionen mit der RCASBP abgeleitete Geflügelpest Retroviren infiziert sind, nur die Faktoren, die einen selektiven Vorteil über den natürlichen Verlauf der Tumorgenese konferieren identifiziert werden können. Insbesondere werden metastasierendem Faktoren am leichtesten durch diese Methode erkannt werden, weil Metastasen in Pankreas Lymphknoten oder anderen Organen nicht normalerweise in RIP-Tag tritt; RIP-tva Mäuse.

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Protocol

Ethik Erklärung: Experimente an Tieren wurden durchgeführt in Übereinstimmung mit den Richtlinien und Vorschriften, die vom Institute for Animal Care und Nutzung Ausschuss der Weill Cornell Medizin.

1. Auswahl der Vogelgrippe retroviralen Vektoren (RCASBP A-based oder RCANBP(A)-based)

  • Vektoren von Rous Sarkom-Virus 11 abgeleitet wurde. Vogelgrippe retrovirale Vektoren können cDNAs liefern (≤ 2,5 kb), kurze Haarnadel RNAs (ShRNAs), Micro-RNAs (MiRNAs) und andere forensisches RNAs. Die im Handel erhältlichen Vektoren in Materialien aufgeführt sind und andere müssen direkt von den Autoren angefordert werden.
  • , Gene von Interesse overexpress, verwenden Sie eine der folgenden Vektoren, RCASBP(A) 12 ( Abbildung 1A), RCAS-X ( Abbildung 1 b), RCAS-Y 13 ( Abbildung 1), RCASBP-Y DV 14 oder anderen ALV-A-Vektoren (https://home.ncifcrf.gov/hivdrp/RCAS/mice.html).
  • Gene von Interesse von ShRNA klopfen, verwenden Sie eine der folgenden Vektoren: RCAN-X DV 15 oder RCAS RNAi 16.
  • , MiRNAs overexpress, RCAS MiR Vektor zu generieren, wie unter 17.
  • Transformation in E. Coli und DNA Anforderung.
  • Verwandeln vorzugsweise DNA in Stbl2 oder Stbl3 zuständigen Zellen, die einzigartige Genotyp, direkte Wiederholung und retrovirale Sequenzen zu stabilisieren. Reinigen von Plasmid-DNA mit Hilfe einer Methode, die reine, erbringt Transfektion Grade DNA. 5 µg DNA braucht man mit minimalen Konzentration von 0,1 µg/µl.

2. Virale Verbreitung in Huhn-Fibroblasten-DF1-Zell-Linie

  1. die Verwendung von gefiltertem Pipettenspitzen für Zellkultur erforderlich ist, um virale Kreuz-Kontamination zu verhindern, dass Aktien 18.
  2. Pflegen DF1 Zellen in 6 cm Schüssel mit Wachstum Medium (DMEM mit hoher Glucose, 10 % fötalen Rinderserum, 6 mM (Endkonzentration) L-Glutamin, 10 Einheiten/ml Penicillin, 10 µg/ml Streptomycin) 37 o C und 5 % CO 2. Wenn DF1 Zellen aus gefrorenen Vorräte frisch aufgetaut sind, Kultur sie für mindestens 3 Tage vor Transfektion.
  3. Vor Transfektion, Tageskarte DF1 Zellen in der Kulturschale 6 cm Gewebe so, dass sie 30-50 % Zusammenfluss bei der Transfektion werden.
  4. Verdünnen 5 µg reines virale DNA mit DMEM (ohne Serum, Penicillin und Streptomycin) auf ein Gesamtvolumen von 150 µl in einem Microcentrifuge Schlauch in einer Gewebekultur Kapuze.
  5. Hinzufügen 30 µL des Superfect direkt in die verdünnte DNA-Röhre, Vortex diese Mischung für 10 s; lassen Sie die Mischung bei Raumtemperatur für ca. 5-10 min in der Gewebekultur hood Transfektion-Komplex-Bildung zu ermöglichen.
  6. Während Komplexbildung stattfindet, sanft Aspirieren Wachstumsmedium von DF1-Zelle-Kulturschale und sorgfältig waschen Zellen mit 4 ml PBS - / -.
  7. Wachstum Pipettieren 5 ml Medium (mit Serum und Antibiotika); 4 ml auf eine Falcon-Röhrchen für den nächsten Schritt; speichern und fügen Sie den Rest von 1 ml Wachstumsmedium für die Transfektion komplexe. Mischen Sie, indem Sie zweimal auf und ab pipettieren und sofort übertragen Sie die ganze Transfektion komplexe auf DF1-Zellen. Wirbel um sicherzustellen, dass die Zellschicht bedeckt ist; inkubieren Sie für 2-3 Stunden bei 37 o C.
  8. Aspirieren Sie die Transfektion Mischung waschen Zellen mit 4 ml PBS - /-; 4 ml frisches Wachstumsmedium (mit Serum und Antibiotika) hinzufügen; zurück Zellen in einem Inkubator 37 o C.
  9. Wenn Zellen Konfluenz erreichen, passage Zellen (transiente Expression kann geprüft werden 48 bis 72 h nach Transfektion).
  10. Weiterhin bestehen Zellen für ca. 7 Tage, bis alle Zellen vermutlich infiziert sind; virale DNA-Integration mittels PCR zu testen und bestimmen Proteinexpression durch westliche Beflecken; und Einfrieren von Zellen in DMEM Medium mit 10 % DMSO und 20 % fötalen Rinderserum.

