Summary
선물이 RIP-태그;를 활용 하 여 소설 체세포 유전자 전달 시스템을 설명 하는 프로토콜 RIP-tva 마우스 모델 전이에서 유전자의 기능 연구. 조류 레트로 바이러스 intracardiacally 성인 쥐에서 췌 장 β 세포의 사전 악성, 비 침 투 적인 병 변으로 유전자 전송을 보장 하기 위해 전달 됩니다.
Abstract
전이성 암은 단단한 종양을 가진 환자에 있는 죽음의 90%를 차지 한다. 암 전이의 드라이버를 더 잘 이해 하 고 소설 치료 목표를 식별 하는 긴급 한 필요가 있다. 조사를 진행 주 암에서 전이를 분자 이벤트, 우리 bitransgenic 마우스 모델, RIP-태그; 개발 RIP-tva. 이 마우스 모델 쥐 인슐린 발기인 (RIP) 췌 장 β 세포에 SV40 T 항 원 (태그)와 하위 조류 leukosis 바이러스 (tva)에 대 한 수용 체의 식 드라이브. 쥐 증식, 혈관 신생, adenoma, 침략 암 등 단계와 비슷한 인간의 tumorigenesis는 잘 정의 된 단계를 통해 100 %penetrance 췌 장 신경 내 분 비 종양을 개발 합니다. 때문에 RIP-태그; RIP-tva 마우스 전이성 질병을 개발 하지 않습니다, 전이 촉진 유전자 변경 쉽게 확인 될 수 있다. 체세포 유전자 tva 표현으로 전송, 췌 장 β 확산 premalignant 병 변 원하는 유전 변경 은닉 조류 레트로 바이러스의 intracardiac 주사를 통해 달성 된다. titer > ml 당 1 x 108 감염 단위 vivo에서 감염에 대 한 적절 한 것으로 간주 됩니다. 또한, 조류 레트로 바이러스 RIP-태그; 종양에서 파생 된 셀 라인을 감염 시킬 수 있습니다. RIP-tva 고효율 쥐. 셀 라인 또한 전이성 요인 특성을 사용할 수 있습니다. 여기이 마우스 모델을 이용 하 여 세포 선 종양 전이에 후보 유전자의 기능을 평가 하는 방법을 보여 줍니다.
Introduction
대부분의 암은 체세포 돌연변이 1에서 발생 한다. 기존의 유전자 조작된 마우스 모델 (GEMM)는 특정 유전 변경 tumorigenesis 2에 기여에 대 한 중요 한 통찰력을 제공 합니다. 그러나, 그들은 몇 가지 제한이 있다. 이러한 모델의 주요 단점은 인간, 조직 내의 일부 셀만 유전 변경을 획득에 종양 형성의 산발적 인 특성을 복제 하지 않습니다. 유전자 변형 및 녹아웃 쥐에 있는 돌연변이 생식 개발에 영향을 미칠 가능성이 있습니다. 또한, 이러한 마우스 모델 생성 이며 비싼 시간이 걸리는.
전이 암 분야에서 중요 한 문제입니다. 전이 모델링은 GEMM에서 어렵게 되었습니다. 자연 스러운 전이 마우스에서 희소 하다. Penetrance 변수 이며 대기 시간 전이 3의 GEMM에 오래입니다. 그래서 전이성 캐스케이드의 초기 단계는 제거 실험 전이 모델 마우스의 순환으로 세포의 직접 주사를 사용 합니다.
마우스 모델에서 전이성 요인 공부에 상기 제한 중 일부를 해결 하려면 bitransgenic 마우스 모델, RIP-태그; 개발 했습니다. RIP-tva4. 전략은 하위 그룹 A 조류 leukosis 바이러스, tva 6,7에 대 한 높은 동기화 종양 진행 마우스 모델, RIP 태그 5, 그리고 수용 체의 사용을 결합에 기반. 이 RIP-태그; RIP-tva마우스 모델 유전자 somatically 단일 bitransgenic 마우스 스트레인에 소개 될 수 있습니다. Rb, p53 종양 진압 기능 억제 SV40 T 항 원을 가진 쥐 증식, 혈관 신생, adenoma, 침략 암 등 단계와 비슷한 방식으로 인간의 tumorigenesis, 췌 장 신경 내 분 비 종양을 개발 합니다. RIP-태그 모델이 암, 췌 장 신경 내 분 비 종양에 국한 되지 않음의의 우리의 이해를 위해 매우 유익 했습니다. 그것은 또한 전 임상 실험 8에서 사용 되었습니다.
선물이 RIP-태그;에 조류 레트로 바이러스 intracardiacally의 주입을 통해 체세포 유전자 전송 위한 프로토콜 RIP-tva 쥐. RCASBP 파생 조류 레트로 바이러스와 성공적인 감염 대상 셀을 적극적으로 확산이 필요합니다. 따라서, 우리 선택 RIP-태그; RIP-tva 증식 췌 장 독도의 약 50%에서 발전 하는 때 나이의 7 주에 마우스. 왼쪽된 심 실 intracardiac 주입 높은 titer 바이러스의 감염 10-20 4의 효율성을 달성 하기 위해 필요 합니다. 이 전달 방법 바이러스 췌 장 독도 도달 하기 전에 순환 내에서 바이러스 입자의 중요 한 희석을 감소 시킨다.
