제자리에서 Shewanella oneidensis MR1 Biofilms SALVI 및 ToF 심즈의 특성

Summary

이 문서는 제자리에서 비행 시간 2 차 이온 질량 분석 매핑의 화학 수 화 상태에서 미세 반응 기, 액체 진공 인터페이스에 분석을 위한 시스템으로 사용에 대 한 biofilm 성장을 위한 메서드를 제공 합니다. 녹색 형광 단백질으로 Shewanella oneidensis 미스터 1 모델로 사용 되었다.

Abstract

박테리아 biofilms는 그는 광대 하 게 그들의 자체 생산된 세포 외 고분자 물질 (EPS) 및 환경 미생물학에서 그들의 역할을 이해 하는 표면에 관련 된 지역 사회. 이 연구는 분석 액체 진공 인터페이스 (SALVI)에 대 한 시스템에 biofilm 첨부 파일을 육성하 고 생활 biofilm의 화학 매핑 제자리에서 비행 시간 2 차 이온 질량 분석 (ToF-심즈)에 의해 달성 하는 방법을 설명 합니다. 이 외부와 우리의 전문 설치 SALVI 채널 내의 박테리아의 경작을 통해 뿐만 아니라 biofilm 존재 및 ToF 심즈 분석 전에 두께 감지 하는 광학 이미징 기술을 통해 이루어집니다. 조각 같은 biofilm에서 크게 다른 탈수의 지역화 된 물 클러스터 환경으로 EPS에 강조 우리의 결과, 자연 수 화 상태에서 Shewanella biofilm의 특성 피크를 보여 상태입니다. 이러한 결과 진공 기반 화학 이미징 장비 biofilm 이미징 제자리에 있도록 SALVI의 획기적인 기능을 보여 줍니다.

Introduction

박테리아 biofilms는 점에서 셀 연결 하 고 많은 가능한 환경에서 살아남을 수 있다 불리 한 물리적 및 기계적 자극, 다양 한 생존을 위해 박테리아에 대 한 방어로 시간이 지남에 진화 표면 관련 커뮤니티. ^{1 , 2} Biofilms는 광대 하 게 조사 하 고 의학, 공학, 농업, 그리고 산업 연구 및 개발 등 많은 분야에 응용 프로그램을. ^{1 , 2} 정확 하 필수적 이다 이러한 복잡 한 미생물 지역 사회, 그들의 자체 생산된 세포 외 고분자 물질 (EPS)와 그들의 현지 물-클러스터 환경 등의 화학 매핑을 이해 하 고 상세한 그들의 생물 학적 활동 묘사 ²

Biofilms는 존재 하 고 높은 수 화 상태에서 성장. 이 진공에서 휘발성 액체를 공부에 어려움으로 인해 비행 시간 2 차 이온 질량 분석 (ToF-심즈) 같은 진공 기반 표면 분석 기법을 사용 하 여 큰 도전을 선물 한다. 그 결과, 진공 기반 표면 분석 기법만 말린된 상태에서 biofilm 샘플을 공부 하 고 거의 독점적으로 제한 되었습니다. 그러나, 그것의 진정한 생물 microenvironment의 정확한 조사 억제 말린된 상태에서 biofilm을 공부. 그것은 종종 EPS 무결성 및 biofilm 형태, 건조 biofilm 제자리에 액체 연구 질량 스펙트럼 결과 비교한 후 입증 되었습니다 어떤 과감 한 변경 발생 합니다. ^{3 , 4} 이 문서에서는 분석에는 액체 진공 인터페이스 (SALVI),^5,6 미세 반응 기에 대 한 우리의 시스템의 사용을 채용 하 여 자연 수 화 상태에서 biofilms 공부에 대 한 솔루션 제공을 따라서 여전히 진공 내에서 액체 매트릭스의 구조적 무결성을 유지 하면서 보조 이온 조사 빔에 대 한 직접 액세스를 제공 하는 아닌입니다 (PMDS)의 만든에서 그것의 얇은 실리콘 나이트 라 이드 (죄) 막에서 액체를 포함 약 실입니다. ^{7 , 8}