3. In Vivo Infektion des RIP-Tag; RIP-tva Mäuse

  1. Virus Sammlung und Konzentration
    Verwendung frisch konzentriert Viren für in-Vivo-Infektion. Der Titer von Viren in 4 o C innerhalb einer Woche gehalten wird nicht wesentlich verringert. Jedoch angezeigt eingefrorenen aliquoten virale Lager 10-divisibel reduzierten Titer nach Auftauen.
    1. Expand Virus-Produzent DF1 Zellen in 15 cm Gerichte abhängig von der Menge des Virus benötigt. Vorbereitung in Vivo Maus Infektion, durchschnittlich eine Platte per Mausklick.
    2. Pre-chill-Rotor (z. B. SW28), den Swing-Eimer, und der Ultrazentrifuge Maschine 4 o C.
    3. Sammeln Überstand von konfluierende 15-cm-Gerichte. Entfernen Sie die Zelle Ablagerungen von Lowspeed Zentrifugation bei 1.650 x g für 10 min bei 4 o C.
    4. Transfer den viralen Überstand zum Ultrazentrifugen Röhren (Polyallomer Zentrifuge Röhren). Spin in einer Ultrazentrifuge für 1,5 Stunden bei 95.400 x g 4 o C. Für Beckman XL-100 Ultrazentrifugen Maschine verwenden Accel: 1; Verzögerungszeit: 1 Einstellungen.
    5. Entfernen Überstand von Ultrazentrifugen Röhren so viel wie möglich. Ultrazentrifugen Rohr zu endgültigen 100 µl virale Aussetzung aus einem 15 cm Schüssel fügen Sie PBS ohne Calcium und Magnesium (PBS - / - hinzu). Die Rohre mit Parafilm abdecken. Aufschwemmen der unsichtbare virale Pellet durch aufschütteln der Ultrazentrifuge für 2 min bei mittlerer Geschwindigkeit Rohre.
    6. Rock Ultrazentrifugen Schläuche am 4 o C für eine Stunde zu übernachten.
    7. Übertragen die virale Aussetzung zu einem Microcentrifuge Schlauch. Die virale Suspension vor Injektion in Mäusen auf Raumtemperatur aufwärmen.
  2. Virale Titer Bestimmung.
    Für jedes neue virale zu bauen muss virale Titer vor dem in-Vivo-Infektion festgestellt werden.
    1. Samen DF1 Zellen in alle Vertiefungen einer Gewebekultur 12-Well-Platte (Vorschlag: 2 x 10 4 Zellen/Brunnen, 1 ml/Brunnen), so dass sie 30 % Zusammenfluss zum Zeitpunkt der Infektion. Ein 12-Well-Platte für eine virale Titer-Bestimmung erforderlich ist.
    2. Stellen eine Reihe von 10-divisibel Verdünnungen von der viralen überstand im Wachstumsmedium wie folgt:
      1. Mix 5 µl virale überstand mit 495 µl Wachstumsmedium für die 10 2 Verdünnung in einem Microcentrifuge Schlauch. Kurz ein paar Sekunden vortexen.
      2. Nehmen 40 µl vom 10. 2 Verdünnung in 360 µl Wachstumsmedium in einem Microcentrifuge Schlauch für die 10 3-Verdünnung. Kurz ein paar Sekunden vortexen.
      3. Für 10 folgen Schritt 3.2.2.2 4 und 10 5 Verdünnung.
      4. Set 5 6 ml Polystyrol Rohre. Aliquoten 2,25 ml Wachstumsmedium pro Rohr und Label Ihnen 10 6 10 7 10 8 10 9, 10 10, bzw..
      5. Mix 0,25 ml vom 10. 5 Verdünnung mit 2,25 ml Wachstumsmedium in 6 ml Polystyrol Röhrchen für die 10 6-Verdünnung. Kurz ein paar Sekunden vortexen.
      6. Folgen Schritt 3.2.2.5 für 10 7 10 8 10 9 und 10 10 Verdünnung.
      7. Entfernen der ursprüngliche Kulturmedium von DF1 Zellen auf der 12-Well-Platte. Setzen Sie 1 ml verdünnt Viren jeweils gut in dupliziert (nicht infizierte, 10 10 10 6 IU/ml).
    3. Zellen für mindestens 7 Tage wachsen (Trypsinzation bei Bedarf ausführen) zu ermöglichen. Sammeln Sie Zellen, um DNA und überprüfen Sie das Vorhandensein der viralen DNA mittels PCR zu isolieren, wie in beschrieben " 6. PCR-Protokolle ". Wenn diese virale Titer 10 8 infektiösen Einheiten pro ml (IU/ml), eine positive 398 bp PCR-Produkte von RCASBP zu beobachten, mit der DNA von Zellen mit 10 8 10 6 IU/ml Viren, aber nicht von nicht infizierten Zellen oder Zellen mit 10 10 10 9 IU/ml Viren. Ein Titer von > 1 x 10 8 infektiösen Einheiten pro ml sollte verwendet werden, für in Vivo Infektion.
