In Situ Charakterisierung von Shewanella Oneidensis MR1 Biofilmen von SALVI und ToF-SIMS

Summary

Dieser Artikel stellt eine Methode für den Anbau eines Biofilms für in Situ Time-of-Flight secondary Ion Massenspektrometrie für chemische Zuordnung im hydratisierten Zustand durch einen mikrofluidischen Reaktor, System zur Analyse an der flüssigen Vakuum-Schnittstelle aktiviert. Die Shewanella Oneidensis MR-1 mit grünen Fluoreszenz-Protein wurde als Modell verwendet.

Abstract

Bakterielle Biofilme sind Oberfläche-assoziierte Gemeinschaften, die stark untersucht werden, um ihre selbst produzierten extrazellulären Polymeren Substanzen (EPS) und ihre Rolle im Umweltmikrobiologie zu verstehen. Diese Studie beschreibt eine Methode zum Biofilm Bindung an das System für die Analyse bei flüssigen Vakuum Schnittstelle (SALVI) zu kultivieren und in Situ chemische Zuordnung der lebende Biofilm durch Time-of-Flight secondary Ion mass Spectrometry (ToF-SIMS) zu erreichen. Dies geschieht durch die Kultivierung von Bakterien sowohl außerhalb als auch innerhalb des Kanals SALVI mit unseren spezialisierten Einrichtung sowie durch optische bildgebende Verfahren zur Erkennung von Biofilm Präsenz und Stärke vor der ToF-SIMS-Analyse. Unsere Ergebnisse zeigen die charakteristischen Gipfel des Biofilms Shewanella in seinem Naturzustand hydratisiert dehydriert Hervorhebung auf seine lokalisierte Wasser-Cluster-Umgebung, sowie EPS Fragmente, die sich drastisch von des gleichen Biofilms unterscheiden Zustand. Diese Ergebnisse zeigen die Durchbruch-Fähigkeit von SALVI, der in Situ Biofilm Bildgebung mit einem Vakuum-basierten chemischen Bildgebung Instrument ermöglicht.

Introduction

Bakterielle Biofilme sind Oberfläche-assoziierte Gemeinschaften, die im Laufe der Zeit als eine Verteidigung gegen Bakterien überleben unterschiedlicher ungünstige physikalische und mechanische reizen, wobei Zellen in der Lage sind zu befestigen und in vielen möglichen Umgebungen überleben entwickelt haben. ^{1 , 2} Biofilme werden erheblich untersucht und finden Anwendung in vielen Bereichen wie Biomedizin, biomedizinische Technik, Landwirtschaft und industrielle Forschung und Entwicklung. ^{1 , 2} die chemische Zuordnung dieser komplexe mikrobielle Gemeinschaften, einschließlich ihre selbst produzierten extrazellulären Polymeren Substanzen (EPS) und ihre lokalen Wasser-Cluster-Umgebung zu verstehen gilt, gewinnt eine genaue und detaillierte Darstellung ihrer biologischen Aktivitäten. ²

Biofilme bestehen und wachsen innerhalb eines stark hydratisiert Staates. Dies stellt eine große Herausforderung im Umgang mit Vakuum-basierten Oberflächenanalyse Techniken wie Time-of-Flight secondary Ion mass Spectrometry (ToF-SIMS) aufgrund der Schwierigkeiten bei der Untersuchung der flüchtiger Flüssigkeiten im Vakuum. Infolgedessen wurden Vakuum-basierten Oberflächenanalyse Techniken beschränkt sich fast ausschließlich auf Biofilm Proben im getrockneten Zustand zu studieren. Studium einen Biofilm im getrockneten Zustand hemmt jedoch die genaue Untersuchung der seine wahre biologische Mikroumgebung. Es führt oft zu drastische Veränderungen der EPS Integrität und Biofilm-Morphologie, die nach einem Vergleich trocken Biofilm Masse spektrale Ergebnisse in Situ flüssige Studien nachgewiesen wurde. ^{3 , 4} dieser Artikel stellt eine Lösung für das Studium von Biofilmen innerhalb ihrer natürlichen hydratisierten Zustand durch die Verwendung unseres Systems zur Analyse an flüssigen Vakuum Schnittstelle (SALVI),^5,6 mikrofluidischen Reaktor, enthält Flüssigkeit unter seine dünne Silizium-Nitrid (SiN) Membran in eine Microchannel gemacht von Polydimethylsiloxan (PMDS), so bietet direkten Zugang zu den sekundären Ionenstrahl Sonde unter Beibehaltung der strukturellen Integritätdes der flüssigen Matrix in einem luftleeren Raum Kammer. ^{7 , 8}

