सीटू में Shewanella oneidensis MR1 की विलक्षण फिल्म ने सालवी और तोफ-सिम्स द्वारा
Summary
यह लेख एक microfluidic रिएक्टर, तरल वैक्यूम अंतरफलक पर विश्लेषण के लिए प्रणाली द्वारा सक्षम अपनी हाइड्रेटेड राज्य में रासायनिक मानचित्रण के लिए उड़ान माध्यमिक आयन जन स्पेक्ट्रोमेट्री के लिए एक सीटू में समय के लिए एक जैव फिल्म के बढ़ते के लिए एक विधि प्रस्तुत करता है । ग्रीन प्रतिदीप्ति प्रोटीन के साथ Shewanella oneidensis एमआर-1 को मॉडल के तौर पर इस्तेमाल किया गया ।
Abstract
बैक्टीरियल फिल्म सतह से जुड़े समुदायों है कि काफी को समझने के लिए अपने स्वयं के उत्पादन extracellular बहुलक पदार्थ (EPS) और पर्यावरण माइक्रोबायोलॉजी में अपनी भूमिकाओं का अध्ययन कर रहे हैं । इस अध्ययन के लिए तरल वैक्यूम इंटरफेस (सालवी) में विश्लेषण के लिए प्रणाली के लिए जैव फिल्म लगाव की खेती और समय की उड़ान माध्यमिक आयन मास स्पेक्ट्रोमेट्री (तोफ-SIMS) द्वारा एक जीवित फिल्म की सीटू रासायनिक मानचित्रण में प्राप्त करने के लिए एक विधि की रूपरेखा । यह दोनों बाहर और हमारे विशेष सेटअप के साथ सालवी चैनल के भीतर जीवाणुओं के संवर्धन के माध्यम से किया जाता है, साथ ही साथ ऑप्टिकल इमेजिंग तकनीक के माध्यम से करने के लिए इस से पहले तोफ-SIMS विश्लेषण से पूर्व फिल्म की उपस्थिति और मोटाई का पता लगाने । हमारे परिणाम अपनी प्राकृतिक हाइड्रेटेड राज्य में Shewanella फिल्म की विशेषता चोटियों दिखाने के लिए, अपने स्थानीयकृत पानी क्लस्टर पर्यावरण पर प्रकाश डाला, साथ ही EPS टुकड़े, जो एक ही फिल्म के निर्जलित से काफी अलग हैं राज्य. ये परिणाम एक निर्वात आधारित रासायनिक इमेजिंग साधन के साथ सीटू जैव फिल्म इमेजिंग में के लिए अनुमति देता है कि सालवी की सफलता की क्षमता प्रदर्शित करता है ।
Introduction
बैक्टीरियल फिल्म सतह से जुड़े समुदायों जो समय के साथ विकसित किया है बैक्टीरिया के लिए एक बचाव के लिए प्रतिकूल शारीरिक और यांत्रिक उत्तेजनाओं बदलती है, जिसमें कोशिकाओं को देते है और कई संभव वातावरण में जीवित रहने में सक्षम हैं । 1 , 2 जैव-फ़िल्मों की काफी जांच की जाती है और कई क्षेत्रों में आवेदन किया है जैसे कि बायोमेडिकल, इंजीनियरिंग, कृषि, और औद्योगिक अनुसंधान और विकास । 1 , 2 इन जटिल माइक्रोबियल समुदायों के रासायनिक मानचित्रण को समझने, उनके स्व-उत्पादित extracellular पॉलिमर पदार्थों (ईपीएस) और उनके स्थानीय जल-क्लस्टर वातावरण सहित, एक सटीक और विस्तृत प्राप्त करने के लिए आवश्यक है उनकी जैविक गतिविधियों का चित्रण । 2
एक उच्च हाइड्रेटेड राज्य के भीतर और विकास के लिए मौजूद है । इस तरह के समय की उड़ान माध्यमिक आयन मास स्पेक्ट्रोमेट्री (तोफ-SIMS) निर्वात में अस्थिर तरल पदार्थ का अध्ययन करने में कठिनाई के कारण के रूप में वैक्यूम आधारित सतह विश्लेषण तकनीकों का उपयोग करने में एक बड़ी चुनौती प्रस्तुत करता है । नतीजतन, वैक्यूम आधारित सतह विश्लेषण तकनीक केवल उनके सूखे राज्य में फिल्म के नमूनों का अध्ययन करने के लिए लगभग विशेष रूप से सीमित किया गया है । हालांकि, इसके सूखे राज्य में एक जैव फिल्म का अध्ययन अपने सच्चे जैविक microenvironment की सही जांच को रोकता है । यह अक्सर EPS अखंडता और बायोमास फिल्म आकृति विज्ञान, जो सूखी फिल्म जन वर्णक्रम के लिए सीटू तरल अध्ययन के परिणाम की तुलना के बाद प्रदर्शन किया गया है के लिए कठोर परिवर्तन का कारण बनता है । 3 , 4 यह लेख तरल वैक्यूम इंटरफेस (सालवी),5,6 एक microfluidic रिएक्टर में विश्लेषण के लिए हमारी प्रणाली के उपयोग को रोजगार के द्वारा अपने प्राकृतिक हाइड्रेटेड राज्य के भीतर का अध्ययन करने के लिए एक समाधान प्रस्तुत करता है कि एक polydimethylsiloxane (PMDS) के बने microchannel में अपनी पतली सिलिकॉन नाइट्राइड (पाप) झिल्ली के नीचे तरल होता है, इस प्रकार माध्यमिक आयन जांच बीम तक सीधी पहुंच प्रदान करते हुए अभी भी एक निर्वात के भीतर तरल मैट्रिक्स के संरचनात्मक अखंडता को बनाए रखने चैंबर. 7 , 8