  3. Intrakardiale Injektion
    Hemizygous RIP-Tag Mäuse, nicht homozygot Mäuse sind in dieser Studie verwendet. Hemizygous RIP-Tag Mäuse entwickeln neuroendokrine Pankreastumoren rund 10 ~ 12 Wochen alt, während homozygote Mäuse eine kürzere Tumor-Latenz haben. Da Zellproliferation erforderlich für den Einbau der virale cDNA in der Host ist Genom, 7 Wochen alte RIP-Tag; RIP-tva Mäuse mit hyperplasic pankreatischer β-Zellen eingesetzt. Bitte beachten Sie, dass die meisten normale β-Zellen nicht bei Erwachsenen Mäusen vermehren werden.
    1. Einsatz 7 Wochen alten RIP-Tag; RIP-tva Mäuse in einem reinen C57BL/C-Hintergrund für die Experimente.
    2. Anesthetize Maus mit einer Ketamin/Xylazin-Kombination (150 mg/kg; 15 mg/kg). Hitze-Unterstützung verwenden, um die Maus Körpertemperatur während der gesamten Dauer der Narkose.
    3. Gelten Auge Schmiermittel für beide Augen, Hornhaut Austrocknen zu verhindern.
    4. Rasieren Haar aus der Brusthöhle RIP-Tag; RIP-tva Mäuse. Position der Maus auf dem Rücken mit der Brust nach oben. Eine Zehe-Prise wird durchgeführt, um das Tier für nicht-Reaktion auf Vollnarkose Effekt bestätigen beobachten.
    5. Die vorderen Gliedmaßen zu verlängern und mit Bändern zu sichern. Mark Maus ' s Brust für die Injektion. Markieren Sie eine Standort in der Mitte zwischen der sternalen Kerbe und Top Xyphoid Prozesses und leicht links (anatomischen) des Brustbeins ( Abbildung 2).
    6. Peeling die vorderen Brustwand mit einer Povidon-Jod-Peeling oder ein Chlorhexidin-Peeling von einem 70 % Isopropylalkohol oder 70 % igem Ethanol gefolgt getränkten Gaze Schwamm.
    7. Ziehen 50 µl von Luft in einem sterilen 28 g ½ Insulin Spritze um Raum zwischen dem Kolben und dem Meniskus einer 500 µL Spritze zu erstellen und dann erarbeiten 100 µl der Viren. Den Luftraum ohne Flüssigkeit an der Wand ist entscheidend für die kardiale Puls sehen.
    8. Halten Sie Nadel aufrecht. Halten Sie Haut der Maus mit einer Hand straff zu, und stechen Sie die Nadel an der markierten Stelle. Erscheint ein helle rote Puls von Blut in die Spritze, voran die Nadel zu stoppen und die Tiefe der Nadel in der Maus mit einer Hand fixieren.
    9. Die anderen Hand vorsichtig verwenden und drücken Sie langsam den Kolben, um virale Aussetzung (~ 100 µl Volumen) über einen Zeitraum von 60 Sekunden zu liefern. 10-20 µl zu liefern, wann immer sehen einen hellen roten Puls von Blut in die Spritze. Kontinuierliche Eingang des roten sauerstoffreiches Blut in die transparente Nadel Nabe zeigt die richtige Positionierung der Nadel in die linke Herzkammer.
    10. Nach dem letzten Stoß den Kolben, um virale Aussetzung zu liefern und bevor man zum nächsten roten Puls des Blutes, schnell zurückziehen der Nadel aus der Brusthöhle.
    11. Üben Sie sanften Druck auf die Einstichstelle zu verringern Blutungen für mindestens 1 min.
    12. Vorsichtig bewegen die Maus auf ein Heizkissen oder unter einer Wärmelampe bis voll bewusst. Mäuse werden beobachtet werden, bis die Betäubung nachlässt, so dass sie weg von Reizen gehen können, eine Periode, in der Regel dauert etwa eine Stunde. Mäuse werden täglich für gleichmäßige und intakten Fell und Änderungen im Verhalten überwacht werden.

