その場でサルヴィ、TOF-SIMSシェワネラ oneidensis MR1 バイオ フィルムの特性

Summary

マイクロ流体リアクター、液体真空界面解析システムにより水和状態の化学マッピングのための in situ飛行時間二次イオン質量分析のためのバイオ フィルムの成長のための手法を提案します。緑色蛍光タンパク質を持つシェワネラ oneidensis氏 1 は、モデルとして使用されました。

Abstract

細菌バイオ フィルムの自主制作に細胞外高分子物質 (EPS) と環境微生物学での自分の役割を理解する研究が大幅に表面関連のコミュニティであります。本研究は、バイオ フィルムの添付ファイル分析液体真空インターフェイス (サルヴィ) でのシステムを開拓し、飛行時間二次イオン質量分析 (TOF-SIMS) によってその場で生きているバイオ フィルムの化学マッピングを実現する方法をについて説明します。これは外側と専門のセットアップでは、サルヴィ チャネル内の両方の細菌の培養と同様、バイオ フィルムの存在と TOF-SIMS 解析の前に厚さを検出する光イメージング技術です。我々 の結果は自然な水和状態でシェワネラバイオ フィルムの特徴的なピークを表示によってローカライズされた水クラスター環境、EPS の強調表示のフラグメントは、同じバイオ フィルムから大幅に異なって脱水状態です。これらの結果は、真空ベースの化学イメージング装置とその場観察バイオ イメージングは、サルヴィの画期的な機能を示しています。

Introduction

細菌バイオ フィルム細菌前記細胞が接続し、多くの可能な環境の中で生き残ることができる有害な物理的・機械的刺激の変化を生き残るためにための防衛として時間をかけて進化してきた表面関連のコミュニティであります。^1,2バイオ フィルム大幅に調査した、生体臨床医学、医用生体工学、農業、産業の研究・開発など多くの分野のアプリケーションがあります。^1,2セルフ プロデュースに細胞外高分子物質 (EPS) と、ローカル水クラスター環境などを含むこれらの複雑な微生物の化学マッピングを理解する正確を得る不可欠ですな彼らの生物学的活動の描写です。²

バイオ フィルムは存在し、高含水状態の内で育ちます。これは、揮発性液体の真空の勉強の難しさのため飛行時間二次イオン質量分析 (TOF-SIMS) など真空表面解析テクニックを使用して偉大な課題を提示します。その結果、真空ベースの表面分析技術は、乾燥状態だけでバイオ フィルム サンプルを勉強にほとんど専ら限られています。しかし、乾燥状態でバイオ フィルムを勉強して、真の生物学的微小環境の正確な調査を阻害します。それはしばしば、EPS の整合性とバイオ フィルム形態、その場で液体研究にバイオ フィルムの乾燥質量スペクトル結果を比較した後示されている抜本的な変更が発生します。^3,4この記事分析液体真空インターフェイス (サルヴィ)、^5,6マイクロ流体リアクターでの我々 のシステムの使用を採用することにより自然な水和状態内のバイオ フィルムを勉強するためのソリューションを提示します。したがって真空内液体マトリックスの構造の整合性を維持しながら二次イオンビーム プローブへの直接アクセスを提供するマイクロ ポリジメチルシロキサン (PMDS) の薄いシリコン窒化 (罪) 膜の下で液体が入っています。商工会議所。^7,8