एस oneidensis श्री-1 के लिए हरी प्रतिदीप्ति प्रोटीन एक्सप्रेस रूपांतरित (GFP) इस फिल्म प्रक्रिया के लिए एक मॉडल जीव के रूप में चुना गया था अपनी चयापचय बहुमुखी प्रतिभा और पर्यावरण और एप्लाइड माइक्रोबायोलॉजी, जो आधारित था में आम उपयोग के कारण चित्रण धातु की कमी और extracellular इलेक्ट्रॉन हस्तांतरण के लिए अपनी अनूठी क्षमता पर भारी । 9 , 10 , 11 इसके अतिरिक्त, प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी के माध्यम से आसान सतत फिल्म-मोटाई निगरानी के लिए अनुमति दी GFP की उपस्थिति, एक fluorescein isothiocyanate (FITC) फिल्टर का उपयोग कर. हमारे पिछले अध्ययनों से इस पाप का सबूत है operando प्रतिदीप्ति इमेजिंग में १०० micrometers तक की मोटाई के लिए फिल्म विकास के लिए छवि का उपयोग करने के लिए इस बैक्टीरिया के पक्ष में । 4 , 12 जबकि इस पत्र में केवल प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी के माध्यम से फिल्म की उपस्थिति की पुष्टि के बारे में चर्चा करेंगे, सालवी सुपर संकल्प प्रतिदीप्ति इमेजिंग (यानी, संरचित रोशनी के रूप में अन्य ऑप्टिकल इमेजिंग तरीकों के साथ संगत है माइक्रोस्कोपी (सिम)9) और फोकल लेजर स्कैनिंग माइक्रोस्कोपी (CLSM) इमेजिंग4) । ऑप्टिकल इमेजिंग के लिए फिल्म की मोटाई मापने की सेवा कर सकते हैं, और की एक 3d छवि प्राप्त, के रूप में यह प्रकट होता है, इसकी मोटाई और पाप खिड़की के लिए अपने लगाव की पुष्टि के रूप में इस फिल्म के आकार । 9 जबकि GFP SIMS विश्लेषण में इस्तेमाल किया गया था, GFP के बिना एस oneidensis विकास वक्र के लिए इस्तेमाल किया गया था, ऑप्टिकल घनत्व के इस ही आवश्यक माप के रूप में और किसी भी फ्लोरोसेंट इमेजिंग की आवश्यकता नहीं थी । आम तौर पर, GFP टैग और विकास वक्र में untagged प्रजातियों के बीच का अंतर नगण्य है । साथ ही, जब इस प्रोटोकॉल का उपयोग करता है S. oneidensis MR-1 GFP प्रक्रिया का वर्णन करने के लिए एक मॉडल जीव के रूप में, इस कार्यविधि को किसी भी जीवाणु तनाव कि सालवी के भीतर खेती के लिए आवश्यक हो सकता है के लिए डिज़ाइन किया गया हालांकि, बैक्टीरियल तनाव की जरूरत का ज्ञान दिया, जैसे समय, तापमान, और ऑक्सीजन पर्यावरण के रूप में कुछ वृद्धि की स्थिति के लिए बैक्टीरिया का तनाव को समायोजित संशोधित करने की आवश्यकता हो सकती है इस्तेमाल किया जाएगा । विकास माध्यम के लिए, इस प्रक्रिया का उपयोग करता है “nanowires” मध्यम, tryptic सोया शोरबा (TSB) के बिना डेक्सट्रोज, और tryptic के लिए डेक्सट्रोज सोया आगर (TSA) संवर्धन । “nanowires” माध्यम की संरचना विशेष रूप से विकास के लिए तैयार की गई है और झिल्ली और periplasm के विस्तार की निगरानी के लिए है कि छोटे तारों के आकार लेने के लिए दिखाई देते हैं, और मध्यम संरचना किया गया है पिछले अनुसंधान के भीतर स्थापित । 13 , 14
हमारे पिछले प्रोटोकॉल पर सीटू तरल तोफ-सिम्स में लाभ सचित्र है कि सालवी को प्रोटीन स्थिरीकरण और पाप के लिए लगाव के लिए प्रस्ताव है, साथ ही साथ तोफ-SIMS विश्लेषण और डेटा में कमी पर एक विस्तृत प्रोटोकॉल । 12 के बजाय डेटा में कमी कदम दोहराना, इस कागज के बजाय स्थापित करने और हमारे सालवी microchannel भीतर फिल्म की खेती के अनूठे दृष्टिकोण पर ध्यान केंद्रित की सेवा करेंगे, साथ ही इमेजिंग कदम से पहले के रूप में फिल्म की उपस्थिति और मोटाई का पता लगाने के लिए ते तोफ-सिम्स विश्लेषण. जबकि जैव फिल्म पहले केवल निर्वात-आधारित सतह विश्लेषणात्मक तकनीक के चैंबर के भीतर नमूनों सूखे के लिए सीमित किया गया है, विस्तृत EPS और लाइव फिल्म के जैव फिल्म रासायनिक मानचित्रण अब इस नई क्षमता की वजह से सीटू में प्राप्त किया जा सकता है ।