S. Oneidensis MR-1 mutiert auszudrücken, grüne Fluoreszenz-Protein (GFP) wurde gewählt, als Modellorganismus für dieser Biofilm Verfahren Abbildung aufgrund seiner metabolischen Vielseitigkeit und gemeinsame Nutzung in Umwelt- und angewandte Mikrobiologie, basiert stark auf seine einzigartige Fähigkeit zur Verringerung der Metall und extrazelluläre Elektronentransfer. ^{9 , 10 , 11} darüber hinaus ermöglichte das Vorhandensein von GFP einfach kontinuierliche Biofilm-Dicke Überwachung durch Fluoreszenz-Mikroskopie, mithilfe eines Filters Fluorescein erfolgt (FITC). Unsere frühere Studien haben Hinweise auf diese Bakterien begünstigt Anlage zum Fenster SiN mit in Operando Fluoreszenz-Bildgebung für Biofilm Wachstum bis zu einer Dicke von bis zu hundert Mikrometern gezeigt. ^{4 , 12} während dieses Papier nur die Bestätigung der Biofilm Präsenz durch Fluoreszenzmikroskopie besprechen, die SALVI ist kompatibel mit anderen optischen bildgebenden Verfahren wie Höchstauflösung Fluoreszenz-Bildgebung (d. h. die strukturierte Beleuchtung Mikroskopie (SIM)⁹) und konfokale Laser-scanning-Mikroskopie (CLSM) imaging-⁴). Optische Bildgebung kann dienen zur Messung der Dicke von Biofilm und ein 3D-Bild der Form des Biofilms erhalten, wie es scheint, seine Stärke und seine Verbundenheit mit der Sünde-Fenster bestätigt. ⁹ während GLP diente in der SIMS-Analyse, S. Oneidensis , ohne GFP diente für die Wachstumskurve, als diese nur erforderliche Messung der optischen Dichte und Fluoreszenz-Bildgebung nicht erforderlich. In der Regel die Differenz zwischen der GFP markiert und untagged Arten in der Wachstumskurve ist bedeutungslos. Darüber hinaus während dieses Protokoll S. Oneidensis MR-1 GFP als Modellorganismus verwendet, um das Verfahren zu beschreiben, ist dieses Verfahren für jeden Bakterienstamm ausgelegt, die für den Anbau in SALVI erforderlich sein kann. Obwohl Wissen der bakteriellen Belastung benötigt gegeben, müssen einige Bedingungen wie Zeit, Temperatur und Sauerstoff-Umgebung den Bakterienstamm zu verwendende angepasst werden. Wachstumsmedium verwendet dieses Verfahren “Nanodrähte” Mittel, tryptic Soy Bouillon (TSB) ohne Traubenzucker und tryptic Soy Agar (TSA) ohne Traubenzucker zur Kultivierung. Die Zusammensetzung des “Nanodrähte” Medium speziell formuliert für das Wachstum und für die Überwachung von Erweiterungen der Membran und Periplasma S. Oneidensis , die angezeigt werden, nehmen die Form von kleinen Drähten und die mittlere Zusammensetzung wurde in früheren Untersuchungen niedergelassen. ^{13 , 14}

Unsere vorherigen Protokoll auf in Situ illustrierte flüssige ToF-SIMS nutzen SALVI für Protein Immobilisierung und Verbundenheit mit der Sünde, sowie ein detailliertes Protokoll auf ToF-SIMS Analyse und Datenreduktion zu bieten hat. ¹² statt Daten Reduzierung Schritte wiederholen, wird dieses Papier dienen sich stattdessen auf den einzigartigen Ansatz der Einrichtung und Pflege von Biofilmen innerhalb unserer SALVI Microchannel sowie die bildgebenden Schritte zur Erkennung von Biofilm Präsenz und Stärke vor ToF-SIMS-Analyse. Während Biofilme zuvor begrenzt worden, haben nur getrocknet Proben innerhalb der Kammer Vakuum-basierten analytische Oberflächentechniken, detaillierte EPS und Biofilm chemische Zuordnung von Biofilmen Leben jetzt in Situ durch diese neue Funktion erhalten.

