Dieser Artikel stellt eine Methode für den Anbau eines Biofilms für in Situ Time-of-Flight secondary Ion Massenspektrometrie für chemische Zuordnung im hydratisierten Zustand durch einen mikrofluidischen Reaktor, System zur Analyse an der flüssigen Vakuum-Schnittstelle aktiviert. Die Shewanella Oneidensis MR-1 mit grünen Fluoreszenz-Protein wurde als Modell verwendet.
Bakterielle Biofilme sind Oberfläche-assoziierte Gemeinschaften, die stark untersucht werden, um ihre selbst produzierten extrazellulären Polymeren Substanzen (EPS) und ihre Rolle im Umweltmikrobiologie zu verstehen. Diese Studie beschreibt eine Methode zum Biofilm Bindung an das System für die Analyse bei flüssigen Vakuum Schnittstelle (SALVI) zu kultivieren und in Situ chemische Zuordnung der lebende Biofilm durch Time-of-Flight secondary Ion mass Spectrometry (ToF-SIMS) zu erreichen. Dies geschieht durch die Kultivierung von Bakterien sowohl außerhalb als auch innerhalb des Kanals SALVI mit unseren spezialisierten Einrichtung sowie durch optische bildgebende Verfahren zur Erkennung von Biofilm Präsenz und Stärke vor der ToF-SIMS-Analyse. Unsere Ergebnisse zeigen die charakteristischen Gipfel des Biofilms Shewanella in seinem Naturzustand hydratisiert dehydriert Hervorhebung auf seine lokalisierte Wasser-Cluster-Umgebung, sowie EPS Fragmente, die sich drastisch von des gleichen Biofilms unterscheiden Zustand. Diese Ergebnisse zeigen die Durchbruch-Fähigkeit von SALVI, der in Situ Biofilm Bildgebung mit einem Vakuum-basierten chemischen Bildgebung Instrument ermöglicht.
Bakterielle Biofilme sind Oberfläche-assoziierte Gemeinschaften, die im Laufe der Zeit als eine Verteidigung gegen Bakterien überleben unterschiedlicher ungünstige physikalische und mechanische reizen, wobei Zellen in der Lage sind zu befestigen und in vielen möglichen Umgebungen überleben entwickelt haben. 1 , 2 Biofilme werden erheblich untersucht und finden Anwendung in vielen Bereichen wie Biomedizin, biomedizinische Technik, Landwirtschaft und industrielle Forschung und Entwicklung. 1 , 2 die chemische Zuordnung dieser komplexe mikrobielle Gemeinschaften, einschließlich ihre selbst produzierten extrazellulären Polymeren Substanzen (EPS) und ihre lokalen Wasser-Cluster-Umgebung zu verstehen gilt, gewinnt eine genaue und detaillierte Darstellung ihrer biologischen Aktivitäten. 2
Biofilme bestehen und wachsen innerhalb eines stark hydratisiert Staates. Dies stellt eine große Herausforderung im Umgang mit Vakuum-basierten Oberflächenanalyse Techniken wie Time-of-Flight secondary Ion mass Spectrometry (ToF-SIMS) aufgrund der Schwierigkeiten bei der Untersuchung der flüchtiger Flüssigkeiten im Vakuum. Infolgedessen wurden Vakuum-basierten Oberflächenanalyse Techniken beschränkt sich fast ausschließlich auf Biofilm Proben im getrockneten Zustand zu studieren. Studium einen Biofilm im getrockneten Zustand hemmt jedoch die genaue Untersuchung der seine wahre biologische Mikroumgebung. Es führt oft zu drastische Veränderungen der EPS Integrität und Biofilm-Morphologie, die nach einem Vergleich trocken Biofilm Masse spektrale Ergebnisse in Situ flüssige Studien nachgewiesen wurde. 3 , 4 dieser Artikel stellt eine Lösung für das Studium von Biofilmen innerhalb ihrer natürlichen hydratisierten Zustand durch die Verwendung unseres Systems zur Analyse an flüssigen Vakuum Schnittstelle (SALVI),5,6 mikrofluidischen Reaktor, enthält Flüssigkeit unter seine dünne Silizium-Nitrid (SiN) Membran in eine Microchannel gemacht von Polydimethylsiloxan (PMDS), so bietet direkten Zugang zu den sekundären Ionenstrahl Sonde unter Beibehaltung der strukturellen Integritätdes der flüssigen Matrix in einem luftleeren Raum Kammer. 7 , 8