이 방법을 사용 하 여, 우리는 이전 Bcl xL 안티 apoptotic 함수 4,9의 독립적인 암 전이 촉진 증명 하고있다. Bcl-xL RIP-태그; tumorigenic 가깝다고 걸쳐 모든 췌 장 β 세포에서 transgene를 통해 표현 했다이 안티 apoptotic 독립적인 전이성 기능 관찰 하지 RIP-Bcl-xL 모델 10마우스. 따라서, 우리의 마우스 모델 식별 tumorigenesis의 나중 단계에서 표현 하는 때 유전자의 기능을 특성화 하는 독특한 기회를 제공 합니다. 독도의 2-4% RIP-태그; 종양으로 발전 하기 때문에 RIP-tva bitransgenic 쥐 바이러스 성 감염 및 모든 premalignant 병 변 없이 RCASBP에서 파생 된 조류 레트로 바이러스 감염만 tumorigenesis의 자연적인 과정을 통해 선택적 우위를 부여 하는 요소를 확인할 수 있습니다. 특히, 전이성 요인 가장 쉽게 인식 됩니다이 방법으로 췌 장의 림프절 이나 다른 장기에 전이 RIP-태그;에서 일반적으로 발생 하지 않습니다 때문에 RIP-tva 쥐.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
윤리 성명: 실험 동물에 지침 및 규정 명시 된 동물 관리 및 사용 위원회의 Weill 코넬 의학 연구소에 의해 수행 되었다.
1. 선택의 조류 Retroviral 벡터 (RCASBP A 기반 또는 RCANBP(A)-based)
- 벡터 라우 스 육 종 바이러스 11에서 파생 되었다. 조류 retroviral 벡터 cDNAs를 제공할 수 있습니다 (≤ 2.5 kb), 짧은 헤어핀 RNAs (shRNAs), microRNAs (miRNAs), 그리고 다른 noncoding RNAs. 상용 벡터 자료에 나열 되 고 다른 사람을 저자에서 직접 요청할 필요.
- 관심의 유전자 overexpress를, 다음 벡터 중 하나를 사용 하 여 RCASBP(A) 12 ( 그림 1A), RCAS-X ( 그림 1B), RCAS Y 13 ( 그림 1C), RCASBP-Y DV 14 또는 다른 ALV A 벡터 (https://home.ncifcrf.gov/hivdrp/RCAS/mice.html).
- ShRNA로 관심의 유전자를 노크, 다음 벡터 중 하나를 사용: RCAN X DV 15 또는 RCAS RNAi 16.
- MiRNAs overexpress에, 17에 설명 된 대로 RCAS 미르 벡터 생성.
- 대장균 DNA 요구 사항으로 변환.
- 는 직접 반복 및 retroviral 시퀀스를 안정화 하기 위해 독특한 유전자는 Stbl2 또는 Stbl3 유능한 세포 DNA를 선호 변환. 순수, 얻을 것 이다 하는 메서드를 사용 하 여 플라스 미드 DNA를 정화 transfection 학년 DNA. DNA의 5 µ g 0.1 µ g / µ l의 최소 농도 필요한.
2. 치킨 구와 DF1 셀 라인에서 바이러스 전파
- 필터링 된 피 펫 팁의 사용 교차 오염 바이러스를 방지 하기 위해 세포 배양 필요 주식 18.
- 유지 DF1 세포 성장 6 cm 접시에 매체 (DMEM 높은 포도 당, 10% 태아 둔감 한 혈 청, 6 mM (최종 농도)와 L-글루타민, 10 단위/ml 페니실린, 10 µ g/ml 스) 37 o C에 5% CO 2. DF1 셀은 갓 동 냉동된 주식에서 하는 경우 transfection 전에 적어도 3 일 동안 문화.
- Transfection, 전에 1 일 transfection 시 30-50% 합칠 것입니다 그들은 그렇게 6 cm 조직 문화 접시에 DF1 셀 패스.
- 조직 문화 후드 내부의 microcentrifuge 튜브에서 150 µ l의 총 볼륨 (혈 청, 페니실린 또는 스) 없이 DMEM과 순수한 바이러스 성 DNA의 희석 5 µ g.
- 희석된 DNA 튜브에 직접 Superfect의 추가 30 µ L, 소용돌이 10이 혼합물 s; 두고 조직 문화에서 5-10 분 동안 실내 온도에 혼합물 transfection 복잡 한 형성 수 있도록 후드.
- 복잡 한 형성 동안 부드럽게 DF1 세포 배양 접시에서 성장 매체를 발음 하 고 신중 하 게 씻어 4 ml PBS -/- 셀.
- 피펫으로 5 ml의 성장 매체 (혈 청 및 항생제 포함); 다음 단계; 팔 콘 튜브를 4 ml를 저장 하 고 transfection 복합물에 성장 매체의 1 ml의 나머지 부분을 추가. 두 번, 아래로 pipetting으로 혼합 하 고 즉시 전체 transfection 단지 DF1 셀에 전송. 소용돌이 셀 계층 덮여; 되도록 2-3 시간 동안 37 o c.에 품 어
- Transfection 혼합물 발음, 4 ml PBS -/- 세포를 씻어, 신선한 성장 매체 (혈 청 및 항생제 포함)의 4 개 ml를 추가, 37 o C 인큐베이터에 셀 반환.
- 셀 confluency에 도달, 통로 (과도 식 수 수 분석 48 ~ 72 h transfection 후) 셀.
- 계속 모든 셀은 아마도 감염 때까지 약 7 일 동안 세포 전달; PCR에 의해 바이러스 성 DNA 통합 테스트 및 서 부 럽;에 의해 단백질 식을 결정 하 고 10 %DMSO 20% 태아 둔감 한 혈 청으로 DMEM 매체에 세포 동결.
