Kryopræservering af zebrafisk Spermatogonia af hele testiklerne nål nedsænket ultra-hurtig nedkøling
Summary
Det vigtigste formål med denne undersøgelse var at tilpasse nålen nedsænket vitrifikation (NIV) proceduren for at cryopreserve hele zebrafisk testiklerne. Derudover blev repeterbarhed af metoden i fem forskellige zebrafisk stammer testet.
Abstract
Aktuelle tendenser i videnskab og bioteknologi føre til skabelse af tusindvis af nye linjer i modelorganismer dermed fører til nødvendigheden af nye metoder til sikker opbevaring af genetiske ressourcer ud over de fælles praksis at holde avl kolonier. Det vigtigste formål med denne undersøgelse var at tilpasse nålen nedsænket vitrifikation (NIV) proceduren for at cryopreserve hele zebrafisk testiklerne. Kryopræservering af tidlige kønsceller af hele testiklerne NIV tilbyder muligheder for opbevaring af zebrafisk genetiske ressourcer, især da efter transplantation kan de modnes til både mandlige og kvindelige gameter. Testiklerne var skåret ud, fastgjort på en akupunktur nål, ekvilibreres i to cryoprotective media (vitrifikation løsning indeholdende 3 M dimethylsulfoxid og 3 M propylenglycol og ækvilibrering løsning indeholdende 1,5 M methanol og 1,5 M propylenglycol;) og kastet ind i flydende kvælstof. Prøver var varmet i en serie af tre deraf følgende opvarmning løsninger. De vigtigste fordele ved denne teknik er (1) manglen sædceller efter fordøjelsen af varmede testiklerne således lette downstream manipulationer; (2) ultra-hurtig afkøling giver den optimale eksponering af væv til flydende kvælstof derfor maksimere køling og reducere den nødvendige koncentration af cryoprotectants, hvorved deres toksicitet; (3) synkron eksponering af flere testiklerne til cryoprotectants og flydende kvælstof; og (4) repeterbarhed demonstreret ved at opnå rentabilitet over 50% i fem forskellige zebrafisk stammer.
Introduction
Nye tendenser i videnskab og bioteknologi har ført til oprettelsen af tusindvis af nye mutant linjer med mus, Drosophila, zebrafisk og andre arter, der anvendes som modelorganismer i biomedicinske og andre videnskaber1. Desuden, som nye teknologier er udviklet og bliver tilgængelige, antallet af mutant linjer støt stige2. Dette fører til behovet for en sikker opbevaring af genetiske ressourcer ud over de fælles praksis at holde avl kolonier. Som en metode, som giver mulighed for sikker opbevaring af genetiske ressourcer på ubestemt tid, kryopræservering tilbyder mange fordele såsom udvidelse af yngleperioden, omgår behovet for løbende vedligeholdelse af gydebestande, og det er mere omkostninger – og arbejdskraft-effektiv2.
Protokoller for sperm kryopræservering udviklet i løbet af de sidste flere år2,3,4 giver mulighed for vellykket opbevaring zebrafisk male genmateriales. Dog er kryopræservering af æg eller embryoner i fisk endnu ikke muligt på grund af deres komplekse struktur og store mængder af æggeblomme materiale. For nylig, praksis af transplantation af primordiale kønsceller (PGCs) eller spermatogonial stamceller (SSCs) tilbyder en bypass til denne barriere ved at udvikle sig til funktionelle sædceller og æg efter transplantation5. Derfor tilbyder kryopræservering af SSCs en ny grænse i bevaringen af sjældne og værdifulde plantegenetiske ressourcer.