4. Histopathologische Analyse von Tumoren

  1. neun Wochen nach der Injektion, einschläfern 16 Wochen alten RIP-Tag; RIP-tva Mäuse. Aufzeichnen, Größen und Anzahl von primären Tumoren der Bauchspeicheldrüse und groben Metastasen.
  2. Fix Pankreas, Leber und andere Organe in 10 % Formalin gepuffert über Nacht bei Raumtemperatur in einer rockigen Plattform.
  3. Übertragen die festen Gewebe in 70 % igem Ethanol am nächsten Tag. Gewebe in Paraffin-eingebetteten Abschnitte verarbeiten.
  4. Perform immunhistochemische Färbung für Synaptophysin (neuroendokrine Marker) oder Insulin (β zellspezifische Marker) nach Hersteller ' Anweisungen, pankreatische β-Zellen im Pankreas Lymphknoten Metastasen zu identifizieren oder Leber. Jedoch de-differenzierte Tumorzellen oder schlecht differenzierten Tumorzellen verlieren die Expression von Insulin und kann nur durch Synaptophysin Immunostaining nachgewiesen werden.

5. In-vitro- Infektion der tva exprimierenden Zellen

es ist nicht notwendig, konzentrierte Viren für in-vitro- Infektion zu verwenden. Die nachfolgend beschriebene Protokoll ist für zwei Runden der Infektion. Weitere Runden der Infektion durch Wiederholung das folgende Protokoll durchgeführt werden können.

  1. Sammeln virale Überstand von konfluierende DF1 Zellen. Halten Sie die virale überstand 4 o C für Infektion innerhalb einer Woche. Infektion, Vergehen den viralen Überstand durch einen 0,45-μm-Filter, zellfreie Viren zu erhalten.
  2. Spülen Sie kurz tva exprimierenden Zielzellen (d.h. N134 pankreatische β Zelle Tumor Zelllinie aus einem RIP-Tag; RIP-tva Maus) mit PBS - / -, alle Spuren von Serum zu entfernen, die enthalten Trypsin-Inhibitor. Spülen Sie kurz tva exprimierenden Zellen mit Trypsin-EDTA (z. B. 0,25 % Trypsin-2,21 mM EDTA) Lösung. Trypsin-EDTA-Lösung hinzufügen und 2 Minuten inkubieren. Die Platte vorsichtig antippen. Zellen, die unter einem inversen Mikroskop zu beobachten. Zellen zu lösen in der Regel in 2 bis 3 min. Samen Zielzellen in eine 6 cm-Platte. Verwendung 3 ~ 4 ml gefiltert virale Überstand als Wachstumsmedium.
    Hinweis: Die Ernährung in der viralen Überstand von DF1 Zellen verbraucht wird, also das Medium am nächsten Tag ändern.
  3. Am nächsten Tag genügend virale Überstand auf Zimmertemperatur aufwärmen. Entfernen Sie das Medium von Zielzellen und ersetzen durch virale überstand ca. 3-4 ml.
  4. Am dritten Tag passage Zellen je nach Bedarf. Wenn Zellen nicht dicht genug, um passagiert werden, ~ 4 ml regelmäßige Wachstumsmedium Aufwärmen (DMEM mit hoher Glucose, 10 % fötalen Rinderserum, 6 mM (Endkonzentration) L-Glutamin, 10 Einheiten/mL Penicillin, 10 µg/mL Streptomycin), virale überstand zu ersetzen.
  5. Expand infizierten Zellen und untersuchen Sie die Kandidaten Proteinexpression durch Western Blot- 19. Die Auswirkungen der Kandidatengene auf Migration und Invasion können in Transwell Assays analysiert werden. Diese Zell-Linien können auch für ihre metastatische Potential für die Leber in einem Schweif Vene Assay für Metastasen getestet werden.

6. PCR-Protokolle

Lösungen sollten so schnell wie möglich auf Eis montiert werden. Ein Mastermix ohne die Vorlage kann für eine große Anzahl von Proben und regelmÄÑig in PCR-Röhrchen erfolgen. Multiplizieren Sie die Menge an jedes Reagens benötigt durch die Anzahl der Proben. Mischen der Reagenzien von flinken Prior und wirbeln mit Pipettieren Spitze vor der Einnahme einige der Mastermix hinzu. Nachdem die Mastermix Röhre, Pipettieren rauf und runter, Residuen der Insidertipps zu liefern jedes Reagenz hinzugefügt.

