Cryopreservatie van zebravis testis van hele Testes Needle ondergedompeld Ultra snelle koeling
Summary
Het belangrijkste doel van deze studie was aan te passen de naald ondergedompeld verglazing (NIV) procedure om te cryopreserve hele zebrafish teelballen. Daarnaast is de herhaalbaarheid van de methode in vijf verschillende zebrafish stammen was getest.
Abstract
Huidige trends in science en biotechnologie leiden tot de oprichting van duizenden nieuwe lijnen in modelorganismen, waardoor de noodzaak voor nieuwe methoden voor de veilige opslag van genetische hulpbronnen buiten de gemeenschappelijke praktijken van het houden van de kolonies kweken. Het belangrijkste doel van deze studie was aan te passen de naald ondergedompeld verglazing (NIV) procedure om te cryopreserve hele zebrafish teelballen. Cryopreservatie van beginnende geslachtscellen door hele teelballen NIV biedt mogelijkheden voor de opslag van zebravis genetische hulpbronnen, vooral omdat na de transplantatie ze in zowel mannelijke als vrouwelijke gameten rijpen kunnen. Teelballen waren weggesneden, gevestigd op een acupunctuur-naald, geëquilibreerd in twee cryoprotective media (oplossing met 1,5 M methanol en 1,5 M propyleenglycol; en verglazing oplossing met dimethylsulfoxide van 3 M en 3 M propyleenglycol) en duik in vloeibare stikstof. Monsters werden opgewarmd in een reeks van drie oplossingen voor daaruit voortvloeiende opwarming van de aarde. De belangrijkste voordelen van deze techniek zijn (1) het ontbreken van spermatozoïden na vertering van verwarmde teelballen waardoor downstream manipulaties; (2) Ultra snelle koeling waardoor de optimale Gasbedwelming met behulp van weefsels vloeibare stikstof, dus het maximaliseren van de koeling en het verminderen van de vereiste concentratie van cryoprotectant, waardoor hun toxiciteit; (3) synchrone Gasbedwelming met behulp van verschillende teelballen cryoprotectant en vloeibare stikstof; en (4) herhaalbaarheid aangetoond door het verkrijgen van de levensvatbaarheid van boven de 50% in vijf verschillende zebrafish stammen.
Introduction
Nieuwe trends in science en biotechnologie hebben geleid tot de oprichting van duizenden nieuwe mutant lijnen van muizen, Drosophila, zebravis en andere soorten gebruikt als modelorganismen transferoefeningen biomedische en andere wetenschappen1. Bovendien, als nieuwe technologieën worden ontwikkeld en beschikbaar, de nummers van mutant lijnen verhogen gestaag2. Dit leidt tot de noodzaak voor een veilige opslag van genetische hulpbronnen buiten de gemeenschappelijke praktijken van het houden van de kolonies kweken. Als een methode waarmee de veilige opslag van genetische hulpbronnen voor onbepaalde tijd, cryopreservatie biedt vele voordelen, zoals uitbreiding van reproductieve seizoen, omzeilt de behoefte aan continu onderhoud van broodstock, en het is meer kosten – en arbeid-efficiënte2.
Protocollen voor sperma cryopreservatie ontwikkeld tijdens de afgelopen verscheidene jaren2,3,4 bieden de mogelijkheid voor succesvolle opslag van zebravis mannelijke genetisch materiaal. Cryopreservatie van eieren of embryo’s in vis is echter nog niet mogelijk als gevolg van hun complexe structuur en grote hoeveelheden dooier materiaal. Onlangs, de praktijk van transplantatie van primordiaal geslachtscellen (PGCs) of spermatogonial stamcellen (levens) biedt een rondweg om deze barrière door ontwikkelt zich tot functionele sperma en eieren na transplantatie5. Cryopreservatie van levens biedt daarom een nieuwe grens in het behoud van zeldzame en waardevolle genetische hulpbronnen.