Protocol
1. सामग्री की तैयारी मध्यम टयूबिंग सीरम की बोतलों की तैयारी (एक प्रति फिल्म संस्कृति की जरूरत है और तीन विकास वक्र प्रति आवश्यक) नोट: के रूप में परिचय में उल्लेख किया है, किसी भी वृद्धि…
Representative Results
Discussion
लॉग-चरण में inoculating के बाद, यह महत्वपूर्ण है कि दिन और तापमान की संख्या का परीक्षण करने से पहले यह स्वस्थ है और इमेजिंग के लिए काफी मोटी है, जैसा कि चरण ३.१ में वर्णित है विकसित करना चाहिए । इस प्रक्रिया को विश…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम समर्थन के लिए प्रशांत नॉर्थवेस्ट राष्ट्रीय प्रयोगशाला (PNNL) पृथ्वी और जैविक विज्ञान (EBD) मिशन बीज प्रयोगशाला निर्देशित अनुसंधान और विकास (LDRD) कोष के लिए आभारी हैं । वाद्य का उपयोग एक डब्ल्यू आर विले पर्यावरण आणविक विज्ञान प्रयोगशाला (EMSL) जनरल प्रयोक्ता प्रस्ताव के माध्यम से प्रदान की गई थी । EMSL PNNL में जैविक और पर्यावरणीय अनुसंधान (मांक) के कार्यालय द्वारा प्रायोजित एक राष्ट्रीय वैज्ञानिक उपयोगकर्ता सुविधा है । लेखक पांडुलिपि पढ़ने सबूत और उपयोगी प्रतिक्रिया प्रदान करने के लिए Dr. Yuanzhao डिंग धंयवाद । PNNL कांट्रेक्ट डे के तहत डीईओ के लिए बैटल द्वारा AC05-76RL01830 का संचालन किया जाता है ।
Materials
| ToF-SIMS | IONTOF | TOF.SIMS 5 | Resolution:>10,000 m/Δm for mass resolution;>4,000 m/Δm for high spatial resolution |
| System for Analysis at the Liquid Vacuum Interface (SALVI) | Pacific Northwest National Laboratory | N/A | SALVI is a unique, self-contained, portable analytical tool that, for the first time, enables vacuum based scientific instruments such as time-of-flight secondary ion mass spectrometry (ToF-SIMS) to analyze liquid surfaces in their natural state at the molecular level. |
| -80°C Freezer | New Brunswick Scientific | N/A | U410 Premium Energy Efficient Ultra-Low Temperature Freezer |
| 4°C Refrigerator | BioCold Scientific | N/A | COLDBOX1 |
| Orbital Shaker | New Brunswick Scientific | N/A | Innova 4900 Multi-Tier Environmental Shaker, set at 30 degrees Celsius for serum bottle and flask culturing, set at 150rpm. |
| Syringe Pump | Cole-Parmer | EW-74905-02 | Cole-Parmer Syringe Pump, Infusion Only, Touchscreen Control 74905-02, used for injecting liquid into the tubing system and SALVI at a constant flowrate. |
| Incubator | Barnstead International | LT1465X3 | Lab-Line incubator, set at 30 degrees Celsius for plate culturing. |
| Autoclave | Getinge | 533LS | Used to sterilize PEEK fittings, tubing systems, serum vials, and medium. Model 533LS Vacuum Steam Sterilizer |
| Spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | 4001-000 | GENESYS 20 spectrophotometer for OD600 readings of cuvettes for growth curves. |
| Biological Safety Cabinet | Thermo Fisher Scientific | 1385 | 1300 Series AZ Biological Safety Cabinet |
| Fluorescence Microscope | Nikon | N/A | Nikon OPTIPHOT-2 fluorescence microscope with camera and super high pressure mercury lamp power supply. |
| pH Meter | Mettler Toledo | 51302803 | Used to test the pH of the “nanowires” medium after finished and before autoclaving. |
| PEEK Union | Valco | ZU1TPK | For connecting the inlet and outlet of SALVI, the syringe to the tubing system, and the inlet of the SALVI to the drip chamber of the tubing system. |
