Oplosbaarheid van hydrofobe bestanddelen in waterige oplossing met behulp van combinaties van het zelf monteren van Peptide en aminozuur
Summary
Dit protocol beschrijft een klinisch-middelen uit het oplossen van de hydrofobe bestanddelen in een waterige omgeving met behulp van combinaties van het zelf monteren van peptide en aminozuur oplossingen. Onze methode is opgelost een belangrijke beperking van hydrofobe therapeutics, die veilig en efficiënt vervoermiddel oplosbaarheid en levering methoden in klinische instellingen.
Abstract
Zelfassemblerende peptiden (SAPs) zijn veelbelovend voertuigen voor de levering van hydrofobe therapeutics voor klinische toepassingen; de eigenschappen van hun amphipathic laten ontbinden hydrofobe bestanddelen in het waterige milieu van het menselijk lichaam. Zelfassemblerende peptide oplossingen hebben echter slechte bloed compatibiliteit (b.v., lage osmolariteit), belemmeren hun klinische toepassing via intraveneuze overheidsdiensten. We hebben onlangs een veralgemeende platform ontwikkeld voor hydrofobe drug delivery, die sappen met aminozuur oplossingen (SAP-AA combineert) te verbeteren van de drug oplosbaarheid en formulering osmolariteit te bereiken van de eisen voor klinische toepassingen te verhogen. Deze formulering strategie werd grondig getest in het kader van drie structureel verschillende hydrofobe verbindingen – PP2, rottlerin en curcumine-om aan te tonen van de veelzijdigheid. Bovendien, we onderzocht effecten van formulering onderdelen wijzigen door het analyseren van 6 verschillende sappen, 20 natuurlijk bestaande aminozuren bij lage en hoge concentraties, en twee verschillende co oplosmiddelen dimethylsulfoxide (DMSO) en ethanol. Onze strategie bleek effectief in het optimaliseren van onderdelen voor een bepaalde hydrofobe drug en therapeutische functie van de geformuleerde remmer, PP2, werd waargenomen, zowel in vitro als in vivo. Dit manuscript schetst onze algemene formulering-methode met behulp van SAP-AA combinaties voor hydrofobe verbindingen, en analyse van oplosbaarheid als een eerste stap naar potentiële gebruik van deze formuleringen in meer functionele studies. Wij omvatten van representatieve oplosbaarheid resultaten voor de formulering van de hydrofobe samengestelde, curcumine, en bespreken hoe onze methodologie fungeert als een platform voor toekomstige biologische studies en ziekte modellen.
Introduction
Sappen zijn een klasse van biomaterialen die uitgebreid als 3D steigers in regeneratieve geneeskunde1,,2,,3,4zijn bestudeerd. Meer recentelijk echter, hebben ze benut als voertuigen voor de levering van therapeutics vanwege hun unieke biologische eigenschappen5,6,7,8. Sappen natuurlijk samenvoegen tot stabiele nanostructuren9, waardoor een middel van drug inkapselen en bescherming. Sappen zijn amphipathic, bestaat uit een specifiek patroon van hydrofobe en hydrofiele aminozuur wordt herhaald, rijden hun zelf-assemblage9,10 en het toestaan van hen om te dienen als een medium tussen hydrofobe en hydrofiele omgevingen. Bijgevolg voor de klinische levering van hydrofobe medicijnen – die hebben extreem lage biologische beschikbaarheid en de opname in het lichaam door gebrek aan oplosbaarheid in waterige omgevingen11,12 -sappen zijn veelbelovend als een levering voertuig. Bovendien, hun volgorde patroon ook impliceert dat SAPs rationeel kunnen worden ontworpen en gebouwd om te maximaliseren van de compatibiliteit met een bepaalde drug of samengestelde (dat wil zeggen, op basis van functionele groepen) en oplosbaarheid maar ook verdere assistentie.
Sappen zijn toegepast als effectieve drug leverende voertuigen in vele in vitro en in vivo instellingen13,14,15,16. Zij hebben ook aangetoond grote veiligheid en biocompatibiliteit. Echter, als gevolg van lage osmolariteit van SAP-drugs preparaten, ze niet worden gebruikt voor intraveneuze injecties in klinische instellingen13. Gezien deze terughoudendheid, hebben we onlangs een strategie die sappen met aminozuur oplossingen combineert om het gebruik van giftige co oplosmiddelen en verhoging van de osmolariteit van de formulering, ontwikkeld en daarom klinische relevantie. We kiest om te gebruiken aminozuren zijn de bouwstenen van sappen, zijn al klinisch geaccepteerde, en in combinatie met sappen, ze hydrofobe drug oplosbaarheid verhogen terwijl het verminderen van de hoeveelheid SAP vereist17,18.