3. Vivo에서 태그-RIP;의 감염 RIP-tva 마우스
- 바이러스 수집 및 농도
사용 갓 vivo에서 감염에 대 한 바이러스를 집중. 1 주일 이내 4 o C에에서 보관 하는 바이러스 titer 크게 감소 되지 않는다. 그러나, 바이러스 성 주식의 냉동된 aliquots 녹고 시 10 감소 titer를 표시합니다. - 필요한 바이러스의 양에 따라 15 cm 요리에 확장 바이러스 제작자 DF1 셀
- . 에 대 한 vivo에서 마우스, 마우스 당 한 접시의 평균 준비.
- 전 진정 회전자 (예, SW28), 스윙 양동이 4 o c.에 ultracentrifuge 기계
- 수집 상쾌한 confluent 15 cm 요리에서. 1650 x g 4 o c.에서 10 분 동안에 저속 원심 분리에 의해 세포 파편을 제거
- 전송 바이러스 상쾌한 ultracentrifuge 튜브 (Polyallomer 원심 분리기 튜브). ultracentrifuge에서 95,400 x g 4 o c.에서 1.5 시간 동안 회전 베크만 XL-100 ultracentrifuge 기계 사용 Accel: 1; Decel: 1 설정.
- Ultracentrifuge에서 제거 상쾌한 튜브 가능 한 한 많이. 칼슘과 마그네슘 (PBS -/-) 없이 한 15cm 접시에서 최종 100 µ l 바이러스 성 정지 수 있도록 ultracentrifuge 튜브 PBS를 추가 합니다. Parafilm 튜브 커버. Vortexing는 ultracentrifuge 튜브 중간 속도에서 2 분으로 보이지 않는 바이러스 성 펠 릿 resuspend.
- 바위 4 o C 하룻밤에 한 시간 동안에 ultracentrifuge 튜브.
- 는 Microcentrifuge 튜브로 바이러스 성 현 탁 액을 전송합니다. 쥐에 주입 하기 전에 실내 온도에 바이러스 성 정지 워밍업.
모든 새로운 바이러스 성 구조에 대 한 바이러스 titer vivo에서 감염 전에 결정 될 필요가 있다.
- 12 음 조직 문화 접시의 모든 우물에 씨앗 DF1 셀 (제안: 2 × 10 4 셀/글쎄, 1 ml/음), 그들은 감염 시 30% 합칠 수 있도록. 1 12-잘 접시 한 바이러스 titer 결정 필요.
- 다음과 같이 성장 매체에서의 바이러스 상쾌한 10 희석의 시리즈를 만들기: 10 2 희석 microcentrifuge 튜브에 대 한
- 495와 믹스 5 µ l 바이러스 성 상쾌한 µ l 성장 매체. 잠시 몇 초간 소용돌이. 10 3 희석에 대 한 microcentrifuge 관에서 360 µ l 성장 매체로
- 걸릴 40 µ l 10에서 2 희석 잠시 몇 초간 소용돌이.
- 따라 단계 3.2.2.2 10 4 및 10 5 희석.
- 세트 5 6 ml 폴리스 티 렌의 튜브. Aliquot 2.25 ml 성장 매체, 튜브 및 라벨 그들 10 6, 10 7, 10 8 10 9, 10 10, 각각.
- 6 ml 10 6 희석에 대 한 폴리스 티 렌 튜브에에서 2.25 ml 성장 매체와 10 5 희석에서 0.25 ml를 혼합. 잠시 몇 초간 소용돌이.
- 따라 단계 3.2.2.5 10 7, 10 8, 10, 9 및 10 10 희석.
- 12-잘 접시에 DF1 셀에서 원래 문화 매체를 제거합니다. 넣어 잘 각에 중복 1 ml 희석 바이러스 (감염 되지 않은, 10 10 10 6 IU/ml).
- 셀 (trypsinzation 필요한 경우 수행) 적어도 7 일 동안 성장 하는 것을 허용. 세포 DNA 및 PCR에 의해 바이러스 성 DNA의 존재에 대 한 확인에 설명 된 대로 분리 수집 " 6. PCR 프로토콜 ". 만약이 바이러스 titer (IU/ml) 당 10 8 전염 성 단위, RCASBP의 긍정적인 398 bp PCR 제품 10 세포에서 DNA를 사용 하 여 관찰 될 것 이다 8 10 6 IU/ml 바이러스에만 감염 되지 않은 셀 또는 셀 10에서 10 10 9 IU/ml 바이러스입니다. titer > vivo에서 감염에 대 한 1 x 10 8 ml 당 감염 단위를 사용 해야 합니다.
Hemizygous RIP 태그 쥐, 하지 homozygous 쥐,이 연구에 사용 됩니다. Hemizygous RIP 태그 마우스 개발 췌 장 신경 내 분 비 종양 약 10 ~ 12 주 나이, homozygous 쥐 짧은 종양 대기 시간 동안. 세포 증식 호스트에 바이러스 성 cDNA의 설립에 대 한 필요 하기 때문에 게놈, 7 주 된 RIP-태그; RIP-tva hyperplasic 췌 장 β 세포와 쥐 사용 됩니다. 가장 일반적인 β 세포 성인 쥐에 확산 하지는 note 하시기 바랍니다.
- 사용 7 주 된 RIP-태그; RIP-tva는 실험에 대 한 순수한 C57BL/C 배경에서 마우스.