| 5 Axes Sample Stage | IONTOF | N/A | Stage is self-made for mounting SALVI in ToF-SIMS. |
| Barnstead Nanopure Water Purification System | Thermo Fisher Scientific | D11921 | ROpure LP Reverse Osmosis filtration module (D2716) |
| Pipette | Thermo Fisher Scientific | 21-377-821 | Range: 100 to 1,000 µL. |
| Pipette Tip | Neptune | 2112.96.BS | 1,000 µL pipette tips |
| Razor Blade Handle | Stanley | N/A | Stanley Bostitch Razor Blade Scraper with 5 Single-Edge Blades, used for cutting PTFE tubing |
| Syringe | BD | 309659 | 1 mL |
| Syringe | BD | 309657 | 3 mL |
| Syringe | BD | 309646 | 5 mL; Used for making the drip chamber |
| Syringe | BD | 309604 | 10 mL |
| Syringe | BD | 302830 | 20 mL |
| Disposable Pipette | Thermo Fisher Scientific | 13-678-11 | 25 mL Fisherbrand™ Sterile Polystyrene Disposable Serological Pipets with Magnifier Stripe, for filling serum bottles. |
| Electric Pipette Filler | Pipet-aid | P-57260 | Vacuum pressure electric serological pipette filler |
| Serum Bottle | Sigma | 33109-U | Holds approximately 69 mL of liquid for culture growth, optimum for use of 20mL culture per bottle. |
| Anaerobic Culture Tube | VWR | 89167-178 | Anaerobic Tubes, 18 x 150 mm, Supplied with 20 mm Blue Butyl Rubber Stopper and Aluminum Seal. |
| Rubber Stopper | Sigma | 27235-U | Silicone stopper, used for sealing serum bottles and for creating the tubing system/drip chamber. |
| Aluminum Crimp Seal (without septum) | Sigma | 27227-U | Aluminum seal for top of serum bottle for use with serum bottle crimper. |
| Serum Bottle Aluminum Seal Crimper | Wheaton | 224307 | 30 mm crimper with standard seal. |
| PTFE Tubing | Supelco | 58697-U | 1.58 mm OD x 0.5 mm ID 50 ft. PTFE Teflon tubing, used for creating the tubing system. |
| Disposable Cuvettes | GMBH | 759085D | 1.5 Ml for use with spectrophotometer. |
| Needle | BD | 303015 | 22G; used for serum bottle injection. |
| Needle | BD | 305120 | 23G; used for punching-through rubber stopper to create drip tubing system. |
| Shewanella oneidensis MR-1 with GFP | N/A | N/A | Matthysse AG, Stretton S, Dandie C, McClure NC, & Goodman AE (1996) Construction of GFP vectors for use in Gram-negative bacteria other than Escherichia coli. FEMS Microbiol Lett 145(1):87-94. |
| Ethanol | Thermo Fisher Scientific | S25310A | 95% Denatured |
| TSA | BD | 212305 | Tryptic soy agar for culturing the model organism (S. oneidensis) used in this protocol |
| PIPES Buffer | Sigma | P-1851 | Used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007} |
| Sodium Hydroxide | Sigma | S-5881 | Used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007} |
| Ammonium Chloride | Sigma | A-5666 | Used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007} |
| Potassium Chloride | Sigma | P-4504 | Used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007} |
| Sodium Phosphate Monobasic | Sigma | S-9638 | Used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007} |
| Sodium Chloride | Thermo Fisher Scientific | S271-3 | Used for “nanowires” medium, and used to make mineral solution used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007} |
| Sodium lactate | Sigma | L-1375 | 60%(w/w) syrup @ 98% pure, d=1.3 g/mL, 7M, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007} |
