Löslichkeit von hydrophoben Verbindungen in wässriger Lösung unter Verwendung von Kombinationen der Montage selbst Peptide und Aminosäuren
Summary
Dieses Protokoll beschreibt ein klinisch einsetzbaren Mittel zur Auflösung von hydrophober Verbindungen in einer wässrigen Umgebung unter Verwendung von Kombinationen der Peptide und Aminosäuren-Lösungen selbst zusammenstellen. Unsere Methode löst eine große Einschränkung hydrophobe Therapeutika, die sichere und effiziente Mittel zur Löslichkeit und Lieferung Methoden in klinischen Einrichtungen fehlen.
Abstract
Selbstorganisierende Peptide (SAPs) sind vielversprechende Fahrzeuge für die Lieferung von hydrophoben Therapeutika für klinische Anwendungen; Ihre amphipathische Eigenschaften erlauben ihnen, hydrophobe Verbindungen in der wässrigen Umgebung des menschlichen Körpers aufzulösen. Selbstorganisierende Peptid-Lösungen haben jedoch schlechte Durchblutung Kompatibilität (z.B. niedrige Osmolarität), deren klinische Anwendung durch intravenöse Verwaltungen zu behindern. Wir haben vor kurzem eine allgemeine Plattform für hydrophobe Drug-Delivery entwickelt, die SAPS mit Aminosäuren-Lösungen (SAP-AA verbindet) bis Wirkstofflöslichkeit erhöhen und Formulierung Osmolarität um die Voraussetzungen für klinische Anwendungen zu erreichen. Diese Formulierung-Strategie wurde im Rahmen der drei strukturell unterschiedlichen hydrophobe Verbindungen – PP2, Rottlerin und Curcumin – um seine Vielseitigkeit unter Beweis stellen gründlich getestet. Darüber hinaus haben wir untersucht Auswirkungen des Änderns Formulierungsbestandteilen durch 6 verschiedene Säfte, 20 natürlich vorhandenen Aminosäuren bei niedrigen und hohen Konzentrationen, und zwei verschiedene Zusatzlösungsmittel Dimethyl Sulfoxid (DMSO) und Ethanol zu analysieren. Unsere Strategie erwies sich als wirksam bei der Optimierung von Komponenten für einen gegebenen hydrophobe Drogen- und therapeutische Funktion des formulierten Inhibitors, PP2, wurde in Vitro und in Vivobeobachtet. Dieses Manuskript beschreibt unsere verallgemeinerte Formulierung-Methode unter Verwendung von SAP-AA-Kombinationen für hydrophobe Verbindungen und Analyse der Löslichkeit als ein erster Schritt zur möglichen Verwendung dieser Formulierungen in funktioneller Studien. Wir gehören repräsentative Löslichkeit Ergebnisse für die Formulierung von hydrophoben zusammengesetzte, Curcumin und besprechen, wie unsere Methodik dient als Plattform für biologische Zukunftsstudien und Krankheitsmodelle.
Introduction
Säfte sind eine Klasse von Biomaterialien, die weitgehend als 3D Gerüste in regenerative Medizin1,2,3,4untersucht wurden. Vor kurzem wurden jedoch sie als Vehikel für die Lieferung von Therapeutika aufgrund ihrer einzigartigen biologischen Eigenschaften5,6,7,8genutzt. SAPs montieren natürlich in stabilen Nanostrukturen9, wodurch ein Mittel zur Droge Kapselung und Schutz. Säfte sind amphipathische, bestehend aus einem bestimmten Muster der hydrophobe und hydrophile Aminosäure Wiederholungen, fahren ihre Self-assembly9,10 und sie dienen als Medium zwischen hydrophoben und hydrophilen Umgebungen. Infolgedessen für die klinische Abgabe von hydrophoben Medikamenten – die extrem geringe Bioverfügbarkeit und Absorption im Körper haben aufgrund mangelnden Löslichkeit in wässrigen Umgebungen11,12 – SAPs sind vielversprechend als eine Lieferung Fahrzeug. Ihre Reihenfolge Muster bedeutet darüber hinaus auch, dass SAPs können rational konzipiert und entwickelt, um maximale Kompatibilität mit jedem bestimmten Medikament oder compound (d. h.anhand der funktionellen Gruppen) und Löslichkeit weiterhelfen.
SAPs wurden als wirksames Medikament Lieferfahrzeuge in viele in Vitro und in Vivo Einstellungen13,14,15,16angewendet. Sie haben auch große Sicherheit und Biokompatibilität bewiesen. Durch niedrige Osmolarität von SAP-medikamentösen Präparaten können sie jedoch für intravenöse Injektionen wie in klinischen Umgebungen13verwendet werden. In Anbetracht dieser Zurückhaltung haben wir vor kurzem entwickelt eine Strategie, die SAPs mit Aminosäure-Lösungen zur Verringerung des Einsatzes von giftigen Co Lösungsmitteln und erhöhen die Formulierung Osmolarität kombiniert und daher klinische Relevanz. Wir wählten mit Aminosäuren sind die Bausteine des SAPs, sind bereits klinisch akzeptiert, und in Kombination mit SAPs, sie erhöhen hydrophobe Wirkstofflöslichkeit Verringerung der Menge an SAP17,18erforderlich.