Hoewel cryopreservatie vele voordelen biedt, het vriesproces van slow-tarief genereert verschillende omstandigheden die tot cel schade2 leiden kunnen. Het gaat hierbij om intracellulaire en extracellulaire ijsvorming, uitdroging, cryoprotectant toxiciteit en anderen. Intracellulair ijs schadelijk is voor de cellen, extracellulaire ijs kan leiden tot mechanische persing van de cellen, terwijl de diffusie van water uit de cellen tijdens vertragen-tarief bevriezing kan leiden tot uitdroging6. Onlangs, heeft de cryopreservatie van vis gameten7,8,9verglazing als een techniek waardoor de negatieve effecten van ijsvorming zijn toegepast. Het presenteert een ultra snelle koeling techniek waardoor de interne en externe media omzetten in een amorfe/glazig staat zonder crystalizing in ijs7,10. Succesvolle verglazing van testiculaire en ovarieel weefsel heeft aangetoond in aviaire en zoogdieren soorten10,11,12, dus het openen van mogelijkheden voor de toepassing in de vis, alsmede.
In deze studie presenteren wij de naald ondergedompeld verglazing (NIV) procedure voor cryopreservatie van hele zebrafish teelballen. We tonen een betrouwbare methode voor de isolatie van de zebravis beginnende kiemcellen zonder besmetting en een cryopreservatie proces dat relatief hoge bedragen van beginnende kiemcellen met een geringe aanwezigheid van andere cellen, met name van spermacellen levert. Tot de beste van onze kennis is dit de eerste studie om aan te tonen een gedetailleerde gevisualiseerde protocol voor ultra snelle koeling van vis gonadale weefsel en zebrafish germline cellen. Bovendien, herhaalbaarheid van de methode is aangetoond in vijf verschillende zebrafish stammen: AB wild type, casper (roy– / –; nacre– / –), leopard (leot1/t1), vasa [GS (vas::eGFP)] en Wilms tumor [GS (wt1b::eGFP 1)] transgene lijn.
Protocol
Representative Results
Discussion
Het voornaamste doel van deze studie was ondergedompeld Ultra snelle koeling procedure ontwikkeld voor aviaire en zoogdieren soorten10,11,12 te cryopreservatie van vis testis (zebravis als model aan te passen van de naald organisme). Allermeest naar de eerdere studies ten aanzien van cryopreservatie van genetische hulpbronnen van de zebravis waren voornamelijk gericht op cryopreservatie van zebravis sperma2</su…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Deze studie werd ondersteund door de National Research, ontwikkeling en innovatie Office van Hongarije (grant 116912 naar ÁH), het Bureau van de kosten (voedsel en landbouw kosten actie FA1205: AQUAGAMETE), de door Hungaricum Scholarship Programme (subsidie voor ZM) en de nieuwe Hongaarse nationale Excellence predoctoraal Fellowship (grant tegen EK).
Materials
| Leibovitz media (L-15) | Sigma-Aldrich | L1518 | Supplemented with L-glutamine |
| Fetal bovine serum (FBS) | Sigma-Aldrich | F9665 | |
| Tricaine methanesulfonate (MS-222) | Sigma-Aldrich | E10521 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| Sucrose | Acros Organics | 57-50-1 | |
| Trehalose | Acros Organics | 99-20-7 | Dihydrate |
| Methanol | Reanal | 20740-0-08-65 | |
| Propylene glycol | Reanal | 08860-1-08-65 | |
| Dimethyl sulfoxide | Reanal | 00190-1-01-65 | |
| Collagenase | Gibco | 9001-12-1 | |
| Trypsin | Sigma-Aldrich | T8003 | |
| DNase I | Panreac AppliChem | A3778 | |
| Trypan blue | Sigma-Aldrich | T6146 | |
| Phospate buffered saline (PBS) | Sigma-Aldrich | P4417 | Tablets for preparation of 200 ml PBS solution |
References
- Mazur, P., Leibo, S. P., Seidel, G. R. J. Cryopreservation of the germplasm of animals used in biological and medical research: Importance, impact, status, and future directions. Biol. Reprod. 78 (1), 2-12 (2008).