- Anesthetize 마우스 (150mg/kg, 15 mg/kg) 케 타 민/xylazine 조합을 사용 하 여. 열 지원을 사용 하 여 마 취의 전체 기간에 걸쳐 마우스 체온 유지.
- 양쪽 눈 각 막 건조 방지 하기 위해 눈 윤 활 유 적용.
- 면도 머리 RIP-태그;의 가슴 구멍에서 RIP-tva 쥐. 향하도록 가슴을 가진 그것의 뒤에 마우스를 위치 합니다. 발가락-핀치 전체 마 취 효과 확인 하려면 응답 속도 대 한 동물을 관찰 하기 위해 수행 됩니다.
- 앞 다리를 확장 하 고 테이프와 그들을 보호. 마크 마우스 ' 주입에 대 한 s 가슴. Sternal 노치와 xyphoid 프로세스의 상단 사이의 위치 중간 고 약간 왼쪽 흉 골 ( 그림 2)의 (해 부).
- 스크럽 povidone-요오드 스크럽 또는 액체 스크럽 앞쪽 가슴 벽 뒤에 70% 이소프로필 알코올 또는 70% 에탄올 젖은 거 즈 스폰지.
- 메 마른 28 g ½ 인슐린으로 공기의 그릴 50 µ l 주사기 플런저와 500 µ L 주사기의 초승달 모양 사이 공간을 창조 하 고 바이러스의 100 µ l를 그립니다. 공기 공간 벽에 어떤 액체 없이 심장 펄스를 보고 결정적 이다.
- 계속 바늘 직 마우스의 피부 긴장 한 손으로 누른 표시 된 위치에 바늘을 삽입 합니다. 혈액의 밝은 빨간 펄스 주사기에 나타나면, 바늘을 전진 중지 하 고 한 손으로 마우스에 바늘의 깊이 수정.
- 다른 손을 신중 하 게 사용 하 고 천천히 ~ 60 초 동안 바이러스 성 현 탁 액 (~ 100 µ l 볼륨)를 제공 하는 플런저를 밀어. 주사기에 표시 혈액의 밝은 빨간 펄스를 볼 때마다 10-20 µ l를 제공 합니다. 투명 한 바늘 허브에 빨간 산소 혈액의 지속적인 입구 왼쪽된 심 실에 바늘의 적절 한 위치를 나타냅니다.
- 바이러스 성 현 탁 액을 제공 하 고 보고 하기 전에 혈액의 다음 빨간 펄스, 신속 하 게 가슴 구멍으로 바늘을 철회 하는 플런저의 마지막 강요 후.
- 적어도 1 분에 대 한 출혈을 줄이기 위해 주사 사이트에 부드러운 압력을 적용
- 신중 하 게가 열 패드 또는 완전히 식을 때까지 열 램프 아래에서 마우스를 이동 합니다. 그들은 자극에서 벗어날 수 있도록 마 취 기운이 떨어지기 때까지 마우스를 지켜보고 있을 것입니다 일반적으로 약 1 시간 지속 기간. 마우스도 그대로 코트와 행동의 변화에 대 한 매일 모니터링할 것입니다.
4. 종양의 histopathological 분석
주입 후- 9 주 16 주 된 안락사 RIP-태그; RIP-tva 쥐. 크기와 기본 췌 장 종양 및 어떤 심한 전이의 숫자를 기록.
- 수정 췌 장, 간, 또는 다른 기관의 10%에 버퍼링 말린 하룻밤 락 플랫폼에 실 온에서.
- 는 다음날에 70% 에탄올에 고정된 조직 전송. 파라핀 끼워 넣어진 섹션으로 조직 처리.
- 수행 immunohistochemical synaptophysin (neuroendocrine 마커) 또는 인슐린 (β 세포 특정 마커) 제조 업체에 따라 얼룩 ' s 지침 췌 장 β 세포 췌 림프절에의 전이 확인 하 또는 간입니다. 그러나, 드 차별화 된 종양 세포 또는 가난 하 게 분화 된 종양 세포 인슐린의 식을 잃을 수 고만 synaptophysin immunostaining에 의해 검출 될 수 있다.
5. 생체 외에서 Tva 표현 세포의 감염
집중된 바이러스를 사용 하 여 체 외에서 감염에 대 한 필요는 없습니다. 아래에 설명 된 프로토콜 감염의 2 라운드입니다. 감염의 추가 라운드는 다음 프로토콜을 반복 하 여 수행할 수 있습니다.
- 수집 confluent DF1 세포에서 바이러스 성 상쾌한. 4 o C 1 주일 이내 감염에 바이러스 성 상쾌한을 유지. 감염, 전에 통과 바이러스 상쾌한 셀 무료 바이러스를 0.45 μ m 필터.
- 간단히 씻어 tva 표현 대상 셀 (즉, N134 췌 장 β 세포 종양 셀에서에서 라인 RIP-태그; RIP-tva 마우스) PBS -/- 혈 청의 모든 흔적을 제거 하려면, 트립 신 억제제를 포함 하는. 짧게 트립 신-EDTA (0.25% Trypsin 2.21 mM EDTA) 등 솔루션 tva 표현 대상 셀 린스. 트립 신-EDTA 솔루션을 추가 하 고 2 분 동안 품 어. 부드럽게 접시를 누릅니다. 거꾸로 현미경 세포를 관찰 합니다. 셀은 일반적으로 분리 2 ~ 3 분에 씨 대상 셀 6 cm 격판덮개로. 사용 3 ~ 4 ml 필터링 성장 매체로 바이러스 상쾌한.