S. Oneidensis MR-1 mutiert auszudrücken, grüne Fluoreszenz-Protein (GFP) wurde gewählt, als Modellorganismus für dieser Biofilm Verfahren Abbildung aufgrund seiner metabolischen Vielseitigkeit und gemeinsame Nutzung in Umwelt- und angewandte Mikrobiologie, basiert stark auf seine einzigartige Fähigkeit zur Verringerung der Metall und extrazelluläre Elektronentransfer. 9 , 10 , 11 darüber hinaus ermöglichte das Vorhandensein von GFP einfach kontinuierliche Biofilm-Dicke Überwachung durch Fluoreszenz-Mikroskopie, mithilfe eines Filters Fluorescein erfolgt (FITC). Unsere frühere Studien haben Hinweise auf diese Bakterien begünstigt Anlage zum Fenster SiN mit in Operando Fluoreszenz-Bildgebung für Biofilm Wachstum bis zu einer Dicke von bis zu hundert Mikrometern gezeigt. 4 , 12 während dieses Papier nur die Bestätigung der Biofilm Präsenz durch Fluoreszenzmikroskopie besprechen, die SALVI ist kompatibel mit anderen optischen bildgebenden Verfahren wie Höchstauflösung Fluoreszenz-Bildgebung (d. h. die strukturierte Beleuchtung Mikroskopie (SIM)9) und konfokale Laser-scanning-Mikroskopie (CLSM) imaging-4). Optische Bildgebung kann dienen zur Messung der Dicke von Biofilm und ein 3D-Bild der Form des Biofilms erhalten, wie es scheint, seine Stärke und seine Verbundenheit mit der Sünde-Fenster bestätigt. 9 während GLP diente in der SIMS-Analyse, S. Oneidensis , ohne GFP diente für die Wachstumskurve, als diese nur erforderliche Messung der optischen Dichte und Fluoreszenz-Bildgebung nicht erforderlich. In der Regel die Differenz zwischen der GFP markiert und untagged Arten in der Wachstumskurve ist bedeutungslos. Darüber hinaus während dieses Protokoll S. Oneidensis MR-1 GFP als Modellorganismus verwendet, um das Verfahren zu beschreiben, ist dieses Verfahren für jeden Bakterienstamm ausgelegt, die für den Anbau in SALVI erforderlich sein kann. Obwohl Wissen der bakteriellen Belastung benötigt gegeben, müssen einige Bedingungen wie Zeit, Temperatur und Sauerstoff-Umgebung den Bakterienstamm zu verwendende angepasst werden. Wachstumsmedium verwendet dieses Verfahren “Nanodrähte” Mittel, tryptic Soy Bouillon (TSB) ohne Traubenzucker und tryptic Soy Agar (TSA) ohne Traubenzucker zur Kultivierung. Die Zusammensetzung des “Nanodrähte” Medium speziell formuliert für das Wachstum und für die Überwachung von Erweiterungen der Membran und Periplasma S. Oneidensis , die angezeigt werden, nehmen die Form von kleinen Drähten und die mittlere Zusammensetzung wurde in früheren Untersuchungen niedergelassen. 13 , 14
Unsere vorherigen Protokoll auf in Situ illustrierte flüssige ToF-SIMS nutzen SALVI für Protein Immobilisierung und Verbundenheit mit der Sünde, sowie ein detailliertes Protokoll auf ToF-SIMS Analyse und Datenreduktion zu bieten hat. 12 statt Daten Reduzierung Schritte wiederholen, wird dieses Papier dienen sich stattdessen auf den einzigartigen Ansatz der Einrichtung und Pflege von Biofilmen innerhalb unserer SALVI Microchannel sowie die bildgebenden Schritte zur Erkennung von Biofilm Präsenz und Stärke vor ToF-SIMS-Analyse. Während Biofilme zuvor begrenzt worden, haben nur getrocknet Proben innerhalb der Kammer Vakuum-basierten analytische Oberflächentechniken, detaillierte EPS und Biofilm chemische Zuordnung von Biofilmen Leben jetzt in Situ durch diese neue Funktion erhalten.
Nach dem impfen bei Log-Phase, ist es wichtig, die Anzahl der Tage und die Temperatur bei dem der Biofilm wachsen sollte, bevor es gesund und dick genug für die Bildgebung, wie unter Punkt 3.1 beschrieben testen. Dieses Verfahren umfasst speziell Kultivierung einer S. Oneidensis MR1 Biofilm bei Raumtemperatur; jedoch können unterschiedliche Raumtemperaturen die Wachstumsrate beeinflussen. Daher ist es wichtig um zu verstehen, ob der Biofilm bereit, bevor Sie fortfahren, ToF-SIMS Analyse ist verwenden optische Bildgebun…
The authors have nothing to disclose.