  1. , Das Vorhandensein von RCASBP in den infizierten oder transfizierten Zellen zu erkennen.
    Das folgende Protokoll fordert 11,5 µL der Mastermix und 1 µL genomic DNA für jede Probe. Achten Sie darauf, vor dem Hinzufügen jedes Reagens wirbeln.
    1. Bereiten ein Mastermix 7,68 µL Nuklease-freies Wasser, 0,75 µL DMSO, 1,25 µl 10-fach Puffer für AmpliTaq DNA-Polymerase II, 1,375 µl 25 mm MgCl 2 und 0,125 µl 25 mM dNTP.
    2. 0,125 µL 100 µM forward Primer RCAS5626F hinzufügen: (5 ' - ACCGGGGGATGCGTAGGCTTCA - 3 ') und 0,125 µL von 100 µM Grundierung RCAS6023R rückgängig zu machen: (5 ' - CCGCAACACCCACTGGCATTACC - 3 ') zu den Mastermix.
    3. Hinzufügen 0,075 µL AmpliTaq DNA-Polymerase, die Mastermix.
    4. Mischen die Mastermix, indem Sie den Schlauch mit den Fingern schnippen. Spin-down der Matermix in einer Zentrifuge Maschine kurzy für 3 ~ 5 Sekunden.
    5. Aliquoten 11,5 µL aus der Mastermix für jeden einzelnen Röhren PCR. Wirbel jedes Mal vor dem Aliquotierung, eine neue Tube.
    6. Wirbel und jedem PCR-Röhrchen 1 µL genomische DNA-Vorlage hinzufügen. Genomischen DNA vorzubereiten:
      1. Lyse Zelle Pellet in 200 µl von 0,05 M NaOH. Pipettieren rauf und runter, das Pellet aufzulösen.
      2. Die Zelle lysate auf 98 ° C für 20 Minuten in einer PCR-Maschine zu heizen, dann abgekühlt um 25 ° c
      3. Fügen Sie 20 µL 1.0 M Tris-HCl (pH 7,5), die Rohre und laden die DNA Proben bei 4 ° c
    7. Der Proben durch streichen und Zentrifuge kurz für 3 bis 5 Sekunden mixen. Rohre in einer PCR-Maschine genommen.
    8. Der PCR Zustand befindet sich 2 min. lang bei 92 ° C für erste Denaturierung, gefolgt von 40 Zyklen von 30 s bei 94 ° C Denaturierung 30 s bei 67° C glühen, 30 s bei 72 ° C für Erweiterung und 10 m bei 72 ° C für die letzte Erweiterung.
    9. Nach die PCR abgeschlossen ist, wird jede Probe 3 µL 6 x DNA Loading Dye hinzufügen. Mix von flicking und Zentrifuge kurz für 3 ~ 5 Sekunden.
    10. -PCR-Produkte werden durch Elektrophorese in einem Agarose-Gel 2 % (w/V) in 1 X TAE Puffer untersucht. Die Größe des PCR Produktes ist 398 BP.
  2. Tag Genotypisierung.
    Das folgende Protokoll erfordert 10.5 µL der Mastermix und 2 µL genomic DNA für jede Probe. Achten Sie darauf, vor dem Hinzufügen jedes Reagens wirbeln.
    1. Bereiten ein Mastermix 4,5 µL Nuklease-freies Wasser und 4,00 µL 5 x MyTaq Reaktion Puffer für MyTaq-DNA-Polymerase.
    2. 0.4 µL 100 µM forward Primer TagF2 hinzufügen: (5 ' - GGACAAACCACAACTAGAATGCAGTG - 3 ') und 0.4 µL von 100 µM Grundierung TagR2 rückgängig zu machen: (5 ' - CAGAGCAGAATTGTGGAGTGG - 3 ') zu den master-Mix.
    3. Fügen Sie 0,8 µL 10 µM Beta-2-Mikroglobulin Vorläufer (B2m) Grundierung Mix für die interne Kontrolle. PCR-Primer für B2m sind die interne Kontrolle, Beta-2-Mikroglobulin Vorläufer (B2m), B2 F (5 ' - CACCGGAGAATGGGAAGCCGAA - 3 ') und B2 R (5 ' - TCCACACAGATGGAGCGTCCAG - 3 ').
    4. 0.4 µL hinzufügen MyTaq DNA-Polymerase, die Mastermix.
    5. Mischen die Mastermix, indem Sie den Schlauch mit den Fingern schnippen. Spin-down der Mastermix in der Zentrifuge Maschine für 3 ~ 5 s.
    6. Aliquoten 10.5 µL aus der Mastermix für jeden einzelnen Röhren PCR. Wirbel jedes Mal vor dem Aliquotierung, eine neue Tube.
    7. Wirbel und jedem PCR-Röhrchen 2 µL genomische DNA-Vorlage hinzufügen. Genomischer DNA ist wie oben beschrieben vorbereitet.
    8. Mischen Sie die Lösung durch streichen und Zentrifuge kurz für 3 bis 5 Sekunden. Setzen Sie Rohre in PCR-Maschine.
    9. Der PCR Zustand soll für 3 min bei 95° C für erste Denaturierung, gefolgt von 35 Zyklen von 15 s bei 95 ° C Denaturierung, 15 s bei 65 ° C für Glühen, 30 s bei 72 ° C für Erweiterung und 10 min bei 72 ° C für die letzte Erweiterung.
    10. Nach die PCR abgeschlossen ist, fügen Sie 3 µL 6 x laden Farbstoff zu jeder Probe. Mix von flicking und Zentrifuge kurz für 3 ~ 5 Sekunden.
    11. -PCR-Produkte werden durch Elektrophorese im Agarosegel 2 % (w/V) in 1 X TAE Puffer untersucht. Die Größe der Tag und B2m PCR Produkte sind ~ 450 bp und 300 bp, bzw..
  3. tva Genotypisierung.
    Das folgende Protokoll fordert 10,5 µL des Reagenz-Mix für jede Probe. Achten Sie darauf, vor dem Hinzufügen jedes Reagens wirbeln.
    1. Bereiten ein Mastermix 5,6 µL Nuklease freies Wasser, 0,5 µL DMSO, 1,25 µL 10-fach Puffer II für AmpliTaq DNA-Polymerase, 1,375 µL 25 mm MgCl 2 und 0,125 µL 25 mM dNTP.
    2. Fügen Sie 0,125 µL von 100 µM tva-3 (5 ' - GCCCTGGGGAAGGTCCTGCCC - 3 ') und 0,125 µL von 100 µM tva-5 (5 ' - CTGCTGCCCGGTAACGTGACCGG - 3 ') zu den Mastermix.
    3. Hinzufügen 1,275 µL 10 µM B2m Grundierung Mix für die interne Kontrolle, die Mastermix.
    4. Fügen Sie 0,125 µL AmpliTaq DNA-Polymerase, die Mastermix.
    5. Mischen die Mastermix, indem Sie den Schlauch mit den Fingern schnippen. Spin-down der Mastermix in Zentrifuge Maschine kurz für 3 bis 5 Sekunden.
    6. Aliquoten 10.5 µL aus der Mastermix für jeden einzelnen Röhren PCR. Wirbel jedes Mal vor dem Aliquotierung, eine neue Tube.
    7. Wirbel und jedem PCR-Röhrchen 2µL genomische DNA-Vorlage hinzufügen. Genomischer DNA ist wie oben beschrieben vorbereitet.
    8. Mischen Sie die Lösung durch streichen und Zentrifuge kurz für 3 bis 5 s. Röhren in PCR-Maschine.
    9. Der PCR Zustand befindet sich 2 min. lang bei 92 ° C für erste Denaturierung, gefolgt von 35 Zyklen von 30 s bei 94 ° C Denaturierung 30 s bei 60° C für Glühen, 30 Sekunden bei 72 ° C für Erweiterung und 10 Minuten bei 72 ° C für die letzte Erweiterung.
    10. Nach die PCR abgeschlossen ist, fügen Sie 3 µL 6 x laden Farbstoff zu jeder Probe. Mix von flicking und Zentrifuge kurz für 3 bis 5 s.
    11. -PCR-Produkte werden durch Elektrophorese in einem Agarose-Gel 2 % (w/V) in 1 X TAE Puffer untersucht. Die Größe der tva und B2m PCR-Produkte sind 500 bp und 300 bp, bzw..