참고: 바이러스 상쾌한에 영양 DF1 세포에 의해 소모 됩니다, 그래서 변경 매체 다음 날. - 다음 날, 충분 한 양의 바이러스 상쾌한 실내 온도를 따뜻하게. 대상 셀에서 매체를 제거 하 고 3-4 ml 바이러스 상쾌한 바꿉니다.
- 세번째 날에 필요에 따라 셀을 통과. 셀 충분히 조밀한 passaged 수 있다면, 일반 성장 매체의 ~ 4 ml를 따뜻하게 (DMEM 높은 포도 당, 10% 태아 둔감 한 혈 청, 6 mM (최종 농도)와 L-글루타민, 10 단위/mL 페니실린, 10 µ g/mL 스) 대체 바이러스 상쾌한 하.
- 확장 세포를 감염 하 고 서양 19 blotting에 의해 후보 단백질 표정 검토. Transwell 분석 실험에서 마이그레이션 침공에 대 한 후보 유전자의 효과 분석할 수 있습니다. 이러한 셀 라인 또한 간 전이 대 한 꼬리 정 맥 시험에 그들의 전이성 잠재력에 대 한 테스트할 수 있습니다.
6. PCR 프로토콜
솔루션 얼음에 최대한 신속 하 게 조립 해야 한다. 서식 파일 없이 mastermix PCR 튜브에 aliquoted 및 샘플의 많은 수를 위해 만들 수 있습니다. 각 시 약 샘플 수에 필요한 금액을 곱하면 됩니다. 터치 사전으로 시 약을 혼합 하 고 일부는 mastermix에 추가 하기 전에 피펫으로 팁 소용돌이. 도움말 안에 모든 오차를 제공 하는 위쪽 및 아래쪽 피펫으로 mastermix 튜브를 각 시 약을 추가한 후.
- 감염 또는 transfected 세포 RCASBP의 존재를 감지 하.
다음 프로토콜은 mastermix의 11.5 µ L 각 샘플에 대 한 게놈 DNA의 1 µ L에 대 한 호출합니다. 각 시 약을 추가 하기 전에 소용돌이를 있는지 확인 하십시오.- 7.68 µ L nuclease 무료 물, 0.75 µ L DMSO, 1.25 µ l 10 x 버퍼 II AmpliTaq DNA 중 합 효소에 대 한, 25 mm MgCl 2, 1.375 µ l 25 mM dNTP의 0.125 µ l의 mastermix 준비.
- 100 µ M 앞으로 뇌관 RCAS5626F의 0.125 µ L를 추가: (5 '-ACCGGGGGATGCGTAGGCTTCA-3 ')와 반전 뇌관 RCAS6023R 100 µ M의 0.125 µ L: (5 '-CCGCAACACCCACTGGCATTACC-3 ')는 mastermix 하.
- 0.075 µ L를 추가 AmpliTaq DNA 중 합 효소는 mastermix 하.
- 는 손가락으로 튜브를 터치 하 여는 mastermix 믹스. 원심 분리기 기계 briefl에서 matermix 아래로 회전y 3 ~ 5 초.
- 각 개인에 게는 mastermix에서 aliquot 11.5 µ L PCR 튜브합니다. 새로운 튜브에 aliquoting 하기 전에 때마다 소용돌이.
- 소용돌이 각 PCR 튜브에 1 µ L genomic DNA 템플렛을 추가 하 고. 게놈 DNA 준비: 0.05 M NaOH의 200 µ l에서
- Lyse 세포 펠 릿. 펠 릿을 해산 하기 위해 위쪽 및 아래쪽 피펫으로.
- 25 식 후 세포 lysate PCR 기계에 20 분에 98 ° C에가 열 ° c.
- 추가 20 µ L 1.0 M Tris-HCl (pH 7.5) 튜브 및 상점 4에서 DNA 샘플을 ° c.
- 짧게 3-5 초에 대 한 샘플 flicking 및 원심 분리기에 의해 혼합. PCR 기계에 튜브를 넣어.
- 는 PCR 조건 뒤에 30의 40 주기 초기 변성 92 ° C에서 2 분 동안 설정 되어 변성, 30 대 94 ° C에서 s s 67 어 닐 링, 30 ° C에서 확장, 72 ° C와 최종 연장 위한 72 ° C에서 10 m s.
- PCR를 마치면 각 샘플을 DNA 로드 염료 x 6의 3 µ L를 추가 합니다. 터치와 3 대 짧게 분리기 믹스 ~ 5 초.
- PCR 제품에서 1 x TAE 버퍼에는 2% (w/v) agarose 젤 전기 이동 법으로 검사 합니다. PCR 제품의 크기는 398 bp.
- 태그 유전형.
다음 프로토콜은 mastermix의 10.5 µ L 각 샘플에 대 한 게놈 DNA의 2 µ L에 대 한 호출합니다. 각 시 약을 추가 하기 전에 소용돌이를 있는지 확인 하십시오.- 4.5 µ L nuclease 무료 물, MyTaq 반응 버퍼 x 4.00 µ L 5의 mastermix MyTaq DNA 중 합 효소에 대 한 준비.
- 0.4 µ L 100 µ M 앞으로 뇌관 TagF2의 추가: (5 '-GGACAAACCACAACTAGAATGCAGTG-3 ') 및 0.4 µ L 100 µ M의 뇌관 TagR2 역: (5 '-CAGAGCAGAATTGTGGAGTGG-3 ') 마스터 믹스.
