בחיי עיר אפיון Biofilms MR1 Shewanella oneidensis על ידי SALVI וסימס תוף

Summary

מאמר זה מציג שיטה לגידול ממבנה biofilm עבור בחיי עיר יון משני זמן-של-טיסה ספקטרומטר מסה למיפוי כימי במצב רטוב, מופעל על ידי כור microfluidic, מערכת לניתוח-הממשק ואקום נוזלי. מר Shewanella oneidensis -1 עם פלורסצנטיות ירוק חלבון שימשה כמודל.

Abstract

Biofilms חיידקי הן קהילות השטח-הקשורים נלמדים במידה רבה להבין שלהם (EPS) מתוצרת עצמית חוץ-תאית חומרים פולימריים ותפקידיהם ב מיקרוביולוגיה סביבתית. מחקר זה מתאר שיטה לטפח biofilm המצורף למערכת לניתוח-ממשק נוזלי ואקום (SALVI) ולהשיג בחיי עיר מיפוי כימי של ממבנה biofilm חי על ידי יון משני זמן-של-טיסה ספקטרומטר מסה (תוף-SIMS). פעולה זו מתבצעת באמצעות culturing של חיידקים גם בחוץ וגם בתוך הערוץ SALVI עם ההתקנה המקצועית שלנו, כמו גם באמצעות טכניקות דימות אופטי כדי לזהות את הנוכחות biofilm ואת עובי לפני ניתוח תוף-סימס. התוצאות שלנו להראות הפסגות האופיינית של biofilm Shewanella רטוב במצבו הטבעי, סימון על מים מקומי אשכול הסביבה שלה, כמו גם EPS שאינם שונים באופן דרסטי של biofilm באותו מיובש המדינה. תוצאות אלה מדגימים את יכולת פריצת דרך SALVI המאפשר בחיי עיר biofilm הדמיה במכשיר מבוסס-ואקום כימי הדמיה.

Introduction

Biofilms חיידקי הן קהילות הקשורים השטח אשר התפתחו במשך הזמן כהגנה על חיידקים לשרוד משתנה לגירויים פיזיים ועל מכניים שלילית, שבו תאים מסוגלים לצרף ולשרוד בסביבות אפשריות רבות. ^{1 , 2} Biofilms נחקרות במידה רבה, יש יישומים בתחומים רבים כגון וההתערבות, הנדסה ביו-רפואית, חקלאות, תעשייה מחקר ופיתוח. ^{1 , 2} . הבנת המיפוי כימי של קהילות חיידקים אלה מורכבים, כולל שלהם (EPS) מתוצרת עצמית חוץ-תאית חומרים פולימריים וסביבתם מים מקומיים-אשכול, חיוני להשגת מדויקת ומפורטת תיאור הפעילות הביולוגית שלהם. ²

Biofilms להתקיים ולגדול בתוך מדינה מאוד רטוב. מהווה אתגר גדול באמצעות ניתוח משטח מבוססי וואקום טכניקות כגון יון משני זמן-של-טיסה ספקטרומטר מסה (תוף-SIMS) עקב הקושי בלימוד נוזלים נדיפים בואקום. כתוצאה מכך, טכניקות מבוססות ואקום ניתוח משטח היה מוגבל כמעט אך ורק ללמוד biofilm דגימות-רק מדינתם מיובשים. עם זאת, ללמוד ממבנה biofilm במצבו מיובשים מעכב החקירה מדויק של microenvironment הביולוגית האמיתית שלו. היא גורמת לעיתים קרובות שינויים דרסטיים EPS biofilm ובטחונו המורפולוגיה, אשר הוכח לאחר השוואת תוצאות המוני ספקטרלי biofilm יבש בחיי עיר ללימודי נוזלי. ^{3 , 4} מאמר זה מציג פתרון עבור הלומדים biofilms בתוך hydrated במצבן הטבעי על ידי העסקת את השימוש במערכת שלנו לניתוח-נוזלי ואקום ממשק (SALVI),^5,6 כור microfluidic את זה מכיל נוזל תחת הממברנה ניטריד (חטא) שלו סיליקון דק ב- microchannel עשוי polydimethylsiloxane (כרונית), ובכך מספק גישה ישירה על הקורה בדיקה יון משני תוך שמירה על שלמות המבנה של המטריקס נוזלי בתוך ואקום . תא ^{7 , 8}