S. oneidensis 씨-1 녹색 형광 단백질 (GFP)를 표현 하기 위해 돌연변이이 biofilm 절차 그림 변화 다양성 및 기반 환경 및 응용 미생물학에 있는 일반적인 사용에 대 한 모델 생물으로 선정 되었다 금속 감소와 세포 외 전자 전송에 대 한 그것의 독특한 기능에 무 겁 게. ^{9 , 10 , 11} 또한, GFP의 존재를 허용 쉽게 연속 biofilm-두께 형광 현미경 검사 법을 통해 모니터링, fluorescein isothiocyanate (FITC) 필터를 사용 하 여. 우리의 이전 연구 죄 창 최대 1 백 마이크로미터의 두께에 biofilm 성장을 위한 형광 이미징에 operando를 사용 하 여 첨부 파일을 선호 하는이 박테리아의 증거가 나타났습니다. ^{4 , 12} 이 종이 형광 현미경 검사 법을 통해 biofilm의 존재의 확인을 토론할 것 이다, 하는 동안는 SALVI는 슈퍼 해상도 같은 다른 광학 이미징 방법에 호환 형광 이미징 (즉, 구조화 된 조명 현미경 (SIM)⁹) 그리고 confocal 레이저 스캐닝 현미경 검사 법 (CLSM)⁴이미징). 광학 이미징 biofilm 두께 측정을 제공 하 고 표시, 두께 신 창에 첨부 파일을 확인 하는 biofilm의 모양의 3D 이미지를 얻을 수 있습니다. ⁹ 동안 GFP 심즈 분석에 사용 되었다, oneidensis S. GFP 없이 성장 곡선에 대 한 광학 밀도의이 유일한 필요한 측정으로 사용 되었다 어떤 형광 이미징 요구 하지 않았다. 일반적으로, 차이 GFP 태그 및 태그 종 성장 곡선에 중요 하지 않습니다. 또한,이 프로토콜 절차를 설명 하는 모델 생물으로 S. oneidensis 씨 1 GFP를 사용,이 절차는를 위한 SALVI 내 재배에 필요한 수 있습니다 어떤 세균성 긴장. 비록 주어진 필요한 세균성 긴장의 지식, 시간, 온도, 산소 환경 등 일부 성장 조건 사용 될 박테리아의 변형에 맞게 수정 해야 합니다. 성장 매체에 대 한이 절차는 경작에 대 한 포도 당, 포도 당 없이 tryptic 간장 agar (TSA) 없이 “나노 와이어” 중간, tryptic 간장 국물 (TSB)를 사용합니다. 성장에 대 한 고 막의 확장 모니터링에 대 한 “나노 와이어” 매체의 구성 특별히 공식화 되었습니다. 그리고 S. oneidensis 작은 전선과 중간 구성의 모양을 나타나는 periplasm 되었습니다. 이전 연구에서 설립. ^{13 , 14}

현장에서 우리의 이전 프로토콜 액체 ToF-심즈 SALVI 단백질 immobilization와 죄, ToF 심즈 분석 및 데이터 감소에 상세한 프로토콜을 첨부 파일에 대 한 제공 하는 혜택을 설명 했습니다. ¹² 데이터 감소 단계를 되풀이, 보다는 오히려이 종이 될 것입니다 대신 설정 하 고 biofilm 존재와 사전 두께 감지 하는 이미징 단계 뿐 아니라 우리의 SALVI 아닌 내 biofilms 육성의 독특한 접근 방식에 초점을 ToF 심즈 분석 하. Biofilms 이전만 건조 챔버 내에 진공 기반 표면 분석 기법의 샘플을 제한 되어, 하는 동안 라이브 biofilms의 상세한 EPS 및 biofilm 화학 매핑 지금 얻을 수 있습니다 현장에서 이 새로운 기능 때문에.

Protocol

1. 재료의 준비 준비의 중간 튜브 (biofilm 문화와 성장 곡선 당 필요한 3 당 필요 1) 혈 청 병 참고: 어떤 성장 든 지 소개에서 설명 했 듯이 이 절차에 대 한 관심의 박테리아의 변형에 필요한 영양분을 제공 하는 적합 한 매체를 이용 될 수 있다 이 경우에, " 나노 와이어 " 미디어와 포도 당 매체 없이 TSB S. oneidensis 씨 1 GFP의 성장을 위해 사용 되었다. <sup clas…

