In Situ Caractérisation des Biofilms MR1 Shewanella oneidensis par SALVI et ToF-SIMS

Summary

Cet article présente une méthode pour cultiver un biofilm pour in situ de microanalyse ions secondaires de temps de vol pour la cartographie chimique à l’état hydraté, activée par un réacteur de la microfluidique, système d’analyse à l’Interface liquide de vide. La MR de Shewanella oneidensis -1 avec la protéine fluorescente verte a été utilisé comme modèle.

Abstract

Biofilms bactériens sont associés à la surface des communautés qui sont largement étudiées pour comprendre leurs auto-produit substances polymériques extracellulaires (EPS) et leurs rôles en microbiologie environnementale. Cette étude décrit une méthode pour cultiver le biofilm attachement au système pour l’analyse à l’Interface liquide de vide (SALVI) et réaliser in situ une cartographie chimique d’un biofilm vivant par spectrométrie de masse à ions secondaires de temps de vol (ToF-SIMS). Ceci est fait par le biais de la mise en culture des bactéries dans le chenal SALVI avec notre configuration spécialisé tant à l’extérieur, ainsi que par le biais de techniques d’imagerie optiques pour détecter la présence de biofilm et l’épaisseur avant l’analyse par ToF-SIMS. Nos résultats montrent les pics caractéristiques du biofilm Shewanella dans son état naturel hydraté, mettant en valeur son environnement de cluster eau localisée, ainsi que les EPS fragments qui sont radicalement différents de même du biofilm déshydraté État. Ces résultats démontrent la capacité de la percée de SALVI qui permet pour l’imagerie de biofilm in situ avec un instrument d’imagerie chimique axée sur le vide.

Introduction

Biofilms bactériens sont associés à la surface des communautés qui ont évolué au fil du temps comme un moyen de défense aux bactéries pour survivre variant des stimuli physiques et mécaniques indésirables, dans lequel les cellules sont capables de fixer et de survivre dans de nombreux environnements possibles. ^{1 , 2} les Biofilms sont largement étudiées et ont des applications dans de nombreux domaines tels que la biomédecine, de génie biomédical, de l’agriculture et de recherche industrielle et de développement. ^{1 , 2} comprendre la cartographie chimique de ces communautés microbiennes complexes, y compris leurs auto-produit substances polymériques extracellulaires (EPS) et leur environnement local eau-cluster, est essentiel pour obtenir un précis et détaillé représentation de leurs activités biologiques. ²

Biofilms exister et se développer au sein d’un état fortement hydraté. Cela représente un grand défi en utilisant des techniques d’analyse de surface axée sur le vide comme la spectrométrie de masse à ions secondaires de temps de vol (ToF-SIMS) en raison des difficultés dans l’étude des liquides volatils dans le vide. Ainsi, les techniques d’analyse de surface axée sur le vide sont limitaient presque exclusivement à l’étude des échantillons de biofilm à seulement leur état séché. Toutefois, étudier un biofilm dans son état séché inhibe l’enquête précise de son microenvironnement vrai biologique. Il provoque souvent des changements drastiques à la morphologie de l’intégrité et le biofilm EPS, qui a été démontrée après avoir comparé les résultats spectraux biofilm sec aux études in situ liquide. ^{3 , 4} cet article présente une solution pour l’étude des biofilms dans leur état naturel hydratée grâce à l’utilisation de notre système d’analyse à l’Interface liquide de vide (SALVI),^5,6 un réacteur microfluidique qui contient le liquide sous sa membrane silicium mince de nitrure (NAS) dans un MICROCANAL de polydiméthylsiloxane (PMDS), offrant ainsi un accès direct au faisceau sonde ionique secondaire tout en conservant l’intégrité structurale de la matrice liquide sous vide chambre. ^{7 , 8}

