Zebra balığı Spermatogonia bütün testis iğne tarafından dondurma hızlı soğutma dalmış
Summary
Bu çalışmanın temel amacı iğne adapte Vitrifiye (NIV) yordamı tüm Zebra balığı testis cryopreserve dalmış oldu. Ayrıca, beş farklı Zebra balığı suşları yönteminde tekrarlanabilirlik test edildi.
Abstract
Böylece kolonileri damızlık tutmanın ortak uygulamalar dışında genetik kaynaklarının güvenli depolama için yeni yöntemler için gerekliliğini önde gelen model organizmalar yeni satırları binlerce kurulması için bilim ve biyoteknoloji mevcut eğilimler yol. Bu çalışmanın temel amacı iğne adapte Vitrifiye (NIV) yordamı tüm Zebra balığı testis cryopreserve dalmış oldu. Özellikle nakli sonra erkek ve dişi gamet olgun beri dondurma bütün testisler tarafından aşamasındaki germ hücrelerinin NIV genetik kaynakları, Zebra balığı Muhafazası için olanaklar sunuyor. Testisler, iki cryoprotective medyada (1.5 M metanol ve 1,5 M propilen glikol; içeren denge çözüm ve Vitrifiye çözüm 3 M Dimetil sülfoksit ve 3 M propilen glikol içeren) equilibrated bir akupunktur iğnesi üzerinde pinned eksize ve sıvı azot içine daldı. Örnekleri bir dizi üç sonucu ısınma çözümleri ısındı. Bu teknik en önemli avantajları (1) sperm eksikliği aşağı akım manipülasyonlar; böylece kolaylaştırmak ısıtılan testis sindirim sonra vardır. (2) ultra hızlı sıvı nitrojen bu nedenle soğutma ve cryoprotectants, böylece onların toksisite azaltmak gerekli konsantrasyonu azaltarak en üst düzeye çıkarma en uygun maruz dokuların etkinleştirme soğutma; (3) birkaç testisler zaman uyumlu maruz kalma cryoprotectants ve sıvı azot; ve beş farklı Zebra balığı suşların % 50 üzerinde canlılık elde ederek (4) tekrarlanabilirlik gösterdi.
Introduction
Bilim ve biyoteknoloji yeni eğilimler fareler, Drosophila, Zebra balığı ve canlılar arasında Biyomedikal ve diğer Bilimler1kullanılan diğer türler yeni mutant satırları binlerce yaratılmasına yol açmıştır. Yeni teknolojiler geliştirdi ve kullanılabilir hale gelir, Ayrıca, mutant satırların numaralarını giderek2artar. Bu genetik kaynakları kolonileri damızlık tutmanın ortak uygulamalar ötesinde bir güvenli depolama için gerekliliğini yol açar. Belirsiz bir süre için genetik kaynaklarının güvenli depolama sağlayan bir yöntem olarak olarak üreme sezonu, uzantısı broodstock sürekli bakım gereksinimini kaçınmanızı sağlar ve daha fazla maliyet – dondurma birçok avantaj sunar ve emek verimli2.
Geçtiğimiz birkaç yıl2,3,4 sırasında geliştirilen sperm dondurma protokollerde Zebra balığı erkek genetik materyal başarılı Muhafazası için fırsat sunuyoruz. Ancak, yumurta veya balık embriyo dondurma henüz onların karmaşık yapısı ve sarısı malzeme büyük miktarda nedeniyle mümkün değildir. Son zamanlarda, primordial germ hücreleri (PGCs) veya spermatogonial (SSCs) kök hücre nakli pratiği fonksiyonel sperm ve yumurta nakli5sonra geliştirerek bu bariyer için yan yol sunmaktadır. Bu nedenle, dondurma SSCs, nadir ve değerli genetik kaynakların korunması yeni bir sınır sağlar.