We hebben onderzocht SAP-AA combinaties als een veralgemeende platform voor hydrofobe drug oplosbaarheid en latere levering door een pijpleiding scriptingregel screening te maken en toe te passen op de Src-remmer, PP2, als een model hydrofobe compound. In dit proces onderzochten we het effect van het wijzigen van de onderdelen van de formulering-uiteindelijk testen 6 verschillende sappen, alle 20 aminozuren op 2 verschillende concentraties (laag en hoog, laag gebaseerd op concentraties in bestaande klinische toepassingen, en hoge concentraties waren 2 x, 3 x of 5 x de klinische concentratie op basis van de maximale oplosbaarheid van elk aminozuur in water), en 2 verschillende co oplosmiddelen – en geselecteerde combinaties die ontbindend PP2 voor verdere analyse. De formulering van deze drug bewezen effectief als een drug leveringsvoertuig in celkweek, evenals in vivo modellen met behulp van zowel intratracheale en intraveneuze overheidsdiensten. Ook onze werkzaamheden aangeraakt op de veelzijdigheid van SAP-AA combinaties in solubilizing meerdere, structureel-verschillende hydrofobe bestanddelen in waterige omgevingen; in het bijzonder de drugs rottlerin en curcumine18. Dit manuscript schetst de SAP-AA formulering methode en de analyse van curcumine oplosbaarheid als een voorbeeld van de primaire stap in onze screening-pijplijn. Dit protocol biedt een eenvoudige, reproduceerbare manier naar scherm voor de optimale combinaties van de SAP-AA, die los van een bepaalde hydrofobe verbinding.
Protocol
Representative Results
Discussion
In de formulering procedure zijn er verschillende kritische stappen en punten te overwegen bij het oplossen. Ten eerste, als we met diverse componenten en concentraties werken, meerdere vortex stappen in het gehele protocol zorgen ervoor dat alle concentraties uniforme en correcte. Enkele van de oplossingen van de hoge-concentratie, hydrofoob aminozuur kan nog niet worden volledig ontbonden na vortexing, en in dit geval, zij krachtig kunnen worden geschud met de hand om te helpen in het proces. Ook is het essentieel dat …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk wordt ondersteund door de Canadese instituten van gezondheidsonderzoek, exploitatiesubsidies voor MOP-42546 en MOP-119514.
Materials
| EAK16-I | CanPeptide Inc. | Custom peptide | Sequence: AEAKAEAKAEAKAEAK, N-terminus acetylation and C-terminus amidation, >95% pure by HPLC |
| EAK16-II | CanPeptide Inc. | Custom peptide | Sequence: AEAEAKAKAEAEAKAK, N-terminus acetylation and C-terminus amidation, >95% pure by HPLC |
| EAK16-IV | CanPeptide Inc. | Custom peptide | Sequence: AEAEAEAEAKAKAKAK, N-terminus acetylation and C-terminus amidation, >95% pure by HPLC |
| EFK8-II | CanPeptide Inc. | Custom peptide | Sequence: FEFEFKFK, N-terminus acetylation and C-terminus amidation, >95% pure by HPLC |
| A6KE | CanPeptide Inc. | Custom peptide | Sequence: AAAAAAKE, N-terminus acetylation and C-terminus amidation, >95% pure by HPLC |
| P6KE | CanPeptide Inc. | Custom peptide | Sequence: PPPPPPPKE, N-terminus acetylation and C-terminus amidation, >95% pure by HPLC |
| Alanine | Sigma-Aldrich | A7469-100G | L-Alanine |
| Isoleucine | Sigma-Aldrich | I7403-100G | L-Isoleucine |
| Leucine | Sigma-Aldrich | L8912-100G | L-Leucine |
| Methionine | Sigma-Aldrich | M5308-100G | L-Methionine |
| Proline | Sigma-Aldrich | P5607-100G | L-Proline |
| Valine | Sigma-Aldrich | V0513-100G | L-Valine |
| Phenylalanine | Sigma-Aldrich | P5482-100G | L-Phenylalanine |
| Tryptophan | Sigma-Aldrich | T8941-100G | L-Tryptophan |
| Tyrosine | Sigma-Aldrich | T8566-100G | L-Tyrosine |
| Glycine | Sigma-Aldrich | G8790-100G | L-Glycine |
| Asparagine | Sigma-Aldrich | A4159-100G | L-Asparagine |
| Glutamine | Sigma-Aldrich | G8540-100G | L-Glutamine |
| Serine | Sigma-Aldrich | A7219-100G | L-Serine |
| Threonine | Sigma-Aldrich | T8441-100G | L-Threonine |
| Histidine | Sigma-Aldrich | H6034-100G | L-Histidine |
| Lysine | Sigma-Aldrich | L5501-100G | L-Lysine |
| Arginine | Sigma-Aldrich | A8094-100G | L-Arginine |
| Aspartic Acid | Sigma-Aldrich | A7219-100G | L-Aspartic Acid |
| Glutamic Acid | Sigma-Aldrich | G8415-100G | L-Glutamic Acid |
| Cysteine | Sigma-Aldrich | C7352-100G | L-Cysteine |
| Dimethyl Sulfoxide | Sigma-Aldrich | D4540-500ML | DMSO |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | 277649-100ML | Anhydrous |
| Curcumin | Sigma-Aldrich | 08511-10MG | Hydrophobic drug, curcumin |
| Rottlerin | EMD Millipore | 557370-10MG | Hydrophobic drug, rottlerin |
| PP2 | Enzo | BML-EI297-0001 | Hydrophobic drug, PP2 |
| Scintillation Vials | VWR | 2650-66022-081 | Borosilicate Glass, with Screw Cap, 20 mL. Vials for weighing peptide. |
| Falcon 50 mL Conical Centrifugation Tubes | VWR | 352070 | Polypropylene, Sterile, 50 mL. For amino acid solutions. |
References
- Holmes, T. C., de Lacalle, S., Su, X., Liu, G., Rich, A., Zhang, S. Extensive neurite outgrowth and active synapse formation on self-assembling peptide scaffolds. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 97 (12), 6728-6733 (2000).