| Sodium Bicarbonate | Sigma | S-5761 | Used to make ferric NTA solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007} |
| Nitrilotriacetic Acid Trisodium Salt | Sigma | N-0253 | Used to make ferric NTA solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007} |
| Iron (III) Chloride | Sigma | 451649 | Used to make ferric NTA solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007} |
| Magnesium Sulfate | Sigma | 208094 | Used to make minerals solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007} |
| Manganese (II) Sulfate Monohydrate | Sigma | M-7634 | Used to make minerals solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007} |
| Iron(II) Sulfate Heptahydrate | Sigma | 215422 | Used to make minerals solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007} |
| Calcium Chloride Dihydrate | Sigma | 223506 | Used to make minerals solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007} |
| Cobalt(II) Chloride | Sigma | 60818 | Used to make minerals solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007} |
| Zinc Chloride | Sigma | 229997 | Used to make minerals solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007} |
| Copper(II) Sulfate Pentahydrate | Sigma | C-8027 | Used to make minerals solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007} |
| Aluminum Potassium Sulfate Dodecahydrate | Sigma | 237086 | Used to make minerals solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007} |
| Boric Acid | Sigma | B-6768 | Used to make minerals solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007} |
| Sodium Molybdate Dihydrate | Sigma | 331058 | Used to make minerals solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007} |
| Nickel(II) Chloride | Sigma | 339350 | Used to make minerals solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007} |
| Sodium Tungstate Dihydrate | Sigma | 14304 | Used to make minerals solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007} |
| D-Biotin | Sigma | 47868 | Used to make vitamin solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007} |
| Folic Acid | Sigma | F-7876 | Used to make vitamin solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007} |
| Pyridoxine Hydrochloride | Sigma | P-9755 | Used to make vitamin solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007} |
| Riboflavin (B2) | Sigma | 47861 | Used to make vitamin solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007} |
| Thiamine Hydrochloride | Sigma | T-4625 | Used to make vitamin solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007} |
| Nicotinic Acid | Sigma | N4126 | Used to make vitamin solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007} |
| D-Pantothenic Acid Hemicalcium Salt | Sigma | 21210 | Used to make vitamin solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007} |
| Vitamin B12 | Sigma | V-2876 | Used to make vitamin solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007} |
| 4-Aminobenzoic Acid | Sigma | A-9878 | Used to make vitamin solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007} |
| Thioctic Acid | Sigma | T-1395 | Used to make vitamin solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007} |
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