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Representative Results

Die in Vivo und in Vitro Infektionsrate von RIP-Tag; RIP-tva Tumorzellen durch RCASBP-basierte Viren sind ~ 20 % ~ 80 % bzw. 20. Im RIP-Tag; RIP-tva Mausmodell, etwa 4 % der 400 Pankreas Inseln in jedem Mausklick entwickeln sich natürlich in Tumoren 20; Daher ist die ausreichende Menge an Tumorzellen in jeder Maus für histologische und phänotypische Analyse der möglichen Wirkung der Gene, die durch die Viren geliefert. Mit diesem System wurde eine neue nukleare Funktion des Bcl-xL in Metastasen identifiziert 9. RIP-Tag; RIP-tva Mäuse infiziert mit RCASBP -Bcl-xL zeigte eine höhere Inzidenz invasiver Karzinome als Kontrolle Viren infizierte Mäuse RCASBP -ALPP (96 % bzw. 74 %). Darüber hinaus 47 % des RCASBP -Bcl-xL-infizierten RIP-Tag; RIP-tva Mäuse entwickelten Metastasen im Pankreas Lymphknoten wenn eingeschläfert auf 16 Wochen alt (Abbildung 3A), während keine Metastasen in Kontrolle Mäuse 20gefunden wurde.

Darüber hinaus haben wir eine Bibliothek von Krebsgenen in RIP-Tag überprüft; RIP-tva Mäuse, und identifiziert das erste gen, das fördert die Metastasierung Pankreas Lymphknoten und die Leber 21 (Abb. 3 b und 3 C). Dieses Gen kodiert den Rezeptor für Hyaluronan-vermittelte Motilität Isoform B (RHAMMB) Protein und EGFR Signalisierung 21aktiviert. Wir demonstrierte, dass Leber-spezifischen Metastasen in einem Schweif Vene Assay der experimentellen Metastasierung rekapitulierte kann, in denen N134 Tumorzellen zunächst durch die Lunge Kapillare Betten der Empfänger immungeschwächte Mäuse 21in Umlauf gebracht.

Figure 1
Abbildung 1 : Schematische RCASBP(A), RCAS-x und-Y RCAS Konstrukte. Klonen Seiten sind in blau, fette Schriftart angegeben. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 2
Abbildung 2 : Platzierung der intrakardialen Injektion. Anatomische Landmarken sind mit horizontalen gestrichelten Linien auf dem Brustbein (beschrieben in weiß) gezeigt. Auf der Maus Haut der sternalen Kerbe und Xyphoid Prozess dienen als Wahrzeichen, und die Nadel ist 1 mm von der Mitte des Brustbeins eingefügt und leicht links (anatomischen) des Brustbeins. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 3
Abbildung 3 : Erkennung von metastasiertem Bauchspeicheldrüsenkrebs β-Zellen durch Immunostaining. Fotografien zeigen repräsentative Synaptophysin Färbung des metastasierten neuroendokrinen Pankreastumoren im Pankreas Lymphknoten (A, B) oder in der Leber (C). RIP-Tag; RIP-tva Mäuse waren infiziert mit der angegebenen RCASBP Retroviren 7 Wochen alt und im Alter von 16 Wochen eingeschläfert. Maßstabsleiste = 50 µm. Original Vergrößerung = 20 X. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