- 내부 제어를 위한 10 µ M 베타-2-microglobulin 전조 (B2m) 뇌관 믹스의 0.8 µ L를 추가합니다. PCR 뇌관 B2m에 대 한 내부 통제, 베타-2-microglobulin 전조 (B2m), b 2 F는 (5 '-CACCGGAGAATGGGAAGCCGAA-3 ')와 B2 R (5 '-TCCACACAGATGGAGCGTCCAG-3 ').
- 0.4 µ L를 추가 MyTaq DNA 중 합 효소는 mastermix 하.
- 는 손가락으로 튜브를 터치 하 여는 mastermix 믹스. 3 원심 분리기 기계에서 mastermix 아래로 회전 ~ 5 미
- 각 개인에 게는 mastermix에서 aliquot 10.5 µ L PCR 튜브합니다. 새로운 튜브에 aliquoting 하기 전에 때마다 소용돌이.
- 소용돌이 각 PCR 튜브를 2 µ L genomic DNA 템플렛을 추가 하 고. 위에서 설명한 대로 genomic DNA 준비.
- 믹스 솔루션 flicking 및 원심 분리기에 의해 짧게 3-5 초에 대 한. PCR 기계에 넣고 튜브.
- 는 PCR 조건 초기 변성, 15의 35 주기 다음에 대 한 95 ° C에서 3 분 설정 됩니다 s 변성, 15에 대 한 95 ° C에 어 닐 링, 30를 위한 65 ° C에서 s s 확장, 72 ° C와 최종 연장 위한 72 ° C에서 10 분.
- PCR를 마치면 각 샘플 염료 로드 x 6의 3 µ L를 추가 합니다. 터치와 3 대 짧게 분리기 믹스 ~ 5 초.
- PCR 제품에서 1 x TAE 버퍼에 2% (w/v) agarose 젤 전기 이동 법으로 검사 합니다. 태그와 B2m PCR 제품의 크기는 450 ~ 혈압과 300 bp, 각각.
- tva 유전형.
다음 프로토콜은 각 샘플에 대 한 시 약 믹스의 10.5 µ L에 대 한 호출합니다. 각 시 약을 추가 하기 전에 소용돌이를 있는지 확인 하십시오.- 5.6 µ L nuclease 무료 물, 0.5 µ L DMSO, 1.25 µ L 10 버퍼 II에 대 한 AmpliTaq DNA 중 합 효소, 배 및 25 mm MgCl 2, 1.375 µ L 및 25 mM dNTP의 0.125 µ L의 mastermix 준비.
- 100 µ M tva-3의 0.125 µ L 추가 (5 '-GCCCTGGGGAAGGTCCTGCCC-3 ')와 100 µ M tva-5의 0.125 µ L (5 '-CTGCTGCCCGGTAACGTGACCGG-3 ')는 mastermix 하.
- 10 µ M B2m 뇌관 믹스는 mastermix 내부 컨트롤의 추가 1.275 µ L.
- 0.125 µ L를 추가 AmpliTaq DNA 중 합 효소는 mastermix 하.
- 는 손가락으로 튜브를 터치 하 여는 mastermix 믹스. 3-5 초 동안 짧게 원심 분리기 기계에서 mastermix 아래로 회전.
- 각 개인에 게는 mastermix에서 aliquot 10.5 µ L PCR 튜브합니다. 새로운 튜브에 aliquoting 하기 전에 때마다 소용돌이.
- 소용돌이 각 PCR 튜브에 2µL genomic DNA 템플렛을 추가 하 고. 위에서 설명한 대로 genomic DNA 준비.
- 터치 하 여 솔루션을 믹스와 원심 분리기 짧게 3-5 미에 대 한 튜브에 넣어 PCR 기계.
- 는 PCR 조건 초기 변성, 30의 35 주기 다음에 대 한 92 ° C에서 2 분 설정 됩니다 s 변성, 30 대 94 ° C에서 어 닐 링, 확장, 72 ° C에서 30 초 및 최종 연장 위한 72 ° C에서 10 분 동안 60 ° C에서 s.
- PCR를 마치면 각 샘플 염료 로드 x 6의 3 µ L를 추가 합니다. 터치 하 고 잠시 3-5 미에 대 한 원심 분리기에 의해 혼합
- PCR 제품에서 1 x TAE 버퍼에는 2% (w/v) agarose 젤 전기 이동 법으로 검사 합니다. Tva와 B2m PCR 제품의 크기는 500 bp와 300 bp, 각각.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vivo에서 그리고 생체 외에서 감염 속도 RIP-태그; RIP-tva RCASBP 기반 바이러스에 의해 종양 세포는 20~ 20%와 ~ 80% 각각. RIP 태그; RIP-tva 마우스 모델, 각 마우스에 400 췌 장 독도의 약 4% 종양 20;에 개발 자연스럽 게 따라서 바이러스에 의해 전달 되는 유전자의 잠재적인 효과의 조직학 및 phenotypic 분석에 대 한 각 마우스에서 종양 세포의 충분 한 금액이입니다. 이 시스템을 사용 하 여, 전이에서 Bcl xL의 새로운 핵 기능 확인 된 9이었다. RIP-태그; RIP-tva RCASBP-Bcl xL 감염 쥐 전시 높은 발생률 침략 carcinomas의 제어 바이러스에 감염 된 생쥐 보다 RCASBP-ALPP 74% (96%). 또한, RCASBP-xL-에 Bcl의47%-감염 RIP-태그; RIP-tva 마우스 개발 때 아무 전이 제어 쥐 20에서 발견 하는 동안 (그림 3A)의 16 주에 안락사 췌 림프절에 전이.