S. oneidensis MR-1 muté pour exprimer la protéine de fluorescence verte (GFP) a été choisie comme organisme modèle dans cet exemple de procédure de biofilm en raison de sa polyvalence métabolique et l’utilisation commune en microbiologie environnementale et appliquée, qui reposait lourdement sur sa capacité unique pour la réduction de métal et de transfert d’électron extracellulaire. ^{9 , 10 , 11} en outre, la présence de GFP tolérée pour facile biofilm-épaisseur continue par l’intermédiaire de la microscopie en fluorescence, à l’aide d’un filtre de fluorescéine isothiocyanate (FITC). Nos études antérieures ont montré des preuves de cette bactérie favorisant l’attachement à la fenêtre de péché en l’utilisant dans operando imagerie de fluorescence pour la croissance de biofilm d’une épaisseur de jusqu’à une centaine de micromètres. ^{4 , 12} alors que cet article discutera seulement la confirmation de la présence de biofilm par microscopie à fluorescence, la SALVI est compatible avec d’autres méthodes d’imagerie optiques comme la Super-résolution imagerie de fluorescence (c.-à-d., structurée illumination microscopie (SIM)⁹) et confocale microscopie à balayage laser (CLSM) imagerie⁴). Imagerie optique peut servir à mesurer l’épaisseur du biofilm et obtenir une image 3D de la forme du biofilm, tel qu’il apparaît, confirmant son épaisseur et son attachement à la fenêtre de péché. ⁹ tandis que GFP a été utilisé dans l’analyse de SIMS, s. oneidensis sans GFP a été utilisé pour la courbe de croissance, comme cette seule mesure requise de la densité optique et ne nécessitait pas de toute imagerie de fluorescence. En général, la différence entre la GFP tag et espèces non balisés dans la courbe de croissance sont insignifiante. En outre, alors que ce protocole utilise S. oneidensis MR-1 GFP comme un organisme modèle pour décrire la procédure, cette procédure est conçue pour une souche bactérienne pouvant être requises pour la culture au sein de SALVI. Bien que, compte tenu des connaissances de la souche bactérienne nécessaire, certaines conditions de croissance tels que temps, température et oxygène environnement peuvent doivent être modifiées pour tenir compte de la souche de la bactérie à utiliser. Pour le milieu de croissance, cette procédure utilise « nanofils » bouillon de medium, trypticase soja (TSB) sans dextrose et gélose trypticase soja (TSA) sans dextrose pour la culture. La composition du milieu « nanofils » a été spécialement formulée pour la croissance et pour la surveillance des prolongements de la membrane et le périplasme S. oneidensis qui semblent prendre la forme de petits fils et la composition du milieu a été établi dans des recherches antérieures. ^{13 , 14}

Notre protocole précédent sur in situ liquide ToF-SIMS a illustré l’avantage que SALVI a à offrir pour l’immobilisation de la protéine et l’attachement pour le péché, mais aussi un protocole détaillé sur la réduction des données et analyse ToF-SIMS. ¹² plutôt que de répéter les étapes de réduction de données, ce document servira à plutôt se concentrer sur l’approche unique de mise en place et en cultivant des biofilms dans notre microchannel SALVI, ainsi que les mesures d’imagerie pour détecter la présence de biofilm et épaisseur préalable à l’analyse de ToF-SIMS. Alors que les biofilms ont été jusque-là limités aux séchées uniquement des échantillons au sein de la chambre du vide basé sur des techniques d’analyse surfaces, EPS et biofilm cartographie chimique détaillée des biofilms vivants peut maintenant être obtenue in situ en raison de cette nouvelle capacité.

Protocol

1. préparation des matériaux Préparation du tube support flacons de sérum (un par culture de biofilm et trois par la courbe de croissance) Remarque : comme indiqué dans l’introduction, toute croissance moyen approprié de fournir les nutriments nécessaires pour la souche de bactéries d’intérêt peut être utilisé pour cette procédure ; dans ce cas, " nanofils " médias et BST sans milieu de dextrose a été utilisé pour la croissance de S. oneidensis<…

Representative Results

Ces résultats représentatifs servent à montrer comment le profil chimique du biofilm ci-joint peut être identifié et interprété, obtenus par le biais de ToF-SIMS. Après traçage des spectres de masse d’acquisition de données de ToF-SIMS, a souligné brièvement dans la section procédures, identification des pics devrait être effectuée afin d’affecter des identités à chaque valeur de m/z respectifs. Ceci est possible grâce à l’analyse documentaire approfondie sur la s…

