Криоконсервация данио рерио сперматогонии всего яички иглой погружен ультра-быстрое охлаждение
Summary
Основной целью данного исследования было адаптировать иглы погруженным стеклования (NIV) процедура криоконсервации весь данио рерио яичек. Кроме того был испытан воспроизводимости метода в пяти различных данио рерио штаммов.
Abstract
Нынешние тенденции в науке и биотехнологии привести к созданию тысяч новых линий в модельных организмов, тем самым приводит к необходимости для новых методов для безопасного хранения генетических ресурсов за пределами общей практики ведения селекции колоний. Основной целью данного исследования было адаптировать иглы погруженным стеклования (NIV) процедура криоконсервации весь данио рерио яичек. Криоконсервация ранней стадии зародышевых клеток всего яички Нив предлагает возможности для хранения данио рерио генетических ресурсов, тем более, что после пересадки они могут перерастет как мужчин, так и женские гаметы. Яички были подакцизным, возлагали на акупунктурные иглы, достижение равновесного уровня в двух криозащитных сред (уравновешивания раствор, содержащий метанола 1,5 М и 1,5 М пропиленгликоля; и витрификации раствор, содержащий 3 M диметилсульфоксида и пропиленгликоля 3 M) и окунувшись в жидкий азот. Образцы были нагревают в серии трех последующее потепление решения. Основные преимущества этого метода являются (1) отсутствие сперматозоидов после переваривания утепленные яичек, способствуя тем самым течению манипуляций; (2) ультра-быстрое охлаждение позволяет оптимальной экспозиции тканей для жидкого азота, поэтому максимального охлаждения и снижения требуемой концентрации криопротектора, тем самым снижая их токсичности; (3) синхронное воздействие несколькими яичек криопротекторов и жидкого азота; и (4) повторяемость подтверждается получение жизнеспособности выше 50% в пяти различных данио рерио штаммов.
Introduction
Новые тенденции в науке и биотехнологии привели к созданию тысяч новых мутантов линий мыши, дрозофилы, данио рерио и других видов используется как модельные организмы в биомедицинских и других наук1. Кроме того как новые технологии разрабатываются и становятся доступными, число мутантных линий неуклонно расти2. Это приводит к необходимости для безопасного хранения генетических ресурсов за пределами общей практики ведения селекции колоний. Как метод, который позволяет безопасного хранения генетических ресурсов для неопределенного периода времени, криоконсервация предлагает множество преимуществ, таких, как расширение репродуктивных сезона, обходит необходимость непрерывного поддержания broodstock, и это больше стоимости – и энергосберегающий труда2.
Протоколы для криоконсервации спермы, разработанных в последние несколько лет2,,34 предлагают возможность для успешного хранения, мужчины данио рерио генетического материала. Однако криоконсервация яйцеклетки или эмбрионы в рыбе пока невозможно из-за их сложную структуру и большое количество материала желток. Недавно практика трансплантации первичных зародышевых клеток (PGCs) или сперматогониальные стволовые клетки (SSCs) предлагает обойти этот барьер путем разработки функциональных спермы и яйца после пересадки5. Таким образом криоконсервация SSCs предлагает новые рубежи в сохранении редких и ценных генетических ресурсов.
Хотя криоконсервирования предлагает множество преимуществ, замедлить скорость замораживания процесс генерирует несколько условий, которые могут привести к повреждение клетки2. К ним относятся формирование внутриклеточного и внеклеточного льда, обезвоживание, криопротектора токсичности и другие. Внутриклеточного льда повреждает клетки, внеклеточного льда может привести к механического дробления клеток, в то время как диффузия воды из клеток во время замедлить скорость замораживания может привести к обезвоживанию6. Недавно витрификации как технику, которая предотвращает негативные последствия формирования льда были применены в криоконсервирования рыбы гамет7,8,9. Он представляет сверхбыстрого охлаждения технику через который внутренних и внешних СМИ превращаются в аморфных/стеклообразном состоянии без crystalizing в лед7,10. В птиц и млекопитающих видов10,11,12, тем самым открывая возможности для его применения в рыб, а также свидетельствует успешное витрификации ткани яичек и яичников.
В этом исследовании мы представляем иглы погруженным стеклования (NIV) процедура криоконсервации всего данио рерио яичек. Мы демонстрируем надежный метод для изоляции данио рерио ранней стадии зародыша клетки без загрязнения и криоконсервацию процесс, который дает сравнительно высокое количество ранней стадии зародыша клетки с низким присутствием других клеток, особенно сперматозоидов. В меру наших знаний это первое исследование продемонстрировать подробный визуализированных протокол для ультра-быстрого охлаждения рыбы гонадной материи и данио рерио микрофлорой клеток. Кроме того, воспроизводимости метода демонстрируется в пяти различных данио рерио штаммов: AB дикого типа, Каспер (Рой– / –; перламутр– / –), леопард (Леоt1/t1), Васа [тг (vas::eGFP)] и трансгенные линии Вильмс опухоли [тг (wt1b::eGFP 1)].
Protocol
Representative Results
Discussion
Основной целью данного исследования было адаптировать иглы погруженным сверхбыстрого охлаждения процедуры, разработанные для птиц и млекопитающих видов10,11,12 – замораживание рыбы яички (у рыбок данио как модель организм). Большинство…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Это исследование было поддержано национальных исследований, разработок и инноваций управление Венгрии (Грант 116912 в ÁH), стоимость управления (продовольствие и сельское хозяйство стоимость действий FA1205: AQUAGAMETE), обладательница Хунгарикум стипендий (Грант для ZM) и новый Венгерский национальный Excellence лектор стипендий (Грант EK).