또한, 우리 RIP-태그;에서 암 유전자의 도서관 상영 RIP-tva 마우스, 전이 췌장암의 림프절과 간 21 (그림 3B와 3c)을 추진 하 고 첫 번째 유전자를 확인 하 고. 이 유전자 hyaluronan 중재 운동 B isoform (RHAMMB) 단백질에 대 한 수용 체 인코딩하고 EGFR 21신호를 활성화 합니다. 우리는 그 간 특정 전이 실험 전이 있는 N134 종양 세포는 처음 받는 사람 immunodeficient 마우스 21의 폐 모 세관 침대를 통해 유통의 꼬리 정 맥 분석 결과 지 수 설명 했다.
그림 1 : RCASBP(A), RCAS-X 및 Y RCAS 구문을의 도식. 복제 사이트, 굵은 글꼴로 표시 됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2 : Intracardiac 주입의 위치. 해부학 적 랜드마크 (화이트에 명시 된) 흉 골에 수평 파선으로 표시 됩니다. 마우스의 피부에 sternal 노치와 xyphoid 프로세스, 랜드마크로 서 역할 하 고 바늘 삽입 중간 흉 골에서 1 m m 이며 약간 (해 부)는 흉 골의 왼쪽. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3 : Immunostaining에 의해 검출 전이성 췌 장 β 세포. 사진 표시 대표 synaptophysin 전이성 췌 장 신경 내 분 비 종양 (A, B) 췌 장의 림프 노드 또는 간 (C)의 얼룩. RIP-태그; RIP-tva 쥐 나이의 7 주에 표시 된 RCASBP 레트로 바이러스에 감염 되었고 나이의 16 주에 안락사. 눈금 막대 = 50 µ m. 원래 확대 = 20 X. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
이 연구에서 설명 하는 강력한 마우스 모델, RIP-태그; RIP-tva, 식별 및 전이성 요인의 특성에 대 한 조류 레트로 바이러스를 통해 체세포 유전자 납품을 달성 하기 위해. 비록 RIP-태그; RIP-tva 마우스 췌 장 신경 내 분 비 종양, 전이성 요인이 마우스 모델에서 확인 된 또한 다른 암 종류의 전이 홍보 수 있습니다.
우리의 접근 시간 제어 방식으로, 따라서 더 충실 하 게 흉내 낸 산발적 인 인간 종양 개발에 특히 췌 장 β 세포의 premalignant 병 변으로 체세포 유전자 변화 소개의 이점이 있다. 이 방법은 기존의 유전자 변형 모델 개발 중 관심사의 유전자의 소성 식 때문에 종종 관찰 되는 정상적인 조직 형성의 어떤 잠재적인 섭 동을 방지 합니다. 또한, 그것은 관심을 생성 하는 유전자 변형 쥐 보다 유전자를 운반 하는 조류 retroviral 벡터를 생성 하는 훨씬 더 빨리입니다. RCASBP 파생 조류 retroviral 벡터에 tva 표현 세포 생체 외에서 그리고 vivo에서cDNAs (≤2.5 kb), shRNAs, miRNAs, 및 다른 noncoding RNAs를 제공할 수 있습니다. 감염 (그리고 여러 감염)의 효율 대상 셀의 확산 속도 셀의 액세스 가능성에 따라 달라 집니다. titer > ml 당 1 x 108 전염 성 단위는 vivo에서 감염에 대 한 필요. 더 효율적인 바이러스 배달 달성 생체 외에서 유도 된 세포 증식과 바이러스를 모든 셀의 반복 노출의 가능성이 될 수 있습니다.
정확한 intracardiac 주입 기술은 생쥐의 생존 능력에 대 한 중요 하다. 첫째, 바이러스 성 현 탁 액을 그리기 전에 인슐린 주사기에서 공기 공간의 50 µ l 심장 펄스를 보고 결정적 이다. 둘째, 그것은 혈액의 빨간색 펄스 나타나면 주사기의 위치를 수정 하 고 주사기에 표시 혈액의 밝은 빨간 펄스를 볼 때마다 천천히 10-20 µ l 바이러스 성 현 탁 액을 제공 하는 것이 중요. 혈액의 밝은 빨간색 펄스 10-20 µ l 바이러스 성 현 탁 액의 납품 후에 중지, 약간 바늘 위치 도움이 됩니다. 셋째, 마지막 밀어 바이러스 성 현 탁 액을 제공 하는 플런저와 혈액 펄스를 보고 하기 전에, 후 바늘 흉에서 신속 하 게 제거 되 고 부드러운 압력 사출 사이트에 적용 된 내부 출혈을 줄이기 위해 도움이 될 것입니다. 마지막으로, 다시 인슐린 주사기 다른 마우스에 사용 하지 마십시오.
미래 응용 프로그램,이 RIP-태그; RIP-tva 마우스 모델 다른 유전자 변형, 노크, 및 녹아웃 마우스 모델 결합 될 수 있다. 또한, 우리는이 RIP-태그; 결합 구상 RIP-tva 단일 지점 돌연변이, 삭제, 게놈 재배열 뒤집어 및 translocations 22등을 생성 하 게놈 편집 도구 CRISPR Cas9 마우스 모델.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
저자는 공개 없다.