- Carmichael, C., Westerfield, M., Varga, Z. M. Cryopreservation and In Vitro Fertilization at the Zebrafish International Resource Center. Methods Mol. Biol. 546, 45-65 (2009).
- Yang, H., Carmichael, C., Varga, Z. M., Tiersch, T. R. Development of a simplified and standardized protocol with potential for high-throughput for sperm cryopreservation in zebrafish Danio rerio. Theriogenology. 68 (2), 128-136 (2007).
- Morris, J. P., Berghmans, S., Zahrieh, D., Neuberg, D. S., Kanki, J. P., Look, A. T. Zebrafish sperm cryopreservation with N,N-dimethylacetamide. Biotechniques. 35 (5), 956-968 (2003).
- Yoshizaki, G., et al. Spermatogonial transplantation in fish: A novel method for the preservation of genetic resources. Comp. Biochem. Physiol. Part D: Genomics Proteomics. 6 (1), 55-61 (2011).
- Gao, D., Critser, J. K. Mechanisms of cryoinjury in living cells. ILAR J. 41 (4), 187-196 (2000).
- Asturiano, J. F., Cabrita, E., Horváth, &. #. 1. 9. 3. ;. Progress, challenges and perspectives on fish gamete cryopreservation: A mini-review. Gen. Comp. Endocrinol. 245, 69-76 (2017).
- Kása, E., et al. Development of sperm vitrification protocols for freshwater fish (Eurasian perch, Perca fluviatilis) and marine fish (European eel, Anguilla anguilla). Gen. Comp. Endocrinol. 245, 102-107 (2017).
- Cuevas-Uribe, R., Leibo, S. P., Daly, J., Tiersch, T. R. Production of channel catfish with sperm cryopreserved by rapid non-equilibrium cooling. Cryobiology. 63 (3), 186-197 (2011).
- Wang, Y., Xiao, Z., Li, L., Fan, W., Li, S. W. Novel needle immersed vitrification: A practical and convenient method with potential advantages in mouse and human ovarian tissue cryopreservation. Hum. Reprod. 23 (10), 2256-2265 (2008).
- Liu, J., Cheng, K. M., Silversides, F. G. Production of Live Offspring from Testicular Tissue Cryopreserved by Vitrification Procedures in Japanese Quail (Coturnix japonica). Biol. Reprod. 88 (5), 124 (2013).
- Liu, J., Cheng, K. M., Silversides, F. G. Novel needle-in-straw vitrification can effectively preserve the follicle morphology, viability, and vascularization of ovarian tissue in Japanese quail (Coturnix japonica). Anim. Reprod. Sci. 134 (3-4), 197-202 (2012).
- Lee, S., Yoshizaki, G. Successful cryopreservation of spermatogonia in critically endangered Manchurian trout (Brachymystax lenok). Cryobiology. 72 (2), 165-168 (2016).
- Marques, L. S., et al. Viability of zebrafish (Danio rerio) ovarian follicles after vitrification in a metal container. Cryobiology. 71 (3), 367-373 (2015).
- Lujić, J., et al. First successful vitrification of salmonid ovarian tissue. Cryobiology. 76, 154-157 (2017).
- Bono-Mestre, C., Cardona-Costa, J., García-Ximénez, F. Effects on cell viability of three zebrafish testicular cell or tissue cryopreservation methods. CryoLetters. 30 (2), 148-152 (2009).
- Marinović, Z., et al. Cryosurvival of isolated testicular cells and testicular tissue of tench Tinca tinca and goldfish Carassius auratus following slow-rate freezing. Gen. Comp. Endocrinol. 245, 77-83 (2017).
- Pšenička, M., Saito, T., Rodina, M., Dzyuba, B. Cryopreservation of early stage Siberian sturgeon Acipenser baerii germ cells, comparison of whole tissue and dissociated cells. Cryobiology. 72, 119-122 (2016).
- Lee, S., Iwasaki, Y., Shikina, S., Yoshizaki, G. Generation of functional eggs and sperm from cryopreserved whole testes. Proc. Nati. Acad. Sci. USA. 110 (5), 1640-1645 (2013).