Protocol

1. Vorbereitung der Materialien Vorbereitung der Medium Tubing Serum-Flaschen (eine pro Biofilm Kultur und drei pro Wachstumskurve benötigt benötigt) Hinweis: wie bereits in der Einführung, Wachstum Medium geeignet, um die Nährstoffe benötigt, für den Bakterienstamm Interesse bieten kann für dieses Verfahren genutzt werden; in diesem Fall " Nanodrähte " Medien und TSB ohne Dextrose Medium für das Wachstum von S. Oneidensis MR-1 GLP verwendet wurde. <sup …

Representative Results

Diese repräsentative Ergebnisse dienen, wie das chemische Profil des angehängten Biofilms kann erkannt und interpretiert, zu zeigen, wie durch ToF-SIMS erhalten. Nach dem Plotten Massenspektren von ToF-SIMS Datenerfassung, kurz im Abschnitt “Vorgehensweise” hervorgehoben sollte Peak Identifikation durchgeführt werden, um Identitäten zu jeder jeweiligen m/Z-Wert zuweisen. Dies kann erfolgen durch umfangreiche Literaturrecherche auf Massenspektrometrie auf Bakterien und bestimmte chemis…

Discussion

Nach dem impfen bei Log-Phase, ist es wichtig, die Anzahl der Tage und die Temperatur bei dem der Biofilm wachsen sollte, bevor es gesund und dick genug für die Bildgebung, wie unter Punkt 3.1 beschrieben testen. Dieses Verfahren umfasst speziell Kultivierung einer S. Oneidensis MR1 Biofilm bei Raumtemperatur; jedoch können unterschiedliche Raumtemperaturen die Wachstumsrate beeinflussen. Daher ist es wichtig um zu verstehen, ob der Biofilm bereit, bevor Sie fortfahren, ToF-SIMS Analyse ist verwenden optische Bildgebun…

