Zebrafish Spermatogonia 전체 Testes 바늘의 cryopreservation 몰입 울트라-빠른 냉각

Summary

이 연구의 주요 목적은 바늘에 맞게 vitrification (NIV) 절차 전체 zebrafish testes cryopreserve에 몰입 했다. 또한, 5 개의 다른 zebrafish 긴장에서 방법의 반복성 시험 되었다.

Abstract

생명 공학 및 과학의 현재 동향 breeding 식민지 유지의 일반적인 관행을 넘어 유전 자원의 안전한 저장을 위한 새로운 방법에 대 한 필요성에 따라서 선도 모델 생물에서 새로운 라인의 수천의 창조 될. 이 연구의 주요 목적은 바늘에 맞게 vitrification (NIV) 절차 전체 zebrafish testes cryopreserve에 몰입 했다. 전체 testes에 의해 초기 단계 세균 세포의 cryopreservation 이니라 제공 합니다 zebrafish의 스토리지에 대 한 가능성 유전 자원, 특히 이후 이식 후 그들은 둘 다 남성과 여성 gametes로 성숙 수 있습니다. 침술 바늘, 두 cryoprotective 미디어 (평형 솔루션 1.5 M 메탄올 및 1.5 M 프로필 렌 글리콜; 및 vitrification 솔루션 3 M 디 메 틸 sulfoxide 및 3 M 프로필 렌 글리콜을 포함)에 equilibrated에 testes excised 했다 그리고 액체 질소에 뛰어들었다. 샘플 3 결과 지구 온난화 솔루션의 시리즈에는 예 열 했다. 이 기술의 주요 장점은 다운스트림 조작; 촉진 따뜻하게 testes의 소화 후 (1) 정 충의 부족은 (2) 매우 빠른 따라서 냉각 및 cryoprotectants; 그들의 독성을 줄일 필요 농도 감소를 극대화 하는 액체 질소에 조직의 최적의 노출 사용 냉각 (3) 동기 여러 testes의, 노출에 cryoprotectants 액체 질소; 그리고 (4) 반복성의 5 개의 다른 zebrafish 긴장에서 50% 이상의 생존 여 시연.

Introduction

생명 공학 및 과학 소설 동향은 쥐, 초파리, zebrafish의 모형 유기 체 생물 의학에 및 다른 과학¹로 사용 하는 다른 종의 새로운 돌연변이 라인의 수천의 창조에 이르렀다. 또한, 새로운 기술을 개발 하 고 사용할 수 있게 되는, 돌연변이 라인의 숫자는 꾸준히²증가. 식민지를 번 식 유지의 일반적인 관행을 넘어 유전 자원의 안전한 저장에 대 한 필요성을이 끈다. 시간이 무기한 기간에 대 한 유전 자원의 안전한 저장을 수 있는 방법으로 cryopreservation 장점이 많은 생식 시즌의 확장 circumvents broodstock, 지속적인 유지 관리를 위해 필요 하 고 그것은 더 많은 비용-와 같은 고 효율적인 노동².

정자 cryopreservation는 지난 몇 년 동안^2,3,4 중 개발에 대 한 프로토콜 zebrafish 남성 유전 물질의 성공적인 저장소에 대 한 기회를 제공 합니다. 그러나, 계란이 나 생선에는 태아의 cryopreservation 불가능 아직 그들의 복잡 한 구조와 노 른 자 물자의 다량. 최근, 원시 생식 세포 (PGCs) 또는 spermatogonial 줄기 세포 (SSCs) 이식의 연습 이식⁵후 정자와 난 기능으로 개발 하 여이 방 벽을 우회를 제공 합니다. 따라서, SSCs의 cryopreservation 희귀 하 고 귀중 한 유전자 자원의 보존에 새로운 프론티어를 제공합니다.