Wir sind dankbar für Unterstützung des Pacific Northwest National Laboratory (PNNL) Erde und biologischen Wissenschaften (EBD) Mission Samen Labor leitete Forschung und Entwicklung (LDRD) Fonds. Instrumental wurde durch W. R. Wiley Umwelt Molecular Sciences Laboratory (EMSL) allgemeine Benutzer Vorschlag zur Verfügung. EMSL ist eine nationale wissenschaftliche Benutzer Einrichtung Büro der biologischen und ökologischen Forschung (BER) auf PNNL gesponsert. Die Autoren danken Dr. Yuanzhao Ding zum Beweis das Manuskript zu lesen und nützliche Rückmeldungen. Battelle für DOE unter Vertrag DE AC05 76RL01830 PNNL gesteuert.
ToF-SIMS | IONTOF | TOF.SIMS 5 | Resolution:>10,000 m/Δm for mass resolution;>4,000 m/Δm for high spatial resolution |
System for Analysis at the Liquid Vacuum Interface (SALVI) | Pacific Northwest National Laboratory | N/A | SALVI is a unique, self-contained, portable analytical tool that, for the first time, enables vacuum based scientific instruments such as time-of-flight secondary ion mass spectrometry (ToF-SIMS) to analyze liquid surfaces in their natural state at the molecular level. |
-80°C Freezer | New Brunswick Scientific | N/A | U410 Premium Energy Efficient Ultra-Low Temperature Freezer |
4°C Refrigerator | BioCold Scientific | N/A | COLDBOX1 |
Orbital Shaker | New Brunswick Scientific | N/A | Innova 4900 Multi-Tier Environmental Shaker, set at 30 degrees Celsius for serum bottle and flask culturing, set at 150rpm. |
Syringe Pump | Cole-Parmer | EW-74905-02 | Cole-Parmer Syringe Pump, Infusion Only, Touchscreen Control 74905-02, used for injecting liquid into the tubing system and SALVI at a constant flowrate. |
Incubator | Barnstead International | LT1465X3 | Lab-Line incubator, set at 30 degrees Celsius for plate culturing. |
Autoclave | Getinge | 533LS | Used to sterilize PEEK fittings, tubing systems, serum vials, and medium. Model 533LS Vacuum Steam Sterilizer |
Spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | 4001-000 | GENESYS 20 spectrophotometer for OD600 readings of cuvettes for growth curves. |
Biological Safety Cabinet | Thermo Fisher Scientific | 1385 | 1300 Series AZ Biological Safety Cabinet |
Fluorescence Microscope | Nikon | N/A | Nikon OPTIPHOT-2 fluorescence microscope with camera and super high pressure mercury lamp power supply. |
pH Meter | Mettler Toledo | 51302803 | Used to test the pH of the “nanowires” medium after finished and before autoclaving. |
PEEK Union | Valco | ZU1TPK | For connecting the inlet and outlet of SALVI, the syringe to the tubing system, and the inlet of the SALVI to the drip chamber of the tubing system. |
5 Axes Sample Stage | IONTOF | N/A | Stage is self-made for mounting SALVI in ToF-SIMS. |
Barnstead Nanopure Water Purification System | Thermo Fisher Scientific | D11921 | ROpure LP Reverse Osmosis filtration module (D2716) |
Pipette | Thermo Fisher Scientific | 21-377-821 | Range: 100 to 1,000 µL. |
Pipette Tip | Neptune | 2112.96.BS | 1,000 µL pipette tips |
Razor Blade Handle | Stanley | N/A | Stanley Bostitch Razor Blade Scraper with 5 Single-Edge Blades, used for cutting PTFE tubing |
Syringe | BD | 309659 | 1 mL |
Syringe | BD | 309657 | 3 mL |
Syringe | BD | 309646 | 5 mL; Used for making the drip chamber |
Syringe | BD | 309604 | 10 mL |
Syringe | BD | 302830 | 20 mL |
Disposable Pipette | Thermo Fisher Scientific | 13-678-11 | 25 mL Fisherbrand™ Sterile Polystyrene Disposable Serological Pipets with Magnifier Stripe, for filling serum bottles. |
Electric Pipette Filler | Pipet-aid | P-57260 | Vacuum pressure electric serological pipette filler |
Serum Bottle | Sigma | 33109-U | Holds approximately 69 mL of liquid for culture growth, optimum for use of 20mL culture per bottle. |
Anaerobic Culture Tube | VWR | 89167-178 | Anaerobic Tubes, 18 x 150 mm, Supplied with 20 mm Blue Butyl Rubber Stopper and Aluminum Seal. |
Rubber Stopper | Sigma | 27235-U | Silicone stopper, used for sealing serum bottles and for creating the tubing system/drip chamber. |
Aluminum Crimp Seal (without septum) | Sigma | 27227-U | Aluminum seal for top of serum bottle for use with serum bottle crimper. |
Serum Bottle Aluminum Seal Crimper | Wheaton | 224307 | 30 mm crimper with standard seal. |
PTFE Tubing | Supelco | 58697-U | 1.58 mm OD x 0.5 mm ID 50 ft. PTFE Teflon tubing, used for creating the tubing system. |
Disposable Cuvettes | GMBH | 759085D | 1.5 Ml for use with spectrophotometer. |
Needle | BD | 303015 | 22G; used for serum bottle injection. |
