全睾丸针浸泡超快速冷却法超低温保存斑马鱼细胞
Summary
本研究的主要目的是适应针浸泡玻璃化 (cryopreserve) 程序, 以使整个斑马鱼睾丸。另外, 对五种不同斑马鱼菌株的重复性进行了测试。
Abstract
目前科学和生物技术的趋势导致在模型生物体中创造数以千计的新品系, 从而导致有必要采用新的方法来安全地储存遗传资源, 使之超越饲养殖民地的共同做法。本研究的主要目的是适应针浸泡玻璃化 (cryopreserve) 程序, 以使整个斑马鱼睾丸。早期生殖细胞的全睾丸冷冻保存为斑马鱼遗传资源的贮藏提供了可能, 特别是在移植后它们可以成熟为雄性和雌性配子。睾丸被切除, 固定在针刺针上, 平衡在两个低温保护介质中 (含1.5 米甲醇和1.5 米丙烯乙二醇的平衡溶液; 含有3米二甲基亚砜和3米丙二醇的玻璃化溶液)并陷入液态氮。在一系列的三种升温溶液中, 样品得到了升温。这项技术的主要优点是 (1) 在热睾丸消化后缺乏精子, 从而促进下游操作;(2) 超快速冷却, 使组织的最佳接触液氮, 从而最大限度地冷却和减少所需的冷冻保护剂浓度, 从而减少其毒性;(3) 多睾丸同步暴露于冷冻保护剂和液氮;(4) 可重复性表现为在五种不同的斑马鱼菌株中获得50% 以上的生存能力。
Introduction
科学和生物技术方面的新趋势导致创造了数以千计的新的突变体, 如小鼠、果蝇、斑马鱼和其他物种, 它们被用作生物医学和其他科学中的模范有机体1。此外, 随着新技术的开发和使用, 变异线的数量稳步增加2。这就导致了在保持繁殖殖民地的共同做法之外, 安全储存遗传资源的必要性。冷冻保存作为一种保证遗传资源在不确定时间内安全贮存的方法, 具有延长繁殖季节的优势, 绕过了对亲鱼持续维护的需要, 成本更高, 而且劳动效率2。
在过去几年中开发的精子超低温保存协议2,3,4为斑马鱼雄性遗传物质的成功储存提供了机会。然而, 由于其结构复杂, 蛋黄物质大量存在, 鱼的卵或胚胎的超低温保存还是不可能的。最近, 移植的原始生殖细胞 (PGCs) 或精原干细胞 (干细胞) 提供了一个旁路到这个障碍通过发展成功能精子和卵子移植后的5。因此, 干细胞的超低温保存为珍稀珍贵的遗传资源的保护提供了新的前沿。
尽管超低温保存提供了许多优点, 但慢速冻结过程会产生几种可能导致细胞损伤的条件2。其中包括细胞内和胞外冰的形成、脱水、cryoprotectant 毒性等。细胞内的冰会损伤癌细胞, 细胞外的冰可能会导致机械破碎, 而在慢速冷冻过程中细胞的水扩散可能导致脱水6。最近, 玻璃化作为一种防止冰形成的负面影响的技术已被应用于鱼类配子的超低温保存7,8,9。它提供了一种超快速冷却技术, 通过它, 内部和外部介质变成非晶态/玻型状态而不 crystalizing 到冰7,10。成功的玻璃化睾丸和卵巢组织已证明在鸟类和哺乳动物物种10,11,12, 从而打开它的应用在鱼的可能性, 以及。
在本研究中, 我们提出了针浸泡玻璃化的程序, 以保存整个斑马鱼睾丸。我们展示了一种可靠的方法, 以隔离斑马鱼的早期生殖细胞没有污染和冷冻过程, 产生相对较高数量的早期生殖细胞与低存在的其他细胞, 特别是精子。根据我们的知识, 这是第一项研究, 以演示一个详细的可视化协议, 以超快速冷却鱼类性腺组织和斑马鱼生殖细胞。此外, 该方法的重复性表现在五种不同的斑马鱼菌株: AB 野生型, 精灵 (罗伊-/;珍珠层-/), 豹 (leot1/t1), [tg (输精管:: eGFP)] 和肾母细胞肿瘤 [tg (wt1b::eGFP1)] 转基因线。
Protocol
Representative Results
Discussion
本研究的主要目的是适应为禽类和哺乳动物物种开发的针浸入式超快速冷却程序10,11,12冷冻鱼睾丸 (斑马鱼作为模型有机体)。以往关于斑马鱼遗传资源超低温保存的研究主要集中在斑马鱼精子的超低温保存上2,3,4。然而, 成熟卵母细胞和胚胎的冷冻保存协议?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
这项研究得到了匈牙利国家研究、发展和创新办公室 (赠款116912至ÁH)、成本办公室 (粮食和农业成本行动 FA1205: AQUAGAMETE)、Stipendium Hungaricum 奖学金方案 (赠款给各部) 和新匈牙利国家优秀 Predoctoral 奖学金 (授予克朗)。
Materials
| Leibovitz media (L-15) | Sigma-Aldrich | L1518 | Supplemented with L-glutamine |
| Fetal bovine serum (FBS) | Sigma-Aldrich | F9665 | |
| Tricaine methanesulfonate (MS-222) | Sigma-Aldrich | E10521 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| Sucrose | Acros Organics | 57-50-1 | |
| Trehalose | Acros Organics | 99-20-7 | Dihydrate |
| Methanol | Reanal | 20740-0-08-65 | |
| Propylene glycol | Reanal | 08860-1-08-65 | |
| Dimethyl sulfoxide | Reanal | 00190-1-01-65 | |
| Collagenase | Gibco | 9001-12-1 | |
| Trypsin | Sigma-Aldrich | T8003 | |
| DNase I | Panreac AppliChem | A3778 | |
| Trypan blue | Sigma-Aldrich | T6146 | |
| Phospate buffered saline (PBS) | Sigma-Aldrich | P4417 | Tablets for preparation of 200 ml PBS solution |
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