Representative Results

이러한 대표적인 결과 ToF 심즈를 통해 연결 된 biofilm의 화학 프로필 수 식별 및 해석 하는 방법을 보여을 제공 합니다. ToF 심즈 데이터 수집, 절차 섹션에서 짧게 강조에서 질량 스펙트럼을 플로팅 후 피크 식별 각 각각 m/z 값에는 id를 지정 하려면 실시 한다. 이것은 박테리아와 공부, 등 다양 한 물 클러스터, 지방산, 단백질 조각 박테리아 내에서 있을 것으로 예상 되는 특?…

Discussion

로그 단계에서 접종 후 수 일 및 온도를 그것은 건강 하 고 이미징, 충분히 두꺼운 3.1 단계에서 설명한 대로 전에 biofilm 성장 해야 테스트 중요 하다. 이 절차는 특히 S. oneidensis MR1 biofilm; 실 온에서 배양 커버 그러나 다른 방 온도 성장의 속도 좌우할 수 있다. 따라서, 그것은를 사용 하 여 광학 이미징는 biofilm ToF 심즈 분석을 진행 하기 전에 준비 인지 이해 중요 합니다. 마찬가지로, 박테리아의 다?…

Materials

ToF-SIMS	IONTOF	TOF.SIMS 5	Resolution:>10,000 m/Δm for mass resolution;>4,000 m/Δm for high spatial resolution
System for Analysis at the Liquid Vacuum Interface (SALVI)	Pacific Northwest National Laboratory	N/A	SALVI is a unique, self-contained, portable analytical tool that, for the first time, enables vacuum based scientific instruments such as time-of-flight secondary ion mass spectrometry (ToF-SIMS) to analyze liquid surfaces in their natural state at the molecular level.
-80°C Freezer	New Brunswick Scientific	N/A	U410 Premium Energy Efficient Ultra-Low Temperature Freezer
4°C Refrigerator	BioCold Scientific	N/A	COLDBOX1
Orbital Shaker	New Brunswick Scientific	N/A	Innova 4900 Multi-Tier Environmental Shaker, set at 30 degrees Celsius for serum bottle and flask culturing, set at 150rpm.
Syringe Pump	Cole-Parmer	EW-74905-02	Cole-Parmer Syringe Pump, Infusion Only, Touchscreen Control 74905-02, used for injecting liquid into the tubing system and SALVI at a constant flowrate.
Incubator	Barnstead International	LT1465X3	Lab-Line incubator, set at 30 degrees Celsius for plate culturing.
Autoclave	Getinge	533LS	Used to sterilize PEEK fittings, tubing systems, serum vials, and medium. Model 533LS Vacuum Steam Sterilizer
Spectrophotometer	Thermo Fisher Scientific	4001-000	GENESYS 20 spectrophotometer for OD600 readings of cuvettes for growth curves.
Biological Safety Cabinet	Thermo Fisher Scientific	1385	1300 Series AZ Biological Safety Cabinet
Fluorescence Microscope	Nikon	N/A	Nikon OPTIPHOT-2 fluorescence microscope with camera and super high pressure mercury lamp power supply.
pH Meter	Mettler Toledo	51302803	Used to test the pH of the “nanowires” medium after finished and before autoclaving.
PEEK Union	Valco	ZU1TPK	For connecting the inlet and outlet of SALVI, the syringe to the tubing system, and the inlet of the SALVI to the drip chamber of the tubing system.
5 Axes Sample Stage	IONTOF	N/A	Stage is self-made for mounting SALVI in ToF-SIMS.
Barnstead Nanopure Water Purification System	Thermo Fisher Scientific	D11921	ROpure LP Reverse Osmosis filtration module (D2716)
Pipette	Thermo Fisher Scientific	21-377-821	Range: 100 to 1,000 µL.
Pipette Tip	Neptune	2112.96.BS	1,000 µL pipette tips
Razor Blade Handle	Stanley	N/A	Stanley Bostitch Razor Blade Scraper with 5 Single-Edge Blades, used for cutting PTFE tubing
Syringe	BD	309659	1 mL
Syringe	BD	309657	3 mL
Syringe	BD	309646	5 mL; Used for making the drip chamber
Syringe	BD	309604	10 mL
Syringe	BD	302830	20 mL
Disposable Pipette	Thermo Fisher Scientific	13-678-11	25 mL Fisherbrand™ Sterile Polystyrene Disposable Serological Pipets with Magnifier Stripe, for filling serum bottles.
Electric Pipette Filler	Pipet-aid	P-57260	Vacuum pressure electric serological pipette filler
Serum Bottle	Sigma	33109-U	Holds approximately 69 mL of liquid for culture growth, optimum for use of 20mL culture per bottle.
Anaerobic Culture Tube	VWR	89167-178	Anaerobic Tubes, 18 x 150 mm, Supplied with 20 mm Blue Butyl Rubber Stopper and Aluminum Seal.
Rubber Stopper	Sigma	27235-U	Silicone stopper, used for sealing serum bottles and for creating the tubing system/drip chamber.
Aluminum Crimp Seal (without septum)	Sigma	27227-U	Aluminum seal for top of serum bottle for use with serum bottle crimper.
Serum Bottle Aluminum Seal Crimper	Wheaton	224307	30 mm crimper with standard seal.
PTFE Tubing	Supelco	58697-U	1.58 mm OD x 0.5 mm ID 50 ft. PTFE Teflon tubing, used for creating the tubing system.
Disposable Cuvettes	GMBH	759085D	1.5 Ml for use with spectrophotometer.