Materials
| Leibovitz media (L-15) | Sigma-Aldrich | L1518 | Supplemented with L-glutamine |
| Fetal bovine serum (FBS) | Sigma-Aldrich | F9665 | |
| Tricaine methanesulfonate (MS-222) | Sigma-Aldrich | E10521 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| Sucrose | Acros Organics | 57-50-1 | |
| Trehalose | Acros Organics | 99-20-7 | Dihydrate |
| Methanol | Reanal | 20740-0-08-65 | |
| Propylene glycol | Reanal | 08860-1-08-65 | |
| Dimethyl sulfoxide | Reanal | 00190-1-01-65 | |
| Collagenase | Gibco | 9001-12-1 | |
| Trypsin | Sigma-Aldrich | T8003 | |
| DNase I | Panreac AppliChem | A3778 | |
| Trypan blue | Sigma-Aldrich | T6146 | |
| Phospate buffered saline (PBS) | Sigma-Aldrich | P4417 | Tablets for preparation of 200 ml PBS solution |
References
- Mazur, P., Leibo, S. P., Seidel, G. R. J. Cryopreservation of the germplasm of animals used in biological and medical research: Importance, impact, status, and future directions. Biol. Reprod. 78 (1), 2-12 (2008).
- Carmichael, C., Westerfield, M., Varga, Z. M. Cryopreservation and In Vitro Fertilization at the Zebrafish International Resource Center. Methods Mol. Biol. 546, 45-65 (2009).
- Yang, H., Carmichael, C., Varga, Z. M., Tiersch, T. R. Development of a simplified and standardized protocol with potential for high-throughput for sperm cryopreservation in zebrafish Danio rerio. Theriogenology. 68 (2), 128-136 (2007).
- Morris, J. P., Berghmans, S., Zahrieh, D., Neuberg, D. S., Kanki, J. P., Look, A. T. Zebrafish sperm cryopreservation with N,N-dimethylacetamide. Biotechniques. 35 (5), 956-968 (2003).
- Yoshizaki, G., et al. Spermatogonial transplantation in fish: A novel method for the preservation of genetic resources. Comp. Biochem. Physiol. Part D: Genomics Proteomics. 6 (1), 55-61 (2011).
- Gao, D., Critser, J. K. Mechanisms of cryoinjury in living cells. ILAR J. 41 (4), 187-196 (2000).
- Asturiano, J. F., Cabrita, E., Horváth, &. #. 1. 9. 3. ;. Progress, challenges and perspectives on fish gamete cryopreservation: A mini-review. Gen. Comp. Endocrinol. 245, 69-76 (2017).
- Kása, E., et al. Development of sperm vitrification protocols for freshwater fish (Eurasian perch, Perca fluviatilis) and marine fish (European eel, Anguilla anguilla). Gen. Comp. Endocrinol. 245, 102-107 (2017).
- Cuevas-Uribe, R., Leibo, S. P., Daly, J., Tiersch, T. R. Production of channel catfish with sperm cryopreserved by rapid non-equilibrium cooling. Cryobiology. 63 (3), 186-197 (2011).
- Wang, Y., Xiao, Z., Li, L., Fan, W., Li, S. W. Novel needle immersed vitrification: A practical and convenient method with potential advantages in mouse and human ovarian tissue cryopreservation. Hum. Reprod. 23 (10), 2256-2265 (2008).
- Liu, J., Cheng, K. M., Silversides, F. G. Production of Live Offspring from Testicular Tissue Cryopreserved by Vitrification Procedures in Japanese Quail (Coturnix japonica). Biol. Reprod. 88 (5), 124 (2013).
- Liu, J., Cheng, K. M., Silversides, F. G. Novel needle-in-straw vitrification can effectively preserve the follicle morphology, viability, and vascularization of ovarian tissue in Japanese quail (Coturnix japonica). Anim. Reprod. Sci. 134 (3-4), 197-202 (2012).
- Lee, S., Yoshizaki, G. Successful cryopreservation of spermatogonia in critically endangered Manchurian trout (Brachymystax lenok). Cryobiology. 72 (2), 165-168 (2016).
- Marques, L. S., et al. Viability of zebrafish (Danio rerio) ovarian follicles after vitrification in a metal container. Cryobiology. 71 (3), 367-373 (2015).
- Lujić, J., et al. First successful vitrification of salmonid ovarian tissue. Cryobiology. 76, 154-157 (2017).
- Bono-Mestre, C., Cardona-Costa, J., García-Ximénez, F. Effects on cell viability of three zebrafish testicular cell or tissue cryopreservation methods. CryoLetters. 30 (2), 148-152 (2009).
- Marinović, Z., et al. Cryosurvival of isolated testicular cells and testicular tissue of tench Tinca tinca and goldfish Carassius auratus following slow-rate freezing. Gen. Comp. Endocrinol. 245, 77-83 (2017).
- Pšenička, M., Saito, T., Rodina, M., Dzyuba, B. Cryopreservation of early stage Siberian sturgeon Acipenser baerii germ cells, comparison of whole tissue and dissociated cells. Cryobiology. 72, 119-122 (2016).
- Lee, S., Iwasaki, Y., Shikina, S., Yoshizaki, G. Generation of functional eggs and sperm from cryopreserved whole testes. Proc. Nati. Acad. Sci. USA. 110 (5), 1640-1645 (2013).