Selvom kryopræservering tilbyder mange fordele, genererer den langsomme sats indefrysning processen flere betingelser, der kan føre til celle skade2. Disse omfatter intracellulære og ekstracellulære is dannelse, dehydrering og kryoprotektant toksicitet. Intracellulære is skader cellerne, ekstracellulære is kan føre til mekanisk knusning af celler, mens vand diffusion fra celler under langsom-sats frysning kan føre til dehydrering6. For nylig, vitrifikation som en teknik, som forhindrer, at de negative virkninger af ice dannelse har været anvendt i kryopræservering af fisk mælke7,8,9. Det præsenterer en ultra-hurtig Køleteknik, hvorigennem de interne og eksterne medier dreje ind i en amorf/glasagtigt tilstand uden crystalizing til ice7,10. Vellykket forglasning af testikelkræft, og æggestokkene væv har været dokumenteret i aviær og pattedyr arter10,11,12, således at åbne muligheder for dens anvendelse i fisk, samt.
I denne undersøgelse præsenterer vi nål nedsænket vitrifikation (NIV) proceduren for kryopræservering af hele zebrafisk testiklerne. Vi demonstrere en pålidelig metode til isolering af zebrafisk debuterende kønsceller uden forurening og en kryopræservering proces, der giver relativt store mængder af tidlige kønsceller med en lav forekomst af andre celler, især sædcellerne. Til bedste af vores viden er dette den første undersøgelse at vise en detaljeret visualiseret protokol for ultra-hurtig nedkøling af fisk gonadale væv og zebrafisk kønscelleoverførsel celler. Derudover repeterbarhed af metoden er demonstreret i fem forskellige zebrafisk stammer: AB vildtype, casper (roy– / –; nacre– / –), leopard (leot1/t1), vasa [Tg (vas::eGFP)] og Wilms tumor [Tg (wt1b::eGFP 1)] transgene linje.
Protocol
Representative Results
Discussion
Det vigtigste formål med denne undersøgelse var at tilpasse nålen nedsænket ultra-hurtig afkøling procedure udviklet for aviær og pattedyr arter10,11,12 til kryopræservering af fisk testis (zebrafisk som model organisme). De fleste af de tidligere undersøgelser vedrørende kryopræservering af zebrafisk genetiske ressourcer var primært fokuseret på kryopræservering af zebrafisk sperm2,</su…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Denne undersøgelse blev støttet af den nationale forskning, udvikling og Innovation Office af Ungarn (grant 116912 til ÁH), COST-kontoret (fødevarer og landbrug COST Action FA1205: AQUAGAMETE), Stipendium Hungaricum Scholarship program (tilskud til ZM) og nye Ungarske nationale Excellence Predoctoral Fellowship (tilskud til EK).
Materials
| Leibovitz media (L-15) | Sigma-Aldrich | L1518 | Supplemented with L-glutamine |
| Fetal bovine serum (FBS) | Sigma-Aldrich | F9665 | |
| Tricaine methanesulfonate (MS-222) | Sigma-Aldrich | E10521 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| Sucrose | Acros Organics | 57-50-1 | |
| Trehalose | Acros Organics | 99-20-7 | Dihydrate |
| Methanol | Reanal | 20740-0-08-65 | |
| Propylene glycol | Reanal | 08860-1-08-65 | |
| Dimethyl sulfoxide | Reanal | 00190-1-01-65 | |
| Collagenase | Gibco | 9001-12-1 | |
| Trypsin | Sigma-Aldrich | T8003 | |
| DNase I | Panreac AppliChem | A3778 | |
| Trypan blue | Sigma-Aldrich | T6146 | |
| Phospate buffered saline (PBS) | Sigma-Aldrich | P4417 | Tablets for preparation of 200 ml PBS solution |
References
- Mazur, P., Leibo, S. P., Seidel, G. R. J. Cryopreservation of the germplasm of animals used in biological and medical research: Importance, impact, status, and future directions. Biol. Reprod. 78 (1), 2-12 (2008).
- Carmichael, C., Westerfield, M., Varga, Z. M. Cryopreservation and In Vitro Fertilization at the Zebrafish International Resource Center. Methods Mol. Biol. 546, 45-65 (2009).