Discussion

Après inoculation à la phase logarithmique, il est important de tester le nombre de jours et de la température à laquelle le biofilm devrait croître avant qu’il soit sain et assez épais pour l’imagerie, comme indiqué au point 3.1. Cette procédure couvre spécifiquement cultivant un S. oneidensis MR1 biofilm à température ambiante ; Cependant, des températures ambiantes différentes peuvent influencer le taux de croissance. Par conséquent, il est essentiel d’utiliser l’imagerie optique pour comprendre…

Materials

ToF-SIMS	IONTOF	TOF.SIMS 5	Resolution:>10,000 m/Δm for mass resolution;>4,000 m/Δm for high spatial resolution
System for Analysis at the Liquid Vacuum Interface (SALVI)	Pacific Northwest National Laboratory	N/A	SALVI is a unique, self-contained, portable analytical tool that, for the first time, enables vacuum based scientific instruments such as time-of-flight secondary ion mass spectrometry (ToF-SIMS) to analyze liquid surfaces in their natural state at the molecular level.
-80°C Freezer	New Brunswick Scientific	N/A	U410 Premium Energy Efficient Ultra-Low Temperature Freezer
4°C Refrigerator	BioCold Scientific	N/A	COLDBOX1
Orbital Shaker	New Brunswick Scientific	N/A	Innova 4900 Multi-Tier Environmental Shaker, set at 30 degrees Celsius for serum bottle and flask culturing, set at 150rpm.
Syringe Pump	Cole-Parmer	EW-74905-02	Cole-Parmer Syringe Pump, Infusion Only, Touchscreen Control 74905-02, used for injecting liquid into the tubing system and SALVI at a constant flowrate.
Incubator	Barnstead International	LT1465X3	Lab-Line incubator, set at 30 degrees Celsius for plate culturing.
Autoclave	Getinge	533LS	Used to sterilize PEEK fittings, tubing systems, serum vials, and medium. Model 533LS Vacuum Steam Sterilizer
Spectrophotometer	Thermo Fisher Scientific	4001-000	GENESYS 20 spectrophotometer for OD600 readings of cuvettes for growth curves.
Biological Safety Cabinet	Thermo Fisher Scientific	1385	1300 Series AZ Biological Safety Cabinet
Fluorescence Microscope	Nikon	N/A	Nikon OPTIPHOT-2 fluorescence microscope with camera and super high pressure mercury lamp power supply.
pH Meter	Mettler Toledo	51302803	Used to test the pH of the “nanowires” medium after finished and before autoclaving.
PEEK Union	Valco	ZU1TPK	For connecting the inlet and outlet of SALVI, the syringe to the tubing system, and the inlet of the SALVI to the drip chamber of the tubing system.
5 Axes Sample Stage	IONTOF	N/A	Stage is self-made for mounting SALVI in ToF-SIMS.
Barnstead Nanopure Water Purification System	Thermo Fisher Scientific	D11921	ROpure LP Reverse Osmosis filtration module (D2716)
Pipette	Thermo Fisher Scientific	21-377-821	Range: 100 to 1,000 µL.
Pipette Tip	Neptune	2112.96.BS	1,000 µL pipette tips
Razor Blade Handle	Stanley	N/A	Stanley Bostitch Razor Blade Scraper with 5 Single-Edge Blades, used for cutting PTFE tubing
Syringe	BD	309659	1 mL
Syringe	BD	309657	3 mL
Syringe	BD	309646	5 mL; Used for making the drip chamber
Syringe	BD	309604	10 mL
Syringe	BD	302830	20 mL
Disposable Pipette	Thermo Fisher Scientific	13-678-11	25 mL Fisherbrand™ Sterile Polystyrene Disposable Serological Pipets with Magnifier Stripe, for filling serum bottles.
Electric Pipette Filler	Pipet-aid	P-57260	Vacuum pressure electric serological pipette filler
Serum Bottle	Sigma	33109-U	Holds approximately 69 mL of liquid for culture growth, optimum for use of 20mL culture per bottle.
Anaerobic Culture Tube	VWR	89167-178	Anaerobic Tubes, 18 x 150 mm, Supplied with 20 mm Blue Butyl Rubber Stopper and Aluminum Seal.
Rubber Stopper	Sigma	27235-U	Silicone stopper, used for sealing serum bottles and for creating the tubing system/drip chamber.
Aluminum Crimp Seal (without septum)	Sigma	27227-U	Aluminum seal for top of serum bottle for use with serum bottle crimper.
Serum Bottle Aluminum Seal Crimper	Wheaton	224307	30 mm crimper with standard seal.
PTFE Tubing	Supelco	58697-U	1.58 mm OD x 0.5 mm ID 50 ft. PTFE Teflon tubing, used for creating the tubing system.
Disposable Cuvettes	GMBH	759085D	1.5 Ml for use with spectrophotometer.