Dondurma pek çok avantajları sunuyor olsa bile, yavaş hızı dondurma işlemi hücre hasarı2‘ ye neden olabilir birkaç koşulları oluşturur. Bu hücre içi ve hücre dışı buz oluşumu, dehidratasyon, cryoprotectant toksisite ve diğerleri içerir. Hücre içi buz hücreleri zarar, hücre dışı buz hücrelerden su Difüzyon sırasında yavaş kuru buz gibi su kaybı6için neden olabilir iken mekanik hücreleri, kırma için neden olabilir. Son zamanlarda, Vitrifiye buz oluşumu olumsuz etkilerini önleyen bir teknik olarak balık gamet7,8,9dondurma uygulanmıştır. Bir ultra hızlı soğutma tekniği ile iç ve dış ortam buz7,10crystalizing olmadan amorf/cam gibi bir duruma çevirmek sunar. Testis ve Yumurtalık dokusunun başarılı vitrifikasyon böylece uygulama için olanaklar balık de açılış kuş ve memeli türleri10,11,12‘ kanıtlandığı.
Bu çalışmada, biz iğne batırılır Vitrifiye (NIV) yordamı tüm Zebra balığı testis dondurma için mevcut. Zebra balığı aşamasındaki germ hücreleri kirlenme ve nispeten yüksek miktarda aşamasındaki germ hücreleri düşük varlığı diğer hücreleri, özellikle sperm hücreleri ile verimleri bir dondurma işlemi olmadan yalıtım için güvenilir bir yöntem gösterilmektedir. Bizim bilgi en iyi şekilde, bu ultra hızlı soğutma balık Gonad doku ve Zebra balığı germline hücreleri için detaylı bir görüntülenmeyecektir protokol göstermek için ilk çalışmadır. Ayrıca, tekrarlanabilirlik yönteminin beş farklı Zebra balığı suşları içinde gösterilmiştir: AB vahşi türü, casper (roy– / –; sedef– / –), leopard (leot1/t1), vasa [Tg (vas::eGFP)] ve Wilms tümörü [Tg (wt1b::eGFP 1)] transgenik hattı.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu çalışmanın temel amacı iğne adapte kuş ve memeli türleri10,11,12 ‘ ye balık testis (Zebra balığı bir model olarak dondurma için geliştirilen hızlı soğutma yordamı dalmış oldu organizma). Zebra balığı genetik kaynakları dondurma ile ilgili önceki çalışmaların en öncelikle Zebra balığı sperm2,3,4dondurm…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışmada ulusal araştırma, geliştirme ve yenilik Office Macaristan (grant 116912 ÁH için), maliyet office tarafından desteklenmiştir (Gıda ve tarım maliyet eylem FA1205: AQUAGAMETE), Stipendium Hungaricum burs programı (grant ZM için) ve yeni Macar Ulusal mükemmellik HGUGM Bursu (EK hibe).
Materials
| Leibovitz media (L-15) | Sigma-Aldrich | L1518 | Supplemented with L-glutamine |
| Fetal bovine serum (FBS) | Sigma-Aldrich | F9665 | |
| Tricaine methanesulfonate (MS-222) | Sigma-Aldrich | E10521 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| Sucrose | Acros Organics | 57-50-1 | |
| Trehalose | Acros Organics | 99-20-7 | Dihydrate |
| Methanol | Reanal | 20740-0-08-65 | |
| Propylene glycol | Reanal | 08860-1-08-65 | |
| Dimethyl sulfoxide | Reanal | 00190-1-01-65 | |
| Collagenase | Gibco | 9001-12-1 | |
| Trypsin | Sigma-Aldrich | T8003 | |
| DNase I | Panreac AppliChem | A3778 | |
| Trypan blue | Sigma-Aldrich | T6146 | |
| Phospate buffered saline (PBS) | Sigma-Aldrich | P4417 | Tablets for preparation of 200 ml PBS solution |
References
- Mazur, P., Leibo, S. P., Seidel, G. R. J. Cryopreservation of the germplasm of animals used in biological and medical research: Importance, impact, status, and future directions. Biol. Reprod. 78 (1), 2-12 (2008).