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Discussion

In dieser Studie haben wir eine mächtige Maus-Modell, RIP-Tag beschrieben; RIP-tva, , somatische Gentherapie Lieferung über Vogelgrippe Retroviren zur Identifizierung und Charakterisierung von metastasierendem Faktoren zu erreichen. Obwohl RIP-Tag; RIP-tva Mäuse entwickeln neuroendokrine Tumoren der Bauchspeicheldrüse, metastasierendem Faktoren identifiziert in diesem Mausmodell können auch Metastasen von anderen Krebsarten fördern.

Unser Ansatz hat den Vorteil der Einführung somatische genetischer Veränderungen speziell in prämaligne Läsionen des Pankreas β-Zellen in einer Zeitsteuerung Weise, damit mehr treu imitiert sporadischen menschlichen Tumorentwicklung. Dieser Ansatz vermeidet jede mögliche Störung der normalen Gewebeanordnung, die oft in herkömmlichen transgenen Modellen durch die ektopische Expression des Gens von Interesse während der Entwicklung zu beobachten ist. Darüber hinaus ist es viel schneller, Vogelgrippe retrovirale Vektoren mit Genen von Interesse als zu generieren transgene Mäuse zu generieren. RCASBP abgeleitete Geflügelpest retroviral Vektor liefern cDNAs (≤2.5 kb), ShRNAs und MiRNAs andere forensisches RNAs tva exprimierenden Zellen in Vitro und in Vivo. Die Effizienz der Infektion (und mehrere Infektion) ist die Proliferationsrate der Zielzellen und die Zugänglichkeit der Zellen abhängig. Ein Titer von > 1 x 108 infektiösen Einheiten pro ml ist für in-Vivo -Infektion erforderlich. Effizientere virale Lieferung erreicht in Vitro durch induzierte Zellproliferation und die Möglichkeit, sich wiederholende Belastung von alle Zellen mit Viren kann.

Präzise intrakardialen Injektionstechnik ist entscheidend für die Rentabilität von Mäusen. Erstens ist ein 50 µl des Luftraums in eine Insulin-Spritze vor der Abfassung virale Aussetzung entscheidend für kardiale Puls zu sehen. Zweitens ist es wichtig, die Position der Spritze zu beheben, sobald ein rote Puls des Blutes angezeigt wird, und langsam 10-20 µl virale Aussetzung liefern, wann immer sehen einen hellen roten Puls von Blut in die Spritze angezeigt. Wenn helle rote Pulsen des Blutes nach der Lieferung von 10-20 µl virale Aussetzung zu stoppen, hilft die Nadel leicht Neupositionierung. Drittens: nach den letzten Schub des Kolbens, virale Aussetzung zu liefern und bevor man Blut Puls, die Nadel muss schnell aus der Brusthöhle eingefahren werden und ein sanfter Druck auf die Einstichstelle aufgetragen hilft, um innere Blutungen zu verringern. Nicht zuletzt, die Insulin-Spritze nicht wieder auf eine andere Maus verwenden.

Für zukünftige Anwendungen, diese RIP-Tag; RIP-tva Maus-Modell kann mit anderen transgenen, Knock-in und Knockout Maus-Modellen kombiniert werden. Darüber hinaus stellen wir uns die Kombination dieser RIP-Tag; RIP-tva Maus-Modell mit CRISPR-Cas9 Genom-editing-Tool, um einzelne Punktmutationen, Löschung, genomic Rearrangements wie Inversionen und Translokationen 22zu generieren.

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Disclosures

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Acknowledgments

Wir danken Harold Varmus, Brian C. Lewis, Douglas Hanahan, Danny Huang, Sharon Pang, Megan Wong und Manasi M. Godbole. Y.C.N.D. stützt sich auf DOD Grant W81XWH-16-1-0619 und NIH Grant 1R01CA204916.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
RCASBP-Y DV plasmid Addgene 11478
RCAS-RNAi plasmid Addgene 15182
DMEM Corning 10-013-CV
fetal bovine serum Atlanta Biologicals 25-005-CI
L-glutamine, 100x Corning 25-005-CI
Penicillin-Streptomycin solution, 100x Corning 30-002-CI
PBS-/-, 1x Corning 21-040-CV
Superfect Qiagen 301305
Polyallomer centrifuge tube Beckman Coulter 326823
0.45 mm Nalgene
Syringe Filters with PES Membrane		 Thermo Scientific 194-2545
Insulin Syringes BD 329461
synaptophysin Vector Laboratories VP-S284
VECTASTAIN Elite ABC HRP Kit (Peroxidase, Rabbit IgG) Vector Laboratories PK-6101
AmpliTaq DNA Polymerase with Buffer II Life Technologies N8080153
MyTaq DNA Polymerase Bioline BIO-21106