Materials

ToF-SIMS	IONTOF	TOF.SIMS 5	Resolution:>10,000 m/Δm for mass resolution;>4,000 m/Δm for high spatial resolution
System for Analysis at the Liquid Vacuum Interface (SALVI)	Pacific Northwest National Laboratory	N/A	SALVI is a unique, self-contained, portable analytical tool that, for the first time, enables vacuum based scientific instruments such as time-of-flight secondary ion mass spectrometry (ToF-SIMS) to analyze liquid surfaces in their natural state at the molecular level.
-80°C Freezer	New Brunswick Scientific	N/A	U410 Premium Energy Efficient Ultra-Low Temperature Freezer
4°C Refrigerator	BioCold Scientific	N/A	COLDBOX1
Orbital Shaker	New Brunswick Scientific	N/A	Innova 4900 Multi-Tier Environmental Shaker, set at 30 degrees Celsius for serum bottle and flask culturing, set at 150rpm.
Syringe Pump	Cole-Parmer	EW-74905-02	Cole-Parmer Syringe Pump, Infusion Only, Touchscreen Control 74905-02, used for injecting liquid into the tubing system and SALVI at a constant flowrate.
Incubator	Barnstead International	LT1465X3	Lab-Line incubator, set at 30 degrees Celsius for plate culturing.
Autoclave	Getinge	533LS	Used to sterilize PEEK fittings, tubing systems, serum vials, and medium. Model 533LS Vacuum Steam Sterilizer
Spectrophotometer	Thermo Fisher Scientific	4001-000	GENESYS 20 spectrophotometer for OD600 readings of cuvettes for growth curves.
Biological Safety Cabinet	Thermo Fisher Scientific	1385	1300 Series AZ Biological Safety Cabinet
Fluorescence Microscope	Nikon	N/A	Nikon OPTIPHOT-2 fluorescence microscope with camera and super high pressure mercury lamp power supply.
pH Meter	Mettler Toledo	51302803	Used to test the pH of the “nanowires” medium after finished and before autoclaving.
PEEK Union	Valco	ZU1TPK	For connecting the inlet and outlet of SALVI, the syringe to the tubing system, and the inlet of the SALVI to the drip chamber of the tubing system.
5 Axes Sample Stage	IONTOF	N/A	Stage is self-made for mounting SALVI in ToF-SIMS.
Barnstead Nanopure Water Purification System	Thermo Fisher Scientific	D11921	ROpure LP Reverse Osmosis filtration module (D2716)
Pipette	Thermo Fisher Scientific	21-377-821	Range: 100 to 1,000 µL.
Pipette Tip	Neptune	2112.96.BS	1,000 µL pipette tips
Razor Blade Handle	Stanley	N/A	Stanley Bostitch Razor Blade Scraper with 5 Single-Edge Blades, used for cutting PTFE tubing
Syringe	BD	309659	1 mL
Syringe	BD	309657	3 mL
Syringe	BD	309646	5 mL; Used for making the drip chamber
Syringe	BD	309604	10 mL
Syringe	BD	302830	20 mL
Disposable Pipette	Thermo Fisher Scientific	13-678-11	25 mL Fisherbrand™ Sterile Polystyrene Disposable Serological Pipets with Magnifier Stripe, for filling serum bottles.
Electric Pipette Filler	Pipet-aid	P-57260	Vacuum pressure electric serological pipette filler
Serum Bottle	Sigma	33109-U	Holds approximately 69 mL of liquid for culture growth, optimum for use of 20mL culture per bottle.
Anaerobic Culture Tube	VWR	89167-178	Anaerobic Tubes, 18 x 150 mm, Supplied with 20 mm Blue Butyl Rubber Stopper and Aluminum Seal.
Rubber Stopper	Sigma	27235-U	Silicone stopper, used for sealing serum bottles and for creating the tubing system/drip chamber.
Aluminum Crimp Seal (without septum)	Sigma	27227-U	Aluminum seal for top of serum bottle for use with serum bottle crimper.
Serum Bottle Aluminum Seal Crimper	Wheaton	224307	30 mm crimper with standard seal.
PTFE Tubing	Supelco	58697-U	1.58 mm OD x 0.5 mm ID 50 ft. PTFE Teflon tubing, used for creating the tubing system.
Disposable Cuvettes	GMBH	759085D	1.5 Ml for use with spectrophotometer.
Needle	BD	303015	22G; used for serum bottle injection.
Needle	BD	305120	23G; used for punching-through rubber stopper to create drip tubing system.
Shewanella oneidensis MR-1 with GFP	N/A	N/A	Matthysse AG, Stretton S, Dandie C, McClure NC, & Goodman AE (1996) Construction of GFP vectors for use in Gram-negative bacteria other than Escherichia coli. FEMS Microbiol Lett 145(1):87-94.
Ethanol	Thermo Fisher Scientific	S25310A	95% Denatured
TSA	BD	212305	Tryptic soy agar for culturing the model organism (S. oneidensis) used in this protocol
PIPES Buffer	Sigma	P-1851	Used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Sodium Hydroxide	Sigma	S-5881	Used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Ammonium Chloride	Sigma	A-5666	Used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Potassium Chloride	Sigma	P-4504	Used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Sodium Phosphate Monobasic	Sigma	S-9638	Used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Sodium Chloride	Thermo Fisher Scientific	S271-3	Used for “nanowires” medium, and used to make mineral solution used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Sodium lactate	Sigma	L-1375	60%(w/w) syrup @ 98% pure, d=1.3 g/mL, 7M, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Sodium Bicarbonate	Sigma	S-5761	Used to make ferric NTA solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Nitrilotriacetic Acid Trisodium Salt	Sigma	N-0253	Used to make ferric NTA solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Iron (III) Chloride	Sigma	451649	Used to make ferric NTA solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Magnesium Sulfate	Sigma	208094	Used to make minerals solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Manganese (II) Sulfate Monohydrate	Sigma	M-7634	Used to make minerals solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Iron(II) Sulfate Heptahydrate	Sigma	215422	Used to make minerals solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Calcium Chloride Dihydrate	Sigma	223506	Used to make minerals solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Cobalt(II) Chloride	Sigma	60818	Used to make minerals solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Zinc Chloride	Sigma	229997	Used to make minerals solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Copper(II) Sulfate Pentahydrate	Sigma	C-8027	Used to make minerals solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Aluminum Potassium Sulfate Dodecahydrate	Sigma	237086	Used to make minerals solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Boric Acid	Sigma	B-6768	Used to make minerals solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Sodium Molybdate Dihydrate	Sigma	331058	Used to make minerals solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Nickel(II) Chloride	Sigma	339350	Used to make minerals solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Sodium Tungstate Dihydrate	Sigma	14304	Used to make minerals solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
D-Biotin	Sigma	47868	Used to make vitamin solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Folic Acid	Sigma	F-7876	Used to make vitamin solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Pyridoxine Hydrochloride	Sigma	P-9755	Used to make vitamin solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Riboflavin (B2)	Sigma	47861	Used to make vitamin solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Thiamine Hydrochloride	Sigma	T-4625	Used to make vitamin solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Nicotinic Acid	Sigma	N4126	Used to make vitamin solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
D-Pantothenic Acid Hemicalcium Salt	Sigma	21210	Used to make vitamin solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Vitamin B12	Sigma	V-2876	Used to make vitamin solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
4-Aminobenzoic Acid	Sigma	A-9878	Used to make vitamin solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Thioctic Acid	Sigma	T-1395	Used to make vitamin solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}