Acknowledgments
우리는 해 롤 드 Varmus, 브라이언 C. 루이스, 더글러스 Hanahan, 대 니 황, 샤론 Pang, 메 간 웡, 그리고 Manasi M. Godbole 감사합니다. Y.C.N.D.는 국방부 그랜트 W81XWH-16-1-0619와 NIH 그랜트 1R01CA204916에 의해 지원 됩니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RCASBP-Y DV plasmid | Addgene | 11478 | |
| RCAS-RNAi plasmid | Addgene | 15182 | |
| DMEM | Corning | 10-013-CV | |
| fetal bovine serum | Atlanta Biologicals | 25-005-CI | |
| L-glutamine, 100x | Corning | 25-005-CI | |
| Penicillin-Streptomycin solution, 100x | Corning | 30-002-CI | |
| PBS-/-, 1x | Corning | 21-040-CV | |
| Superfect | Qiagen | 301305 | |
| Polyallomer centrifuge tube | Beckman Coulter | 326823 | |
| 0.45 mm Nalgene Syringe Filters with PES Membrane |
Thermo Scientific | 194-2545 | |
| Insulin Syringes | BD | 329461 | |
| synaptophysin | Vector Laboratories | VP-S284 | |
| VECTASTAIN Elite ABC HRP Kit (Peroxidase, Rabbit IgG) | Vector Laboratories | PK-6101 | |
| AmpliTaq DNA Polymerase with Buffer II | Life Technologies | N8080153 | |
| MyTaq DNA Polymerase | Bioline | BIO-21106 |
References
- Vogelstein, B., Kinzler, K. W.
- Walrath, J. C., Hawes, J. J., Van Dyke, T., Reilly, K. M. Genetically engineered mouse models in cancer research. Adv Cancer Res. 106, 113-164 (2010).
- Khanna, C., Hunter, K.
- Du, Y. C., Lewis, B. C., Hanahan, D., Varmus, H. Assessing tumor progression factors by somatic gene transfer into a mouse model: Bcl-xL promotes islet tumor cell invasion. PLoS biology. 5 (10), e276 (2007).
- Hanahan, D. Heritable formation of pancreatic beta-cell tumours in transgenic mice expressing recombinant insulin/simian virus 40 oncogenes. Nature. 315 (6015), 115-122 (1985).
- Fisher, G. H., et al. Development of a flexible and specific gene delivery system for production of murine tumor models. Oncogene. 18 (38), 5253-5260 (1999).
- Orsulic, S. An RCAS-TVA-based approach to designer mouse models. Mamm Genome. 13 (10), 543-547 (2002).
- Tuveson, D., Hanahan, D. Translational medicine: Cancer lessons from mice to humans. Nature. 471 (7338), 316-317 (2011).
- Choi, S., et al. Bcl-xL promotes metastasis independent of its anti-apoptotic activity. Nat Commun. 7, 10384 (2016).
- Naik, P., Karrim, J., Hanahan, D. The rise and fall of apoptosis during multistage tumorigenesis: down-modulation contributes to tumor progression from angiogenic progenitors. Genes Dev. 10 (17), 2105-2116 (1996).
- Hughes, S. H., Greenhouse, J. J., Petropoulos, C. J., Sutrave, P. Adaptor plasmids simplify the insertion of foreign DNA into helper-independent retroviral vectors. J Virol. 61 (10), 3004-3012 (1987).
- Petropoulos, C. J., Payne, W., Salter, D. W., Hughes, S. H. Appropriate in vivo expression of a muscle-specific promoter by using avian retroviral vectors for gene transfer [corrected]. J Virol. 66 (6), 3391-3397 (1992).
- Dunn, K. J., Williams, B. O., Li, Y., Pavan, W. J. Neural crest-directed gene transfer demonstrates Wnt1 role in melanocyte expansion and differentiation during mouse development. Proc Natl Acad Sci USA. 97 (18), 10050-10055 (2000).
- Loftus, S. K., Larson, D. M., Watkins-Chow, D., Church, D. M., Pavan, W. J. Generation of RCAS vectors useful for functional genomic analyses. DNA Res. 8 (5), 221-226 (2001).
- Bromberg-White, J. L., et al. Delivery of short hairpin RNA sequences by using a replication-competent avian retroviral vector. J Virol. 78 (9), 4914-4916 (2004).
- Harpavat, S., Cepko, C. L. RCAS-RNAi: a loss-of-function method for the developing chick retina. BMC Dev Biol. 6 (2), (2006).
- Huse, J. T., et al. The PTEN-regulating microRNA miR-26a is amplified in high-grade glioma and facilitates gliomagenesis in vivo. Genes Dev. 23 (11), 1327-1337 (2009).
- Ahronian, L. G., Lewis, B. C. Generation of high-titer RCAS virus from DF1 chicken fibroblasts. Cold Spring Harb Protoc. 2014 (11), 1161-1166 (2014).
- Green, M. R., Sambrook, J., Sambrook, J. Molecular cloning: a laboratory manual. , 4th ed, Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2012).
- Du, Y. C., Lewis, B. C., Hanahan, D., Varmus, H. Assessing tumor progression factors by somatic gene transfer into a mouse model: Bcl-xL promotes islet tumor cell invasion. PLoS Biol. 5 (10), 2255-2269 (2007).
- Du, Y. C., Chou, C. K., Klimstra, D. S., Varmus, H. Receptor for hyaluronan-mediated motility isoform B promotes liver metastasis in a mouse model of multistep tumorigenesis and a tail vein assay for metastasis. Proc Natl Acad Sci USA. 108 (40), 16753-16758 (2011).
- Guernet, A., Grumolato, L. CRISPR/Cas9 editing of the genome for cancer modeling. Methods. , (2017).
