המטרה העיקרית של מחקר זה היה להתאים את המחט שקוע ויטריפיקציה (ניב) הליך כדי cryopreserve כל דג זברה האשכים. בנוסף, נבדקה את הדיר של שיטת חמישה זנים שונים דג זברה.
המגמות הנוכחיות מדעים וביוטכנולוגיה להוביל יצירה של אלפי קווים חדשים דגם אורגניזמים ובכך מובילים והצורך שיטות חדשות עבור אחסון בטוח של משאבים גנטי מעבר השיטות הנפוצות אצל לשמור. על גידול במושבות. המטרה העיקרית של מחקר זה היה להתאים את המחט שקוע ויטריפיקציה (ניב) הליך כדי cryopreserve כל דג זברה האשכים. הקפאה קריוגנית תאי נבט בשלב מוקדם על ידי האשכים כל ניב מציע אפשרויות האחסון של דג זברה משאבים גנטי, במיוחד לאחר ההשתלה יכולה פירעונם לתוך גמטות גם זכר וגם נקבה. האשכים היו טוחנות, על מחט אקופונקטורה, equilibrated בתקשורת cryoprotective שני (equilibration לאודנום מתנול 1.5 M ו- 1.5 M פרופילן גליקול; ופתרון ויטריפיקציה המכילה 3 מ’ דימתיל סולפוקסיד ו 3 מ’ פרופילן גליקול) צלל לתוך חנקן נוזלי. הדגימות היו חימם בסדרה של שלושה פתרונות חימום הסוגר. היתרונות העיקריים של שיטה זו הם (1) חוסר spermatozoa לאחר העיכול של האשכים ומחוממת למוצא מניפולציות במורד הזרם; (2) אולטרה מהירה קירור המאפשרים את החשיפה האופטימלית של רקמות לחנקן נוזלי ולכן למקסם את הקירור ואת הקטנת הריכוז הנדרש של cryoprotectants, ובכך מקצר את הרעילות שלהם; (3) סינכרונית חשיפת האשכים מספר cryoprotectants, חנקן נוזלי; והפגינו הדיר (4) על-ידי רכישת יכולת הקיום של מעל 50% ב- 5 זנים שונים דג זברה.
הרומן מגמות מדעים וביוטכנולוגיה הובילו ליצירתו של אלפי שורות מוטציה חדשה של עכברים, דרוזופילה, דג זברה, מינים אחרים משמשים והאורגניזמים מודל ביורפואי ו- מדעים אחרים1. יתר על כן, כפי טכנולוגיות חדשות שפותחו ולהיות זמין, מספרי הקווים המוטנטים להגדיל בהתמדה2. זה מוביל הצורך אחסון בטוח של משאבים גנטי מעבר השיטות הנפוצות אצל לשמור. על גידול במושבות. כמו שיטה המאפשרת אחסון בטוח של משאבים גנטי לתקופה לא מוגבלת של זמן, הקפאה קריוגנית מציע יתרונות רבים כגון הארכת עונת הרבייה, עוקף את הצורך תחזוקה רציפה של broodstock, זה יותר עלות – ו עבודה יעיל2.
פרוטוקולים עבור זרע הקפאה קריוגנית פיתחה במהלך בעבר מספר שנים2,3,4 מציעים את ההזדמנות לאחסון מוצלחת של חומר גנטי זכר דג זברה. עם זאת, הקפאה קריוגנית של ביציות או עוברים בדגים אינו אפשרי עדיין בשל המבנה המורכב שלהם ואת כמויות גדולות של חומר חלמון. לאחרונה, המנהג של השתלת בתאי הנבט הקדמוני (PGCs) או בתאי גזע spermatogonial (SSCs) מציע ניתוח מעקפים כדי מחסום זה מתפתח זרע פונקציונלי וביצים לאחר השתלת5. לכן, הקפאה קריוגנית של SSCs מציע אפיק חדש בתחום שימור משאבים גנטי נדיר ורב ערך.