- Davis, M. E., Motion, J. P. M., et al. Injectable self-assembling peptide nanofibers create intramyocardial microenvironments for endothelial cells. Circulation. 111 (4), 442-450 (2005).
- Matson, J. B., Stupp, S. I. Self-assembling peptide scaffolds for regenerative medicine. Chem. Commun. 48 (1), 26-33 (2012).
- Tatman, P. D., Muhonen, E. G., Wickers, S. T., Gee, A. O., Kim, E., Kim, D. Self-assembling peptides for stem cell and tissue engineering. Biomater. Sci. 4 (4), 543-554 (2016).
- Keyes-Baig, C., Duhamel, J., Fung, S. -. Y., Bezaire, J., Chen, P. Self-assembling peptide as a potential carrier of hydrophobic compounds. J. Am. Chem. Soc. 126 (24), 7522-7532 (2004).
- Kumar, P., Pillay, V., Modi, G., Choonara, Y. E., du Toit, L. C., Naidoo, D. Self-assembling peptides: implications for patenting in drug delivery and tissue engineering. Recent Pat. Drug Deliv. Formul. 5 (1), 24-51 (2011).
- Wang, H., Yang, Z. Short-peptide-based molecular hydrogels: novel gelation strategies and applications for tissue engineering and drug delivery. Nanoscale. 4, 5259-5267 (2012).
- French, K. M., Somasuntharam, I., Davis, M. E. Self-assembling peptide-based delivery of therapeutics for myocardial infarction. Adv. Drug Deliv. Rev. 96, 40-53 (2016).
- Zhang, S., Holmes, T., Lockshin, C., Rich, A. Spontaneous assembly of a self-complementary oligopeptide to form a stable macroscopic membrane. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 90 (8), 3334-3338 (1993).
- Bowerman, C. J., Nilsson, B. L. Self-assembly of amphipathic β-sheet peptides: insights and applications. Biopolymers. 98 (3), 169-184 (2012).
- Amidon, G., Lennernäs, H., Shah, V., Crison, J. A theoretical basis for a biopharmaceutic drug classification: the correlation of in vitro drug product dissolution and in vivo bioavailability. Pharm. Res. 12 (3), 413-420 (1995).
- Shi, Y., Porter, W., Merdan, T., Li, L. C. Recent advances in intravenous delivery of poorly water-soluble compounds. Expert Opin. Drug Deliv. 6 (12), 1261-1282 (2009).
- Bawa, R., Fung, S. -. Y., et al. Self-assembling peptide-based nanoparticles enhance cellular delivery of the hydrophobic anticancer drug ellipticine through caveolae-dependent endocytosis. Nanomedicine. 8 (5), 647-654 (2012).
- Liu, J., Zhang, L., Yang, Z., Zhao, X. Controlled release of paclitaxel from a self-assembling peptide hydrogel formed in situ and antitumor study in vitro. Int. J. Nanomed. 6, 2143-2153 (2011).
- Wu, Y., Sadatmousavi, P., Wang, R., Lu, S., Yuan, Y., Chen, P. Self-assembling peptide-based nanoparticles enhance anticancer effect of ellipticine in vitro and in vivo. Int. J. Nanomed. 7, 3221-3233 (2012).
- Fung, S. Y., Yang, H., et al. Self-Assembling Peptide as a Potential Carrier for Hydrophobic Anticancer Drug Ellipticine: Complexation, Release and In Vitro Delivery. Adv. Funct. Mater. 19 (1), 74-83 (2009).
- Fung, S. -. Y., Oyaizu, T., et al. The potential of nanoscale combinations of self-assembling peptides and amino acids of the Src tyrosine kinase inhibitor in acute lung injury therapy. Biomaterials. 32 (16), 4000-4008 (2011).
- Pacheco, S., Kanou, T., et al. Formulation of hydrophobic therapeutics with self-assembling peptide and amino acid: A new platform for intravenous drug delivery. J. Control. Release. 239, 211-222 (2016).