S. oneidensis氏 1 緑色蛍光タンパク質 (GFP) を表現する変異は、その代謝の多様性と環境、応用微生物学、基づいていたで一般的な使用のためこのバイオ フィルムの手順図のモデル生物として選ばれました。大きく上金属還元剤や細胞外の電子転送のための独自の機能。^9,10,11また、GFP の存在は簡単連続バイオ フィルム厚蛍光顕微鏡による監視、フルオレセイン イソチオ シアン酸 (FITC) フィルターを使用しての許可。私たちの以前の研究では、最大 100 μ m の厚さにバイオ フィルムの成長のためoperando の蛍光イメージングを使用して罪ウィンドウに添付ファイルを好むこの細菌の証拠を示しています。^4,12本稿が蛍光顕微鏡によるバイオ フィルムの存在の確認を説明するだけのサルヴィは超解像などその他の光学撮像方法と互換性のある蛍光イメージング (すなわち、構造化照明顕微鏡 (SIM)⁹) および共焦点レーザー走査顕微鏡 (CLSM) 画像⁴)。光イメージングは、バイオ フィルムの厚さを測定する機能し、それは、その厚さと罪ウィンドウへの付着を確認する表示されます、バイオ フィルムの形状の 3 D イメージを取得できます。⁹ GFP は、SIMS 分析で使用された、GFP なしS の oneidensisを成長曲線光学密度のこの唯一の必要な測定として使用され、任意の蛍光イメージングを必要としません。一般的に、タグ付きの GFP の違いと成長曲線のタグの付いていない種が重要ではありません。さらに、このプロトコルは、手順を記述するモデル生物としてs. oneidensis氏 1 GFP を使用して、この手順はサルヴィ内栽培のために必要とされるすべての菌株の設計されています。とはいえ、必要な細菌株の知識を与え、時間、温度、酸素環境など生育条件が使用される細菌の歪みに合わせて変更する必要があります。成長媒体のためこの手順は養殖で、ブドウ糖とブドウ糖なしトリプシン大豆寒天 (TSA) なし「ナノワイヤー」中, トリプシン大豆スープ (TSB) を使用します。成長のため、膜の拡張を監視するため、「ナノワイヤ」中の組成は、特別策定されていますと、細いワイヤと培地成分形を取るように見えるs. oneidensisのペリプラズムがされている以前の研究で確立。^13,14

その場で当社の以前の議定書液体 TOF-SIMS サルヴィは、タンパク質の固定化と TOF-SIMS 解析およびデータ圧縮に関する詳細なプロトコルと同様に、罪に添付ファイルを提供している利点について説明しました。¹²データ削減の手順を繰り返しよりもむしろ本稿になる代わりにセットアップおよびバイオ フィルムの存在と事前の厚みを検出する画像処理の手順と同様に、私たちのサルヴィのマイクロ チャネル内のバイオ フィルムを育成のユニークなアプローチに焦点を当てるTOF-SIMS 解析。バイオ フィルムが以前のみ真空ベース表面分析技術のチャンバ内でサンプルを乾燥する限定されていました、ライブ バイオ フィルムの詳細な EPS とバイオ化学マッピング今入手できますその場でこの新しい機能であるためです。

Protocol

1 材料準備 ミディアム チューブの準備 (バイオ フィルム文化と成長曲線ごとに必要な 3 つごとに必要な 1 つ) 血清ボトル 注: 前述の導入は、任意の成長で。このプロシージャの興味の細菌の緊張のために必要な栄養素を提供するために適切なメディアを利用できます。この場合、" ナノワイヤー " メディアとブドウ糖媒体なし TSB s. oneidensis 氏 1 GFP ?…

Representative Results

これらの代表的な結果は、TOF-SIMS を通じて得られた添付のバイオ フィルムの化学物質のプロファイルを識別して、解釈方法を示すのに役立ちます。質量スペクトル TOF-SIMS データ集録、簡潔に手順セクションで強調表示を印刷後各それぞれ m/z 値識別情報を割り当てるためにピークの同定を実施しなければなりません。これは、細菌や様々 な水のクラスター、脂肪酸?…

Discussion

ログ段階で接種後数日とバイオ フィルムが 3.1 の手順で説明するよう健康とイメージングのため十分な厚さだ前に拡大する温度をテストすることが重要です。S. oneidensis 室温; MR1 バイオ フィルムを養殖具体的手順します。しかし別の部屋の温度の成長率に影響を与えます。したがって、バイオ フィルムは TOF-SIMS 解析に進む前に準備ができているかどうかを理解する光イメージング技術を使?…