Needle	BD	303015	22G; used for serum bottle injection.
Needle	BD	305120	23G; used for punching-through rubber stopper to create drip tubing system.
Shewanella oneidensis MR-1 with GFP	N/A	N/A	Matthysse AG, Stretton S, Dandie C, McClure NC, & Goodman AE (1996) Construction of GFP vectors for use in Gram-negative bacteria other than Escherichia coli. FEMS Microbiol Lett 145(1):87-94.
Ethanol	Thermo Fisher Scientific	S25310A	95% Denatured
TSA	BD	212305	Tryptic soy agar for culturing the model organism (S. oneidensis) used in this protocol
PIPES Buffer	Sigma	P-1851	Used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Sodium Hydroxide	Sigma	S-5881	Used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Ammonium Chloride	Sigma	A-5666	Used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Potassium Chloride	Sigma	P-4504	Used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Sodium Phosphate Monobasic	Sigma	S-9638	Used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Sodium Chloride	Thermo Fisher Scientific	S271-3	Used for “nanowires” medium, and used to make mineral solution used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Sodium lactate	Sigma	L-1375	60%(w/w) syrup @ 98% pure, d=1.3 g/mL, 7M, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Sodium Bicarbonate	Sigma	S-5761	Used to make ferric NTA solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Nitrilotriacetic Acid Trisodium Salt	Sigma	N-0253	Used to make ferric NTA solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Iron (III) Chloride	Sigma	451649	Used to make ferric NTA solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Magnesium Sulfate	Sigma	208094	Used to make minerals solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Manganese (II) Sulfate Monohydrate	Sigma	M-7634	Used to make minerals solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Iron(II) Sulfate Heptahydrate	Sigma	215422	Used to make minerals solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Calcium Chloride Dihydrate	Sigma	223506	Used to make minerals solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Cobalt(II) Chloride	Sigma	60818	Used to make minerals solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Zinc Chloride	Sigma	229997	Used to make minerals solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Copper(II) Sulfate Pentahydrate	Sigma	C-8027	Used to make minerals solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Aluminum Potassium Sulfate Dodecahydrate	Sigma	237086	Used to make minerals solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Boric Acid	Sigma	B-6768	Used to make minerals solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Sodium Molybdate Dihydrate	Sigma	331058	Used to make minerals solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Nickel(II) Chloride	Sigma	339350	Used to make minerals solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Sodium Tungstate Dihydrate	Sigma	14304	Used to make minerals solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
D-Biotin	Sigma	47868	Used to make vitamin solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Folic Acid	Sigma	F-7876	Used to make vitamin solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Pyridoxine Hydrochloride	Sigma	P-9755	Used to make vitamin solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Riboflavin (B2)	Sigma	47861	Used to make vitamin solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Thiamine Hydrochloride	Sigma	T-4625	Used to make vitamin solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Nicotinic Acid	Sigma	N4126	Used to make vitamin solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
D-Pantothenic Acid Hemicalcium Salt	Sigma	21210	Used to make vitamin solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Vitamin B12	Sigma	V-2876	Used to make vitamin solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
4-Aminobenzoic Acid	Sigma	A-9878	Used to make vitamin solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Thioctic Acid	Sigma	T-1395	Used to make vitamin solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}