- Carmichael, C., Westerfield, M., Varga, Z. M. Cryopreservation and In Vitro Fertilization at the Zebrafish International Resource Center. Methods Mol. Biol. 546, 45-65 (2009).
- Yang, H., Carmichael, C., Varga, Z. M., Tiersch, T. R. Development of a simplified and standardized protocol with potential for high-throughput for sperm cryopreservation in zebrafish Danio rerio. Theriogenology. 68 (2), 128-136 (2007).
- Morris, J. P., Berghmans, S., Zahrieh, D., Neuberg, D. S., Kanki, J. P., Look, A. T. Zebrafish sperm cryopreservation with N,N-dimethylacetamide. Biotechniques. 35 (5), 956-968 (2003).
- Yoshizaki, G., et al. Spermatogonial transplantation in fish: A novel method for the preservation of genetic resources. Comp. Biochem. Physiol. Part D: Genomics Proteomics. 6 (1), 55-61 (2011).
- Gao, D., Critser, J. K. Mechanisms of cryoinjury in living cells. ILAR J. 41 (4), 187-196 (2000).
- Asturiano, J. F., Cabrita, E., Horváth, &. #. 1. 9. 3. ;. Progress, challenges and perspectives on fish gamete cryopreservation: A mini-review. Gen. Comp. Endocrinol. 245, 69-76 (2017).
- Kása, E., et al. Development of sperm vitrification protocols for freshwater fish (Eurasian perch, Perca fluviatilis) and marine fish (European eel, Anguilla anguilla). Gen. Comp. Endocrinol. 245, 102-107 (2017).
- Cuevas-Uribe, R., Leibo, S. P., Daly, J., Tiersch, T. R. Production of channel catfish with sperm cryopreserved by rapid non-equilibrium cooling. Cryobiology. 63 (3), 186-197 (2011).
- Wang, Y., Xiao, Z., Li, L., Fan, W., Li, S. W. Novel needle immersed vitrification: A practical and convenient method with potential advantages in mouse and human ovarian tissue cryopreservation. Hum. Reprod. 23 (10), 2256-2265 (2008).
- Liu, J., Cheng, K. M., Silversides, F. G. Production of Live Offspring from Testicular Tissue Cryopreserved by Vitrification Procedures in Japanese Quail (Coturnix japonica). Biol. Reprod. 88 (5), 124 (2013).
- Liu, J., Cheng, K. M., Silversides, F. G. Novel needle-in-straw vitrification can effectively preserve the follicle morphology, viability, and vascularization of ovarian tissue in Japanese quail (Coturnix japonica). Anim. Reprod. Sci. 134 (3-4), 197-202 (2012).
- Lee, S., Yoshizaki, G. Successful cryopreservation of spermatogonia in critically endangered Manchurian trout (Brachymystax lenok). Cryobiology. 72 (2), 165-168 (2016).
- Marques, L. S., et al. Viability of zebrafish (Danio rerio) ovarian follicles after vitrification in a metal container. Cryobiology. 71 (3), 367-373 (2015).
- Lujić, J., et al. First successful vitrification of salmonid ovarian tissue. Cryobiology. 76, 154-157 (2017).
- Bono-Mestre, C., Cardona-Costa, J., García-Ximénez, F. Effects on cell viability of three zebrafish testicular cell or tissue cryopreservation methods. CryoLetters. 30 (2), 148-152 (2009).
- Marinović, Z., et al. Cryosurvival of isolated testicular cells and testicular tissue of tench Tinca tinca and goldfish Carassius auratus following slow-rate freezing. Gen. Comp. Endocrinol. 245, 77-83 (2017).
- Pšenička, M., Saito, T., Rodina, M., Dzyuba, B. Cryopreservation of early stage Siberian sturgeon Acipenser baerii germ cells, comparison of whole tissue and dissociated cells. Cryobiology. 72, 119-122 (2016).
- Lee, S., Iwasaki, Y., Shikina, S., Yoshizaki, G. Generation of functional eggs and sperm from cryopreserved whole testes. Proc. Nati. Acad. Sci. USA. 110 (5), 1640-1645 (2013).