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References

  1. Vogelstein, B., Kinzler, K. W. The multistep nature of cancer. Trends Genet. 9 (4), 138-141 (1993).
  2. Walrath, J. C., Hawes, J. J., Van Dyke, T., Reilly, K. M. Genetically engineered mouse models in cancer research. Adv Cancer Res. 106, 113-164 (2010).
  3. Khanna, C., Hunter, K. Modeling metastasis in vivo. Carcinogenesis. 26 (3), 513-523 (2005).
  4. Du, Y. C., Lewis, B. C., Hanahan, D., Varmus, H. Assessing tumor progression factors by somatic gene transfer into a mouse model: Bcl-xL promotes islet tumor cell invasion. PLoS biology. 5 (10), e276 (2007).
  5. Hanahan, D. Heritable formation of pancreatic beta-cell tumours in transgenic mice expressing recombinant insulin/simian virus 40 oncogenes. Nature. 315 (6015), 115-122 (1985).
  6. Fisher, G. H., et al. Development of a flexible and specific gene delivery system for production of murine tumor models. Oncogene. 18 (38), 5253-5260 (1999).
  7. Orsulic, S. An RCAS-TVA-based approach to designer mouse models. Mamm Genome. 13 (10), 543-547 (2002).
  8. Tuveson, D., Hanahan, D. Translational medicine: Cancer lessons from mice to humans. Nature. 471 (7338), 316-317 (2011).
  9. Choi, S., et al. Bcl-xL promotes metastasis independent of its anti-apoptotic activity. Nat Commun. 7, 10384 (2016).
  10. Naik, P., Karrim, J., Hanahan, D. The rise and fall of apoptosis during multistage tumorigenesis: down-modulation contributes to tumor progression from angiogenic progenitors. Genes Dev. 10 (17), 2105-2116 (1996).
  11. Hughes, S. H., Greenhouse, J. J., Petropoulos, C. J., Sutrave, P. Adaptor plasmids simplify the insertion of foreign DNA into helper-independent retroviral vectors. J Virol. 61 (10), 3004-3012 (1987).
  12. Petropoulos, C. J., Payne, W., Salter, D. W., Hughes, S. H. Appropriate in vivo expression of a muscle-specific promoter by using avian retroviral vectors for gene transfer [corrected]. J Virol. 66 (6), 3391-3397 (1992).
  13. Dunn, K. J., Williams, B. O., Li, Y., Pavan, W. J. Neural crest-directed gene transfer demonstrates Wnt1 role in melanocyte expansion and differentiation during mouse development. Proc Natl Acad Sci USA. 97 (18), 10050-10055 (2000).
  14. Loftus, S. K., Larson, D. M., Watkins-Chow, D., Church, D. M., Pavan, W. J. Generation of RCAS vectors useful for functional genomic analyses. DNA Res. 8 (5), 221-226 (2001).
  15. Bromberg-White, J. L., et al. Delivery of short hairpin RNA sequences by using a replication-competent avian retroviral vector. J Virol. 78 (9), 4914-4916 (2004).
  16. Harpavat, S., Cepko, C. L. RCAS-RNAi: a loss-of-function method for the developing chick retina. BMC Dev Biol. 6 (2), (2006).
  17. Huse, J. T., et al. The PTEN-regulating microRNA miR-26a is amplified in high-grade glioma and facilitates gliomagenesis in vivo. Genes Dev. 23 (11), 1327-1337 (2009).
  18. Ahronian, L. G., Lewis, B. C. Generation of high-titer RCAS virus from DF1 chicken fibroblasts. Cold Spring Harb Protoc. 2014 (11), 1161-1166 (2014).
  19. Green, M. R., Sambrook, J., Sambrook, J. Molecular cloning: a laboratory manual. , 4th ed, Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2012).
  20. Du, Y. C., Lewis, B. C., Hanahan, D., Varmus, H. Assessing tumor progression factors by somatic gene transfer into a mouse model: Bcl-xL promotes islet tumor cell invasion. PLoS Biol. 5 (10), 2255-2269 (2007).
  21. Du, Y. C., Chou, C. K., Klimstra, D. S., Varmus, H. Receptor for hyaluronan-mediated motility isoform B promotes liver metastasis in a mouse model of multistep tumorigenesis and a tail vein assay for metastasis. Proc Natl Acad Sci USA. 108 (40), 16753-16758 (2011).
  22. Guernet, A., Grumolato, L. CRISPR/Cas9 editing of the genome for cancer modeling. Methods. , (2017).

Tags

Cancer Research Ausgabe 128 Maus-Modell Metastasen RCAS somatische Gentransfer RIP-Tag RIP-tva
Identifizierung und Charakterisierung von metastasierendem Faktoren durch Gentransfer in die neuartige <em>RIP-Tag; RIP-tva</em> Mausmodell
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Zhang, G., Chi, Y., Du, Y. C. N.… More

Zhang, G., Chi, Y., Du, Y. C. N. Identification and Characterization of Metastatic Factors by Gene Transfer into the Novel RIP-Tag; RIP-tva Murine Model. J. Vis. Exp. (128), e55890, doi:10.3791/55890 (2017).

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