Oneidensis ס מר-1 מוטציה לבטא חלבון פלורסצנטיות ירוק (GFP) נבחר כאורגניזם מודל להמחשה הליך זה biofilm בשל צדדיות מטבולית שלה שימוש נפוץ ב מיקרוביולוגיה סביבתית ושימושית, אשר היה מבוסס בכבדות על יכולת ייחודית שלה עבור הפחתת מתכת והעברת-אלקטרונים חוץ-תאית. ^{9 , 10 , 11} . בנוסף, הנוכחות של GFP מותרת עבור קל רציפה biofilm-עובי ניטור באמצעות מיקרוסקופ פלורסצנטיות, באמצעות מסנן isothiocyanate (FITC) fluorescein. מחקרים קודמים שלנו הראו עדות של חיידקים זה העדפה מצורף אל החלון חטא שימוש ב operando קרינה פלואורסצנטית הדמיה לצמיחה biofilm בעובי של עד 100 מיקרומטר. ^{4 , 12} בעוד מאמר זה ידון רק האישור של הנוכחות של biofilm דרך מיקרוסקופ פלורסצנטיות, SALVI הוא תואם עם שיטות דימות אופטי אחרות כגון סופר-רזולוציה קרינה פלואורסצנטית הדמיה (קרי, מובנית תאורה מיקרוסקופ (SIM)⁹) ו לייזר קונפוקלי סורק מיקרוסקופ (CLSM) הדמיה⁴). דימות אופטי יכול לשמש כדי למדוד את עובי biofilm, לקבל תמונה תלת-ממדית של, צורת biofilm כפי שהוא מופיע, המאשרת את עוביו ואת הקשר שלה אל החלון חטא. ⁹ בזמן GFP נעשה שימוש בניתוח סימס, S. oneidensis ללא GFP על עקומת הגדילה, שימש מדידה זו נדרשת רק של צפיפות אופטית, לא מחייבים כל הדמיה פלורסנט. בדרך כלל, ההבדל בין ה-GFP מתויג, מינים לא מתויגת בתוך עקומת גדילה נמצא חסר חשיבות. בנוסף, בעוד פרוטוקול זה משתמש oneidensis ס מר-1 GFP כאורגניזם מודל כדי לתאר את התהליך, הליך זה מיועד עבור כל זן חיידקי כי ייתכן שיהיה צורך לטיפוח בתוך SALVI. אמנם, לאור הידע של המתח חיידקי צריך, כמה תנאים לצמיחה כגון זמן, טמפרטורת הסביבה חמצן ייתכן שתצטרך להיות שונה כדי להתאים את המתח של חיידקים כדי לשמש. עבור מדיום הגידול, הליך זה משתמש “nanowires” בינוני, tryptic סויה מרק (TSB) ללא דקסטרוז, סויה tryptic אגר (TSA) ללא דקסטרוז culturing. ההרכב של “nanowires” בינוני כבר במיוחד ניסח עבור הצמיחה, ניטור של הרחבות של הקרום ומאז periplasm של oneidensis ס המופיעות לקחת את הצורה של חוטים קטנים, של הקומפוזיציה בינוני הוקם בתוך מחקרים קודמים. ^{13 , 14}

הפרוטוקול הקודם שלנו בב באתרו ToF נוזלי-סימס יש מאויר היתרון שיש SALVI להציע עבור חלבון הנייח וקובץ מצורף החטא, כמו גם פרוטוקול מפורט על הפחתת ניתוח ונתונים תוף-סימס. ¹² יותר מאשר לחזור על הצעדים להפחתת נתונים, הנייר הזה ישמש להתמקד במקום הגישה הייחודית של הגדרת וטיפוח biofilms בתוך microchannel SALVI שלנו, כמו גם את השלבים הדמיה לזהות נוכחות biofilm ועובי מוקדמת תוף-סימס לניתוח. בעוד biofilms היה מוגבל בעבר כדי רק מיובש דגימות בתוך התא של מבוססי וואקום את השטח בשיטות אנליטיות, מפורט EPS ו- biofilm כימי מיפוי של biofilms בשידור חי כעת ניתן להשיג בחיי עיר בגלל יכולת חדשה זו.