Cryopreservation 많은 장점을 제공, 비록 느린 속도 동결 과정 세포 손상²로 이어질 수 있는 몇 가지 조건을 생성 합니다. 이러한 세포와 extracellular 얼음 대형, 탈수, cryoprotectant 독성 등이 포함 됩니다. 세포내 얼음 손상 세포, extracellular 얼음 셀의 기계적 분쇄 동안 느린 속도 동결 세포에서 물 보급 탈수⁶으로 이어질 수 있습니다 하는 동안 발생할 수 있습니다. 최근, 얼음 대형의 부정적인 효과 방지 하는 기술로 vitrification 물고기 gametes^7,,89의 cryopreservation에 적용 되었습니다. 통해 내부 및 외부 미디어 얼음^7,10에 crystalizing 없이 비정 질/유리 상태로 설정 하는 매우 빠른 냉각 기법을 제공 합니다. 고환 및 난소 조직의 성공적인 vitrification 조류 및 포유류 종^10,,1112, 따라서 물고기, 뿐만에서 자사의 응용 프로그램에 대 한 가능성을 열어 입증 되었습니다.

이 연구에서 우리 전체 zebrafish testes의 cryopreservation 바늘 몰입 vitrification (NIV) 절차를 제시. 오염 및 다른 세포, 특히 정 충의 낮은 존재와 상대적으로 높은 양의 초기 생식 세포 생성 cryopreservation 과정 없이 zebrafish 초기 세균 세포 절연에 대 한 신뢰할 수 있는 방법을 설명 합니다. 우리의 지식 최선을이 물고기 gonadal 조직과 zebrafish 생식 세포의 초 급속 한 냉각에 대 한 상세한 시각화 된 프로토콜을 설명 하는 첫 번째 연구 이다. 또한, 방법의 반복성 5 다른 zebrafish 긴장에서 설명 된다: AB 야생 타입, 캐스퍼 (로^-/-; nacre^-/-), 레오 파 드 (레오^t1/t1), 바사 [Tg (vas::eGFP)]와 Wilms 종양 [Tg (wt1b::eGFP 1)] 유전자 변형 라인.

Protocol

여기에 설명 된 모든 메서드는 헝가리 동물 복지 법률에 의해 승인 되었습니다. 1. 시 약 준비 재고 솔루션 그것은 완전히 해소 될 때까지 잘 dH2오 믹스의 1 mL에 트 레 할 로스가 수화물의 0.378 g를 추가 하 여 1 M 트 레 할 로스를 준비 합니다. 그것은 완전히 해소 될 때까지 잘 dH2오 믹스의 1 mL에 자당의 0.342 g를 추가 하 여 1 M 자당을 준비 합?…

Representative Results

평균적으로, 초기 단계 세균 세포는 하나의 신선한 zebrafish 고환에서 격리 수 물고기의 크기에 따라 40, 000와 200000 셀 사이의 다양 합니다. 모든 5 종자에 신선한 zebrafish testes 소화 때 초기 생식 세포만 셀 셀 정지 (그림 2)에 아니었다. 초기 단계 세균 세포 옆에 수많은 정 충도 발견 됐다. 다른 한편으로, cryopreserved testes의 소화 후 훨씬 적은 정 충 했다. …

Discussion

이 연구의 주요 목적은 바늘에 맞게 몰입 울트라-빠른 냉각 절차 조류 및 포유류 종^10,11,12 물고기 고환 (zebrafish 모델의 cryopreservation를 개발 했다 유기 체)입니다. Zebrafish 유전 자원의 cryopreservation에 관한 이전 연구의 대부분 zebrafish 정자^2,,34의 cryopreservation에…

Materials

Leibovitz media (L-15)	Sigma-Aldrich	L1518	Supplemented with L-glutamine
Fetal bovine serum (FBS)	Sigma-Aldrich	F9665
Tricaine methanesulfonate (MS-222)	Sigma-Aldrich	E10521
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375
Sucrose	Acros Organics	57-50-1
Trehalose	Acros Organics	99-20-7	Dihydrate
Methanol	Reanal	20740-0-08-65
Propylene glycol	Reanal	08860-1-08-65
Dimethyl sulfoxide	Reanal	00190-1-01-65
Collagenase	Gibco	9001-12-1
Trypsin	Sigma-Aldrich	T8003
DNase I	Panreac AppliChem	A3778
Trypan blue	Sigma-Aldrich	T6146
Phospate buffered saline (PBS)	Sigma-Aldrich	P4417	Tablets for preparation of 200 ml PBS solution