Needle | BD | 305120 | 23G; used for punching-through rubber stopper to create drip tubing system. |
Shewanella oneidensis MR-1 with GFP | N/A | N/A | Matthysse AG, Stretton S, Dandie C, McClure NC, & Goodman AE (1996) Construction of GFP vectors for use in Gram-negative bacteria other than Escherichia coli. FEMS Microbiol Lett 145(1):87-94. |
Ethanol | Thermo Fisher Scientific | S25310A | 95% Denatured |
TSA | BD | 212305 | Tryptic soy agar for culturing the model organism (S. oneidensis) used in this protocol |
PIPES Buffer | Sigma | P-1851 | Used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007} |
Sodium Hydroxide | Sigma | S-5881 | Used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007} |
Ammonium Chloride | Sigma | A-5666 | Used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007} |
Potassium Chloride | Sigma | P-4504 | Used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007} |
Sodium Phosphate Monobasic | Sigma | S-9638 | Used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007} |
Sodium Chloride | Thermo Fisher Scientific | S271-3 | Used for “nanowires” medium, and used to make mineral solution used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007} |
Sodium lactate | Sigma | L-1375 | 60%(w/w) syrup @ 98% pure, d=1.3 g/mL, 7M, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007} |
Sodium Bicarbonate | Sigma | S-5761 | Used to make ferric NTA solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007} |
Nitrilotriacetic Acid Trisodium Salt | Sigma | N-0253 | Used to make ferric NTA solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007} |
Iron (III) Chloride | Sigma | 451649 | Used to make ferric NTA solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007} |
Magnesium Sulfate | Sigma | 208094 | Used to make minerals solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007} |
Manganese (II) Sulfate Monohydrate | Sigma | M-7634 | Used to make minerals solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007} |
Iron(II) Sulfate Heptahydrate | Sigma | 215422 | Used to make minerals solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007} |
Calcium Chloride Dihydrate | Sigma | 223506 | Used to make minerals solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007} |
Cobalt(II) Chloride | Sigma | 60818 | Used to make minerals solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007} |
Zinc Chloride | Sigma | 229997 | Used to make minerals solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007} |
Copper(II) Sulfate Pentahydrate | Sigma | C-8027 | Used to make minerals solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007} |
Aluminum Potassium Sulfate Dodecahydrate | Sigma | 237086 | Used to make minerals solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007} |
Boric Acid | Sigma | B-6768 | Used to make minerals solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007} |
Sodium Molybdate Dihydrate | Sigma | 331058 | Used to make minerals solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007} |
Nickel(II) Chloride | Sigma | 339350 | Used to make minerals solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007} |
Sodium Tungstate Dihydrate | Sigma | 14304 | Used to make minerals solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007} |
D-Biotin | Sigma | 47868 | Used to make vitamin solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007} |
Folic Acid | Sigma | F-7876 | Used to make vitamin solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007} |
Pyridoxine Hydrochloride | Sigma | P-9755 | Used to make vitamin solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007} |
Riboflavin (B2) | Sigma | 47861 | Used to make vitamin solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007} |
Thiamine Hydrochloride | Sigma | T-4625 | Used to make vitamin solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007} |
Nicotinic Acid | Sigma | N4126 | Used to make vitamin solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007} |
D-Pantothenic Acid Hemicalcium Salt | Sigma | 21210 | Used to make vitamin solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007} |
Vitamin B12 | Sigma | V-2876 | Used to make vitamin solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007} |
4-Aminobenzoic Acid | Sigma | A-9878 | Used to make vitamin solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007} |
Thioctic Acid | Sigma | T-1395 | Used to make vitamin solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007} |