Protocol

1. הכנה של חומרים הכנה של בינוני אבובים בקבוקים סרום (אחד צורך לכל שלוש זקוקים לכל עקומת גדילה והתרבות biofilm) הערה: כפי שצוין במבוא, צמיחה בינוני מתאים לספק את החומרים המזינים הדרושים המתח של חיידקים עניין יכול להיות מנוצל עבור הליך זה; במקרה זה, " nanowires " TSB ללא דקסטרו…

Representative Results

התוצאות נציג לשרת כדי להראות איך לפרופיל כימי של biofilm המצורפת יכול להיות מזוהה לפרש, כפי שהושג דרך תוף-סימס. לאחר התוויית ספקטרה המונית של ייבוא נתונים תוף-סימס, מודגש בקצרה במקטע הליכים, זיהוי שיא וצריך להתנהל כדי להקצות זהויות לכל ערך מ בהתאמה/z. ניתן לבצע זאת באמצעות סקי?…

Discussion

לאחר מזריקים בשלב-יומן, חשוב לבחון את מספר ימים ואת הטמפרטורה שבה תגדל biofilm לפני שזה בריא ועבה מספיק עבור הדמיה, כפי שמתואר בשלב 3.1. הליך זה מכסה במפורש culturing oneidensis ס MR1 biofilm בטמפרטורת החדר; עם זאת שונים בטמפרטורות החדר יכול להשפיע על קצב גידול. לכן, חיוני להשתמש הדמיה אופטית כדי להבין אם biofilm י?…

