Cryoconservation des spermatogonies de poisson-zèbre de toute aiguille testicules immergé refroidissement ultra rapide
Summary
L’objectif principal de cette étude était d’adapter l’aiguille plongé procédure vitrification (NIV) pour cryoconservé testicules tout poisson-zèbre. En outre, la répétabilité de la méthode dans cinq souches différentes de poisson-zèbre a été testée.
Abstract
Tendances actuelles de la science et de la biotechnologie menant à la création de milliers de nouvelles lignes dans les organismes modèles, ce qui conduirait à la nécessité de nouvelles méthodes pour le stockage sûr des ressources génétiques au-delà des pratiques courantes de garder les colonies reproductrices. L’objectif principal de cette étude était d’adapter l’aiguille plongé procédure vitrification (NIV) pour cryoconservé testicules tout poisson-zèbre. Cryoconservation des cellules germinales précoce par les testicules tout NIV offre des possibilités pour le stockage du poisson-zèbre des ressources génétiques, autant après la transplantation, ils peuvent mûrir en gamètes mâles et femelles. Testicules ont été excisées, a effectué le tombé sur une aiguille d’acupuncture, équilibrée dans deux milieux cryoprotecteurs (équilibration solution contenant du méthanol de 1,5 M et 1,5 M propylène glycol ; et solution de vitrification contenant 3 M le diméthylsulfoxyde et 3M propylène glycol) et plongés dans l’azote liquide. Des échantillons ont été réchauffés dans une série de trois solutions de réchauffement de la planète qui en découle. Les principaux avantages de cette technique sont : (1) l’absence de spermatozoïdes après digestion des testicules réchauffés, ce qui facilite les manipulations en aval ; (2) ultra rapide refroidissement permettant l’exposition optimale des tissus à l’azote liquide donc maximiser le refroidissement et la réduction de la concentration requise des cryoprotecteurs, réduisant ainsi leur toxicité ; (3) synchrone exposition des testicules plusieurs cryoprotecteurs et azote liquide ; et répétabilité (4) a démontré en obtenant la viabilité de plus de 50 % dans cinq souches différentes de poisson-zèbre.
Introduction
Nouvelles tendances en sciences et en biotechnologie ont conduit à la création de milliers de nouvelles lignées mutantes de souris, drosophile, poisson-zèbre et autres espèces utilisées comme organismes modèles dans la recherche biomédicale et d’autres sciences1. En outre, comme les nouvelles technologies sont développées et deviennent disponibles, le nombre de lignées mutantes augmente régulièrement2. Cela conduit à la nécessité d’un stockage sûr des ressources génétiques au-delà des pratiques courantes de garder les colonies reproductrices. Comme une méthode qui permet le stockage en toute sécurité des ressources génétiques pour une période de temps indéterminée, cryoconservation offre de nombreux avantages tels que l’extension de la saison de reproduction, contourne la nécessité d’entretien continu des géniteurs, et c’est plus coût – et efficace du travail2.
Protocoles pour la cryoconservation de sperme développée au cours du passé plusieurs années2,3,4 offrent l’occasion pour stockage réussie du poisson-zèbre mâle matériel génétique. Cependant, cryoconservation de œufs ou embryons chez les poissons n’est pas encore possible en raison de leur structure complexe et de grandes quantités de matériel de jaune d’oeuf. Récemment, la pratique de la transplantation de cellules germinales primordiales (PGC) ou de cellules souches spermatogoniales (SSC) offre une voie de contournement à cet obstacle en développant dans sperme fonctionnel et les œufs après transplantation5. Cryoconservation de SSC propose donc une nouvelle frontière pour la conservation des ressources génétiques rares et précieux.
Même si la cryoconservation offre de nombreux avantages, le processus de congélation lente-taux génère plusieurs conditions pouvant entraîner de dommages cellulaires2. Il s’agit de la formation de glace intracellulaires et extracellulaires, déshydratation, toxicité cryoprotecteur et d’autres. Intracellulaire glace endommage les cellules, glace extracellulaire peut conduire à un broyage mécanique des cellules, tandis que la diffusion de l’eau des cellules au cours de la congélation lente-taux peut conduire à la déshydratation,6. Récemment, vitrification comme une technique qui empêche les effets négatifs de la formation de glace a été appliquée à la cryoconservation des gamètes de poisson7,8,9. Il présente une technique de refroidissement ultra rapide, grâce auquel les médias internes et externes transformer en un état amorphe/vitreux sans cristalliser en glace7,10. Vitrification réussie du tissu testiculaire et ovarien a été mis en évidence dans les espèces aviaires et mammifères10,11,12, ouvrant ainsi des possibilités de son application chez les poissons, aussi bien.
Dans cette étude, nous présentons la procédure de vitrification (NIV) aiguille immergé pour la cryoconservation des testicules tout poisson-zèbre. Nous démontrons une méthode fiable pour l’isolement du poisson-zèbre précoce des cellules germinales sans contamination et un processus de cryoconservation qui produit des quantités relativement élevées de stade précoce des cellules germinales avec une faible présence d’autres cellules, en particulier les spermatozoïdes. Au meilleur de notre connaissance, c’est la première étude à démontrer un protocole détaillé visualisé pour refroidissement ultra rapide du tissu gonadique poisson et poisson-zèbre des cellules germinales. En outre, la répétabilité de la méthode est montrée dans cinq souches différentes de poisson-zèbre : AB type sauvage, casper (roy– / –; nacre– / –), léopard (leot1/t1), vasa [Tg (vas::eGFP)] et lignée transgénique de Wilms tumor [Tg (wt1b::eGFP 1)].
Protocol
Representative Results
Discussion
L’objectif principal de cette étude était d’adapter l’aiguille plongé procédure refroidissement ultra rapide mis au point pour les espèces aviaires et mammifères10,11,12 pour la cryoconservation des testicules de poisson (poisson zèbre comme un modèle de organisme). La plupart des études antérieures au sujet de la cryoconservation des ressources génétiques zebrafish portaient principalement sur la cryoconservat…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Cette étude a été financée par la National de la recherche-développement et Innovation Office de Hongrie (subvention 116912 à ÁH), le Bureau de coût (l’alimentation et l’Agriculture coût Action FA1205 : AQUAGAMETE), le Programme de bourses Hungaricum Stipendium (subvention à ZM) et le nouveau Hungarian National Excellence pré-doctoral Fellowship (subvention EK).
Materials
| Leibovitz media (L-15) | Sigma-Aldrich | L1518 | Supplemented with L-glutamine |
| Fetal bovine serum (FBS) | Sigma-Aldrich | F9665 | |
| Tricaine methanesulfonate (MS-222) | Sigma-Aldrich | E10521 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| Sucrose | Acros Organics | 57-50-1 | |
| Trehalose | Acros Organics | 99-20-7 | Dihydrate |
| Methanol | Reanal | 20740-0-08-65 | |
| Propylene glycol | Reanal | 08860-1-08-65 | |
| Dimethyl sulfoxide | Reanal | 00190-1-01-65 | |
| Collagenase | Gibco | 9001-12-1 | |
| Trypsin | Sigma-Aldrich | T8003 | |
| DNase I | Panreac AppliChem | A3778 | |
| Trypan blue | Sigma-Aldrich | T6146 | |
| Phospate buffered saline (PBS) | Sigma-Aldrich | P4417 | Tablets for preparation of 200 ml PBS solution |
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