אף-על-פי הקפאה קריוגנית מציע יתרונות רבים, תהליך ההקפאה של קצב איטי מייצר מספר תנאים שעלולות להוביל לנזק תא2. אלה כוללים היווצרות קרח תאיים חוץ-תאית, התייבשות, רעילות cryoprotectant ואחרים. קרח תאיים גורם נזק לתאים, קרח חוץ-תאית עשויה להוביל ריסוק מכני של תאים, תוך פיזור מים מתאי במהלך קצב איטי קפוא עלול להוביל להתייבשות6. לאחרונה הוחל ויטריפיקציה כמו שיטה אשר מונע את ההשפעות השליליות של היווצרות קרח ב הקפאה קריוגנית של דגים גמטות7,8,9. הוא מציג שיטת הקירור אולטרה מהירה שדרכו התקשורת פנימיים וחיצוניים להפוך מצב אמורפי מזוגגות ללא crystalizing לתוך קרח7,10. ויטריפיקציה מוצלחת של רקמת האשכים ואת השחלות העגום מינים העופות בתרבית של10,11,12, ובכך לפתוח אפשרויות היישום שלה בדגים, כמו גם.
במחקר זה, אנו מציגים את המחט שקוע ויטריפיקציה (ניב) נוהל הקפאה קריוגנית של כל דג זברה האשכים. נדגים שיטה אמינה עבור בידודו של דג זברה בשלב מוקדם בתאי הנבט ללא זיהום, תהליך הקפאה קריוגנית המניבה כמות גבוהה יחסית בתאי הנבט בשלב מוקדם עם נוכחות נמוכה של תאים אחרים, במיוחד spermatozoa. לפי מיטב ידיעתנו, זהו המחקר הראשון להדגים פרוטוקול מטמיעים מפורט לקירור אולטרה מהירה של רקמת האשכים דגים דג זברה germline תאים. בנוסף, הדיר של השיטה הוא הפגינו חמישה זנים שונים דג זברה: AB פראי סוג, קספר (רוי– / –; נאקרה– / –), נמר (ליאוt1/t1), “ואסה” [Tg (vas::eGFP)] וקו Wilms הגידול [Tg (wt1b::eGFP 1)] מהונדס.
המטרה העיקרית של מחקר זה היתה להתאים את המחט שקוע אולטרה מהירה הליך קירור שפותח עבור מינים העופות בתרבית של10,11,12 הקפאה קריוגנית של דגים testis (דג זברה כמודל האורגניזם). רוב המחקרים הקודמים לגבי הקפאה קריוגנית של משאבים גנטי דג זברה התמקדו בע…
The authors have nothing to disclose.
מחקר זה נתמך על ידי הלאומית למחקר, פיתוח חדשנות Office הונגריה (גרנט 116912 כדי ÁH), המשרד עלות (מזון, חקלאות עלות פעולה FA1205: AQUAGAMETE), התכנית מלגת Hungaricum Stipendium (מענק ZM) והמעבד החדש ההונגרית הלאומית Predoctoral הצטיינות (מענק EK).
Leibovitz media (L-15) | Sigma-Aldrich | L1518 | Supplemented with L-glutamine |
Fetal bovine serum (FBS) | Sigma-Aldrich | F9665 | |
Tricaine methanesulfonate (MS-222) | Sigma-Aldrich | E10521 | |
HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
Sucrose | Acros Organics | 57-50-1 | |
Trehalose | Acros Organics | 99-20-7 | Dihydrate |
Methanol | Reanal | 20740-0-08-65 | |
Propylene glycol | Reanal | 08860-1-08-65 | |
Dimethyl sulfoxide | Reanal | 00190-1-01-65 | |
Collagenase | Gibco | 9001-12-1 | |
Trypsin | Sigma-Aldrich | T8003 | |
DNase I | Panreac AppliChem | A3778 | |
Trypan blue | Sigma-Aldrich | T6146 | |
Phospate buffered saline (PBS) | Sigma-Aldrich | P4417 | Tablets for preparation of 200 ml PBS solution |