Materials

ToF-SIMS	IONTOF	TOF.SIMS 5	Resolution:>10,000 m/Δm for mass resolution;>4,000 m/Δm for high spatial resolution
System for Analysis at the Liquid Vacuum Interface (SALVI)	Pacific Northwest National Laboratory	N/A	SALVI is a unique, self-contained, portable analytical tool that, for the first time, enables vacuum based scientific instruments such as time-of-flight secondary ion mass spectrometry (ToF-SIMS) to analyze liquid surfaces in their natural state at the molecular level.
-80°C Freezer	New Brunswick Scientific	N/A	U410 Premium Energy Efficient Ultra-Low Temperature Freezer
4°C Refrigerator	BioCold Scientific	N/A	COLDBOX1
Orbital Shaker	New Brunswick Scientific	N/A	Innova 4900 Multi-Tier Environmental Shaker, set at 30 degrees Celsius for serum bottle and flask culturing, set at 150rpm.
Syringe Pump	Cole-Parmer	EW-74905-02	Cole-Parmer Syringe Pump, Infusion Only, Touchscreen Control 74905-02, used for injecting liquid into the tubing system and SALVI at a constant flowrate.
Incubator	Barnstead International	LT1465X3	Lab-Line incubator, set at 30 degrees Celsius for plate culturing.
Autoclave	Getinge	533LS	Used to sterilize PEEK fittings, tubing systems, serum vials, and medium. Model 533LS Vacuum Steam Sterilizer
Spectrophotometer	Thermo Fisher Scientific	4001-000	GENESYS 20 spectrophotometer for OD600 readings of cuvettes for growth curves.
Biological Safety Cabinet	Thermo Fisher Scientific	1385	1300 Series AZ Biological Safety Cabinet
Fluorescence Microscope	Nikon	N/A	Nikon OPTIPHOT-2 fluorescence microscope with camera and super high pressure mercury lamp power supply.
pH Meter	Mettler Toledo	51302803	Used to test the pH of the “nanowires” medium after finished and before autoclaving.
PEEK Union	Valco	ZU1TPK	For connecting the inlet and outlet of SALVI, the syringe to the tubing system, and the inlet of the SALVI to the drip chamber of the tubing system.
5 Axes Sample Stage	IONTOF	N/A	Stage is self-made for mounting SALVI in ToF-SIMS.
Barnstead Nanopure Water Purification System	Thermo Fisher Scientific	D11921	ROpure LP Reverse Osmosis filtration module (D2716)
Pipette	Thermo Fisher Scientific	21-377-821	Range: 100 to 1,000 µL.
Pipette Tip	Neptune	2112.96.BS	1,000 µL pipette tips
Razor Blade Handle	Stanley	N/A	Stanley Bostitch Razor Blade Scraper with 5 Single-Edge Blades, used for cutting PTFE tubing
Syringe	BD	309659	1 mL
Syringe	BD	309657	3 mL
Syringe	BD	309646	5 mL; Used for making the drip chamber
Syringe	BD	309604	10 mL
Syringe	BD	302830	20 mL
Disposable Pipette	Thermo Fisher Scientific	13-678-11	25 mL Fisherbrand™ Sterile Polystyrene Disposable Serological Pipets with Magnifier Stripe, for filling serum bottles.
Electric Pipette Filler	Pipet-aid	P-57260	Vacuum pressure electric serological pipette filler
Serum Bottle	Sigma	33109-U	Holds approximately 69 mL of liquid for culture growth, optimum for use of 20mL culture per bottle.
Anaerobic Culture Tube	VWR	89167-178	Anaerobic Tubes, 18 x 150 mm, Supplied with 20 mm Blue Butyl Rubber Stopper and Aluminum Seal.
Rubber Stopper	Sigma	27235-U	Silicone stopper, used for sealing serum bottles and for creating the tubing system/drip chamber.
Aluminum Crimp Seal (without septum)	Sigma	27227-U	Aluminum seal for top of serum bottle for use with serum bottle crimper.
Serum Bottle Aluminum Seal Crimper	Wheaton	224307	30 mm crimper with standard seal.
PTFE Tubing	Supelco	58697-U	1.58 mm OD x 0.5 mm ID 50 ft. PTFE Teflon tubing, used for creating the tubing system.
Disposable Cuvettes	GMBH	759085D	1.5 Ml for use with spectrophotometer.
Needle	BD	303015	22G; used for serum bottle injection.
Needle	BD	305120	23G; used for punching-through rubber stopper to create drip tubing system.
Shewanella oneidensis MR-1 with GFP	N/A	N/A	Matthysse AG, Stretton S, Dandie C, McClure NC, & Goodman AE (1996) Construction of GFP vectors for use in Gram-negative bacteria other than Escherichia coli. FEMS Microbiol Lett 145(1):87-94.