- Yang, H., Carmichael, C., Varga, Z. M., Tiersch, T. R. Development of a simplified and standardized protocol with potential for high-throughput for sperm cryopreservation in zebrafish Danio rerio. Theriogenology. 68 (2), 128-136 (2007).
- Morris, J. P., Berghmans, S., Zahrieh, D., Neuberg, D. S., Kanki, J. P., Look, A. T. Zebrafish sperm cryopreservation with N,N-dimethylacetamide. Biotechniques. 35 (5), 956-968 (2003).
- Yoshizaki, G., et al. Spermatogonial transplantation in fish: A novel method for the preservation of genetic resources. Comp. Biochem. Physiol. Part D: Genomics Proteomics. 6 (1), 55-61 (2011).
- Gao, D., Critser, J. K. Mechanisms of cryoinjury in living cells. ILAR J. 41 (4), 187-196 (2000).
- Asturiano, J. F., Cabrita, E., Horváth, &. #. 1. 9. 3. ;. Progress, challenges and perspectives on fish gamete cryopreservation: A mini-review. Gen. Comp. Endocrinol. 245, 69-76 (2017).
- Kása, E., et al. Development of sperm vitrification protocols for freshwater fish (Eurasian perch, Perca fluviatilis) and marine fish (European eel, Anguilla anguilla). Gen. Comp. Endocrinol. 245, 102-107 (2017).
- Cuevas-Uribe, R., Leibo, S. P., Daly, J., Tiersch, T. R. Production of channel catfish with sperm cryopreserved by rapid non-equilibrium cooling. Cryobiology. 63 (3), 186-197 (2011).
- Wang, Y., Xiao, Z., Li, L., Fan, W., Li, S. W. Novel needle immersed vitrification: A practical and convenient method with potential advantages in mouse and human ovarian tissue cryopreservation. Hum. Reprod. 23 (10), 2256-2265 (2008).
- Liu, J., Cheng, K. M., Silversides, F. G. Production of Live Offspring from Testicular Tissue Cryopreserved by Vitrification Procedures in Japanese Quail (Coturnix japonica). Biol. Reprod. 88 (5), 124 (2013).
- Liu, J., Cheng, K. M., Silversides, F. G. Novel needle-in-straw vitrification can effectively preserve the follicle morphology, viability, and vascularization of ovarian tissue in Japanese quail (Coturnix japonica). Anim. Reprod. Sci. 134 (3-4), 197-202 (2012).
- Lee, S., Yoshizaki, G. Successful cryopreservation of spermatogonia in critically endangered Manchurian trout (Brachymystax lenok). Cryobiology. 72 (2), 165-168 (2016).
- Marques, L. S., et al. Viability of zebrafish (Danio rerio) ovarian follicles after vitrification in a metal container. Cryobiology. 71 (3), 367-373 (2015).
- Lujić, J., et al. First successful vitrification of salmonid ovarian tissue. Cryobiology. 76, 154-157 (2017).
- Bono-Mestre, C., Cardona-Costa, J., García-Ximénez, F. Effects on cell viability of three zebrafish testicular cell or tissue cryopreservation methods. CryoLetters. 30 (2), 148-152 (2009).
- Marinović, Z., et al. Cryosurvival of isolated testicular cells and testicular tissue of tench Tinca tinca and goldfish Carassius auratus following slow-rate freezing. Gen. Comp. Endocrinol. 245, 77-83 (2017).
- Pšenička, M., Saito, T., Rodina, M., Dzyuba, B. Cryopreservation of early stage Siberian sturgeon Acipenser baerii germ cells, comparison of whole tissue and dissociated cells. Cryobiology. 72, 119-122 (2016).
- Lee, S., Iwasaki, Y., Shikina, S., Yoshizaki, G. Generation of functional eggs and sperm from cryopreserved whole testes. Proc. Nati. Acad. Sci. USA. 110 (5), 1640-1645 (2013).