Wir haben SAP-AA-Kombinationen als eine allgemeine Plattform für hydrophobe Wirkstofflöslichkeit und Nachlieferung geprüft, durch die Schaffung einer mehrstufigen Screening-Pipeline und der Src-Inhibitor, PP2 als Modell hydrophobe Verbindung zuweisen. In diesem Prozess haben wir untersucht die Wirkung der Bestandteile der Rezeptur verändert – letztlich Tests 6 verschiedene Säfte, alle 20 Aminosäuren in 2 verschiedenen Konzentrationen (niedrig und hoch, niedrig basierend auf Konzentrationen in bestehende klinische Anwendungen und hohe Konzentrationen wurden 2 X, 3 X oder 5 X die klinische Konzentration basiert auf der maximalen Löslichkeit der einzelnen Aminosäuren in Wasser), und 2 verschiedenen Co-Lösemittel – und ausgewählten Kombinationen, die für die weitere Analyse PP2 solubilisiert. Dieser Arzneistoff-Formulierung erwies sich als wirksam ist wie eine Droge Lieferfahrzeug in Zellkultur als auch in Vivo Modellen mit intratracheale und intravenös Verwaltungen. Ebenso unsere Arbeit auf die Vielseitigkeit der SAP-AA-Kombinationen in Gefäss-Multiple berührt strukturell unterschiedlichen hydrophobe Verbindungen in wässrigen Umgebungen; insbesondere die Medikamente Rottlerin und Curcumin18. Dieses Manuskript beschreibt die SAP-AA Formulierung Methode und Analyse von Curcumin Löslichkeit als Beispiel für die grundlegende Schritt in unserer Screening-Pipeline. Dieses Protokoll bietet eine einfache und reproduzierbare Möglichkeit zum Bildschirm für die optimale SAP-AA-Kombinationen, die eine gegebene hydrophobe Verbindung aufzulösen.
Protocol
Representative Results
Discussion
In der Formulierung-Prozedur gibt es verschiedene wichtige Schritte und Punkte, die bei der Problembehandlung. Zunächst, wie wir mit verschiedenen Komponenten und Konzentrationen arbeiten, mehrere Wirbel Schritte im gesamten Protokoll sicherstellen, dass alle Konzentrationen einheitlich und korrekt sind. Einige der hoch-Konzentration, hydrophobe Aminosäuren-Lösungen kann immer noch nicht vollständig aufgelöst werden nach dem aufschütteln und kann in diesem Fall kräftig geschüttelt werden, von Hand, in den Prozess…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit von Canadian Institutes of Health Research unterstützt wird, gewährt Betriebs-, MOP-42546 und MOP-119514.
Materials
| EAK16-I | CanPeptide Inc. | Custom peptide | Sequence: AEAKAEAKAEAKAEAK, N-terminus acetylation and C-terminus amidation, >95% pure by HPLC |
| EAK16-II | CanPeptide Inc. | Custom peptide | Sequence: AEAEAKAKAEAEAKAK, N-terminus acetylation and C-terminus amidation, >95% pure by HPLC |
| EAK16-IV | CanPeptide Inc. | Custom peptide | Sequence: AEAEAEAEAKAKAKAK, N-terminus acetylation and C-terminus amidation, >95% pure by HPLC |
| EFK8-II | CanPeptide Inc. | Custom peptide | Sequence: FEFEFKFK, N-terminus acetylation and C-terminus amidation, >95% pure by HPLC |
| A6KE | CanPeptide Inc. | Custom peptide | Sequence: AAAAAAKE, N-terminus acetylation and C-terminus amidation, >95% pure by HPLC |
| P6KE | CanPeptide Inc. | Custom peptide | Sequence: PPPPPPPKE, N-terminus acetylation and C-terminus amidation, >95% pure by HPLC |
| Alanine | Sigma-Aldrich | A7469-100G | L-Alanine |
| Isoleucine | Sigma-Aldrich | I7403-100G | L-Isoleucine |
| Leucine | Sigma-Aldrich | L8912-100G | L-Leucine |
| Methionine | Sigma-Aldrich | M5308-100G | L-Methionine |
| Proline | Sigma-Aldrich | P5607-100G | L-Proline |
| Valine | Sigma-Aldrich | V0513-100G | L-Valine |
| Phenylalanine | Sigma-Aldrich | P5482-100G | L-Phenylalanine |
| Tryptophan | Sigma-Aldrich | T8941-100G | L-Tryptophan |
| Tyrosine | Sigma-Aldrich | T8566-100G | L-Tyrosine |
| Glycine | Sigma-Aldrich | G8790-100G | L-Glycine |
| Asparagine | Sigma-Aldrich | A4159-100G | L-Asparagine |
| Glutamine | Sigma-Aldrich | G8540-100G | L-Glutamine |
| Serine | Sigma-Aldrich | A7219-100G | L-Serine |
| Threonine | Sigma-Aldrich | T8441-100G | L-Threonine |
| Histidine | Sigma-Aldrich | H6034-100G | L-Histidine |
| Lysine | Sigma-Aldrich | L5501-100G | L-Lysine |
| Arginine | Sigma-Aldrich | A8094-100G | L-Arginine |
| Aspartic Acid | Sigma-Aldrich | A7219-100G | L-Aspartic Acid |
| Glutamic Acid | Sigma-Aldrich | G8415-100G | L-Glutamic Acid |
| Cysteine | Sigma-Aldrich | C7352-100G | L-Cysteine |
| Dimethyl Sulfoxide | Sigma-Aldrich | D4540-500ML | DMSO |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | 277649-100ML | Anhydrous |
| Curcumin | Sigma-Aldrich | 08511-10MG | Hydrophobic drug, curcumin |
| Rottlerin | EMD Millipore | 557370-10MG | Hydrophobic drug, rottlerin |
| PP2 | Enzo | BML-EI297-0001 | Hydrophobic drug, PP2 |
| Scintillation Vials | VWR | 2650-66022-081 | Borosilicate Glass, with Screw Cap, 20 mL. Vials for weighing peptide. |
| Falcon 50 mL Conical Centrifugation Tubes | VWR | 352070 | Polypropylene, Sterile, 50 mL. For amino acid solutions. |
References
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