Materials

ToF-SIMS	IONTOF	TOF.SIMS 5	Resolution:>10,000 m/Δm for mass resolution;>4,000 m/Δm for high spatial resolution
System for Analysis at the Liquid Vacuum Interface (SALVI)	Pacific Northwest National Laboratory	N/A	SALVI is a unique, self-contained, portable analytical tool that, for the first time, enables vacuum based scientific instruments such as time-of-flight secondary ion mass spectrometry (ToF-SIMS) to analyze liquid surfaces in their natural state at the molecular level.
-80°C Freezer	New Brunswick Scientific	N/A	U410 Premium Energy Efficient Ultra-Low Temperature Freezer
4°C Refrigerator	BioCold Scientific	N/A	COLDBOX1
Orbital Shaker	New Brunswick Scientific	N/A	Innova 4900 Multi-Tier Environmental Shaker, set at 30 degrees Celsius for serum bottle and flask culturing, set at 150rpm.
Syringe Pump	Cole-Parmer	EW-74905-02	Cole-Parmer Syringe Pump, Infusion Only, Touchscreen Control 74905-02, used for injecting liquid into the tubing system and SALVI at a constant flowrate.
Incubator	Barnstead International	LT1465X3	Lab-Line incubator, set at 30 degrees Celsius for plate culturing.
Autoclave	Getinge	533LS	Used to sterilize PEEK fittings, tubing systems, serum vials, and medium. Model 533LS Vacuum Steam Sterilizer
Spectrophotometer	Thermo Fisher Scientific	4001-000	GENESYS 20 spectrophotometer for OD600 readings of cuvettes for growth curves.
Biological Safety Cabinet	Thermo Fisher Scientific	1385	1300 Series AZ Biological Safety Cabinet
Fluorescence Microscope	Nikon	N/A	Nikon OPTIPHOT-2 fluorescence microscope with camera and super high pressure mercury lamp power supply.
pH Meter	Mettler Toledo	51302803	Used to test the pH of the “nanowires” medium after finished and before autoclaving.
PEEK Union	Valco	ZU1TPK	For connecting the inlet and outlet of SALVI, the syringe to the tubing system, and the inlet of the SALVI to the drip chamber of the tubing system.
5 Axes Sample Stage	IONTOF	N/A	Stage is self-made for mounting SALVI in ToF-SIMS.
Barnstead Nanopure Water Purification System	Thermo Fisher Scientific	D11921	ROpure LP Reverse Osmosis filtration module (D2716)
Pipette	Thermo Fisher Scientific	21-377-821	Range: 100 to 1,000 µL.
Pipette Tip	Neptune	2112.96.BS	1,000 µL pipette tips
Razor Blade Handle	Stanley	N/A	Stanley Bostitch Razor Blade Scraper with 5 Single-Edge Blades, used for cutting PTFE tubing
Syringe	BD	309659	1 mL
Syringe	BD	309657	3 mL
Syringe	BD	309646	5 mL; Used for making the drip chamber
Syringe	BD	309604	10 mL
Syringe	BD	302830	20 mL
Disposable Pipette	Thermo Fisher Scientific	13-678-11	25 mL Fisherbrand™ Sterile Polystyrene Disposable Serological Pipets with Magnifier Stripe, for filling serum bottles.
Electric Pipette Filler	Pipet-aid	P-57260	Vacuum pressure electric serological pipette filler
Serum Bottle	Sigma	33109-U	Holds approximately 69 mL of liquid for culture growth, optimum for use of 20mL culture per bottle.
Anaerobic Culture Tube	VWR	89167-178	Anaerobic Tubes, 18 x 150 mm, Supplied with 20 mm Blue Butyl Rubber Stopper and Aluminum Seal.
Rubber Stopper	Sigma	27235-U	Silicone stopper, used for sealing serum bottles and for creating the tubing system/drip chamber.
Aluminum Crimp Seal (without septum)	Sigma	27227-U	Aluminum seal for top of serum bottle for use with serum bottle crimper.
Serum Bottle Aluminum Seal Crimper	Wheaton	224307	30 mm crimper with standard seal.
PTFE Tubing	Supelco	58697-U	1.58 mm OD x 0.5 mm ID 50 ft. PTFE Teflon tubing, used for creating the tubing system.
Disposable Cuvettes	GMBH	759085D	1.5 Ml for use with spectrophotometer.
Needle	BD	303015	22G; used for serum bottle injection.
Needle	BD	305120	23G; used for punching-through rubber stopper to create drip tubing system.
Shewanella oneidensis MR-1 with GFP	N/A	N/A	Matthysse AG, Stretton S, Dandie C, McClure NC, & Goodman AE (1996) Construction of GFP vectors for use in Gram-negative bacteria other than Escherichia coli. FEMS Microbiol Lett 145(1):87-94.
Ethanol	Thermo Fisher Scientific	S25310A	95% Denatured
TSA	BD	212305	Tryptic soy agar for culturing the model organism (S. oneidensis) used in this protocol
PIPES Buffer	Sigma	P-1851	Used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Sodium Hydroxide	Sigma	S-5881	Used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Ammonium Chloride	Sigma	A-5666	Used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Potassium Chloride	Sigma	P-4504	Used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Sodium Phosphate Monobasic	Sigma	S-9638	Used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Sodium Chloride	Thermo Fisher Scientific	S271-3	Used for “nanowires” medium, and used to make mineral solution used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Sodium lactate	Sigma	L-1375	60%(w/w) syrup @ 98% pure, d=1.3 g/mL, 7M, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Sodium Bicarbonate	Sigma	S-5761	Used to make ferric NTA solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Nitrilotriacetic Acid Trisodium Salt	Sigma	N-0253	Used to make ferric NTA solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Iron (III) Chloride	Sigma	451649	Used to make ferric NTA solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Magnesium Sulfate	Sigma	208094	Used to make minerals solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Manganese (II) Sulfate Monohydrate	Sigma	M-7634	Used to make minerals solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Iron(II) Sulfate Heptahydrate	Sigma	215422	Used to make minerals solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Calcium Chloride Dihydrate	Sigma	223506	Used to make minerals solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Cobalt(II) Chloride	Sigma	60818	Used to make minerals solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Zinc Chloride	Sigma	229997	Used to make minerals solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Copper(II) Sulfate Pentahydrate	Sigma	C-8027	Used to make minerals solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Aluminum Potassium Sulfate Dodecahydrate	Sigma	237086	Used to make minerals solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Boric Acid	Sigma	B-6768	Used to make minerals solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Sodium Molybdate Dihydrate	Sigma	331058	Used to make minerals solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Nickel(II) Chloride	Sigma	339350	Used to make minerals solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Sodium Tungstate Dihydrate	Sigma	14304	Used to make minerals solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
D-Biotin	Sigma	47868	Used to make vitamin solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Folic Acid	Sigma	F-7876	Used to make vitamin solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Pyridoxine Hydrochloride	Sigma	P-9755	Used to make vitamin solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Riboflavin (B2)	Sigma	47861	Used to make vitamin solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Thiamine Hydrochloride	Sigma	T-4625	Used to make vitamin solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Nicotinic Acid	Sigma	N4126	Used to make vitamin solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
D-Pantothenic Acid Hemicalcium Salt	Sigma	21210	Used to make vitamin solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Vitamin B12	Sigma	V-2876	Used to make vitamin solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
4-Aminobenzoic Acid	Sigma	A-9878	Used to make vitamin solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Thioctic Acid	Sigma	T-1395	Used to make vitamin solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}