Ethanol	Thermo Fisher Scientific	S25310A	95% Denatured
TSA	BD	212305	Tryptic soy agar for culturing the model organism (S. oneidensis) used in this protocol
PIPES Buffer	Sigma	P-1851	Used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Sodium Hydroxide	Sigma	S-5881	Used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Ammonium Chloride	Sigma	A-5666	Used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Potassium Chloride	Sigma	P-4504	Used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Sodium Phosphate Monobasic	Sigma	S-9638	Used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Sodium Chloride	Thermo Fisher Scientific	S271-3	Used for “nanowires” medium, and used to make mineral solution used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Sodium lactate	Sigma	L-1375	60%(w/w) syrup @ 98% pure, d=1.3 g/mL, 7M, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Sodium Bicarbonate	Sigma	S-5761	Used to make ferric NTA solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Nitrilotriacetic Acid Trisodium Salt	Sigma	N-0253	Used to make ferric NTA solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Iron (III) Chloride	Sigma	451649	Used to make ferric NTA solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Magnesium Sulfate	Sigma	208094	Used to make minerals solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Manganese (II) Sulfate Monohydrate	Sigma	M-7634	Used to make minerals solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Iron(II) Sulfate Heptahydrate	Sigma	215422	Used to make minerals solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Calcium Chloride Dihydrate	Sigma	223506	Used to make minerals solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Cobalt(II) Chloride	Sigma	60818	Used to make minerals solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Zinc Chloride	Sigma	229997	Used to make minerals solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Copper(II) Sulfate Pentahydrate	Sigma	C-8027	Used to make minerals solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Aluminum Potassium Sulfate Dodecahydrate	Sigma	237086	Used to make minerals solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Boric Acid	Sigma	B-6768	Used to make minerals solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Sodium Molybdate Dihydrate	Sigma	331058	Used to make minerals solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Nickel(II) Chloride	Sigma	339350	Used to make minerals solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Sodium Tungstate Dihydrate	Sigma	14304	Used to make minerals solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
D-Biotin	Sigma	47868	Used to make vitamin solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Folic Acid	Sigma	F-7876	Used to make vitamin solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Pyridoxine Hydrochloride	Sigma	P-9755	Used to make vitamin solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Riboflavin (B2)	Sigma	47861	Used to make vitamin solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Thiamine Hydrochloride	Sigma	T-4625	Used to make vitamin solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Nicotinic Acid	Sigma	N4126	Used to make vitamin solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
D-Pantothenic Acid Hemicalcium Salt	Sigma	21210	Used to make vitamin solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Vitamin B12	Sigma	V-2876	Used to make vitamin solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
4-Aminobenzoic Acid	Sigma	A-9878	Used to make vitamin solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Thioctic Acid	Sigma	T-1395	Used to make vitamin solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}