Needle	BD	303015	22G; used for serum bottle injection.
Needle	BD	305120	23G; used for punching-through rubber stopper to create drip tubing system.
Shewanella oneidensis MR-1 with GFP	N/A	N/A	Matthysse AG, Stretton S, Dandie C, McClure NC, & Goodman AE (1996) Construction of GFP vectors for use in Gram-negative bacteria other than Escherichia coli. FEMS Microbiol Lett 145(1):87-94.
Ethanol	Thermo Fisher Scientific	S25310A	95% Denatured
TSA	BD	212305	Tryptic soy agar for culturing the model organism (S. oneidensis) used in this protocol
PIPES Buffer	Sigma	P-1851	Used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Sodium Hydroxide	Sigma	S-5881	Used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Ammonium Chloride	Sigma	A-5666	Used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Potassium Chloride	Sigma	P-4504	Used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Sodium Phosphate Monobasic	Sigma	S-9638	Used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Sodium Chloride	Thermo Fisher Scientific	S271-3	Used for “nanowires” medium, and used to make mineral solution used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Sodium lactate	Sigma	L-1375	60%(w/w) syrup @ 98% pure, d=1.3 g/mL, 7M, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Sodium Bicarbonate	Sigma	S-5761	Used to make ferric NTA solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Nitrilotriacetic Acid Trisodium Salt	Sigma	N-0253	Used to make ferric NTA solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Iron (III) Chloride	Sigma	451649	Used to make ferric NTA solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Magnesium Sulfate	Sigma	208094	Used to make minerals solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Manganese (II) Sulfate Monohydrate	Sigma	M-7634	Used to make minerals solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Iron(II) Sulfate Heptahydrate	Sigma	215422	Used to make minerals solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Calcium Chloride Dihydrate	Sigma	223506	Used to make minerals solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Cobalt(II) Chloride	Sigma	60818	Used to make minerals solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Zinc Chloride	Sigma	229997	Used to make minerals solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Copper(II) Sulfate Pentahydrate	Sigma	C-8027	Used to make minerals solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Aluminum Potassium Sulfate Dodecahydrate	Sigma	237086	Used to make minerals solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Boric Acid	Sigma	B-6768	Used to make minerals solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Sodium Molybdate Dihydrate	Sigma	331058	Used to make minerals solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Nickel(II) Chloride	Sigma	339350	Used to make minerals solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Sodium Tungstate Dihydrate	Sigma	14304	Used to make minerals solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
D-Biotin	Sigma	47868	Used to make vitamin solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Folic Acid	Sigma	F-7876	Used to make vitamin solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Pyridoxine Hydrochloride	Sigma	P-9755	Used to make vitamin solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Riboflavin (B2)	Sigma	47861	Used to make vitamin solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Thiamine Hydrochloride	Sigma	T-4625	Used to make vitamin solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Nicotinic Acid	Sigma	N4126	Used to make vitamin solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
D-Pantothenic Acid Hemicalcium Salt	Sigma	21210	Used to make vitamin solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Vitamin B12	Sigma	V-2876	Used to make vitamin solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
4-Aminobenzoic Acid	Sigma	A-9878	Used to make vitamin solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Thioctic Acid	Sigma	T-1395	Used to make vitamin solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}