Solubilidade de Compostos Hidrofóbicos em Solução Aquosa Usando Combinações de Peptídeos Automontados e Aminoácidos
Summary
Este protocolo descreve um meio clinicamente aplicável de dissolver compostos hidrofóbicos em um ambiente aquoso, usando combinações de montagem auto soluções de peptídeos e aminoácidos. Nosso método resolve uma limitação importante da terapêutica hidrofóbica, desprovidas de meios seguros e eficientes de solubilidade e entrega métodos em situações clínicas.
Abstract
Peptídeos auto-montagem (SAPs) são veículos promissoras para a entrega da terapêutica hidrofóbica para aplicações clínicas; suas propriedades de anfifílicos lhes permitem dissolver compostos hidrofóbicos no ambiente aquoso do corpo humano. No entanto, soluções de peptídeo auto-montagem tem compatibilidade de sangue pobre (e.g., baixa osmolaridade), dificultando sua aplicação clínica através de administrações intravenosas. Recentemente desenvolvemos uma plataforma generalizada para a entrega da droga hidrofóbico, que combina sucos com soluções de ácido aminado (SAP-AA) para aumentar a solubilidade da droga e aumentar a osmolaridade de formulação para atingir os requisitos para usos clínicos. Esta estratégia de formulação foi exaustivamente testada no contexto de três compostos hidrofóbicos estruturalmente diferentes – PP2, rottlerin e curcumina – a fim de demonstrar a sua versatilidade. Além disso, examinamos os efeitos das variações de componentes de formulação, analisando 6 sucos diferentes, 20 aminoácidos existentes naturalmente em concentrações baixas e altas e dois diferentes co-solventes dimetil sulfóxido (DMSO) e etanol. Nossa estratégia provada para ser eficaz na otimização de componentes para uma determinada droga hidrofóbica e função terapêutica do inibidor formulado, PP2, observou-se tanto em vitro como em vivo. Este manuscrito descreve nosso método de formulação generalizada usando combinações de SAP-AA para compostos hidrofóbicos e análise de solubilidade como um primeiro passo para o potencial de uso destas formulações em estudos mais funcionais. Nós incluir resultados representativos de solubilidade para formulação da curcumina composta, hidrofóbica e discutir como nossa metodologia serve como plataforma para futuros estudos biológicos e modelos de doença.
Introduction
Sucos são uma classe de biomateriais que tem sido estudada extensivamente como andaimes 3D na medicina regenerativa,1,2,3,4. Mais recentemente, no entanto, eles têm sido explorados como veículos para a entrega da terapêutica devido a suas propriedades biológicas únicas5,6,7,8. RPUS naturalmente montam em nanoestruturas estável9, proporcionando assim um meio de proteção e encapsulamento de drogas. Sucos são anfifílicos, composto por um padrão específico de repetições de aminoácidos hidrofóbicos e hidrofílicos, dirigindo seus auto-montagem de9,10 e permitindo-lhes servir como um meio entre hidrofóbica e hidrofílica ambientes. Consequentemente, para a entrega de clínica de fármacos hidrofóbicos – que têm extremamente baixa biodisponibilidade e absorção no corpo devido à falta de solubilidade em ambientes aquosos11,12 – sucos são promissores como uma entrega veículo. Além disso, o seu padrão de sequência também implica que sucos podem ser racionalmente concebidos e projetados para maximizar a compatibilidade com qualquer determinada droga ou composto (ou seja, com base em grupos funcionais) e ajudar ainda mais a solubilidade.
RPUS foram aplicados como veículos de entrega de droga eficaz em muitos in vitro e in vivo configurações13,14,15,16. Eles também têm demonstrado grande segurança e biocompatibilidade. No entanto, devido à baixa osmolaridade de preparações de SAP-droga, eles não podem ser usados para injeções intravenosas como em situações clínicas13. Considerando esta restrição, recentemente desenvolvemos uma estratégia que combina sucos com soluções de aminoácidos para reduzir o uso de solventes tóxicos co e aumentar a osmolaridade de formulação e, portanto, relevância clínica. Nós escolheu usar aminoácidos como eles são os blocos de construção de sucos, já são clinicamente aceitos, e em combinação com sucos, eles aumentam a solubilidade da droga hidrofóbico enquanto reduzindo a quantidade de SAP necessários17,18.
Podemos ter analisadas combinações de SAP-AA como uma plataforma generalizada de solubilidade da droga hidrofóbicas e subsequente entrega criando um pipeline de várias etapas de triagem e aplicá-lo ao inibidor Src, PP2, como um composto hidrofóbico de modelo. Neste processo, nós examinamos o efeito de alterar componentes da formulação – testes, finalmente, 6 sucos diferentes, todos os 20 aminoácidos em 2 concentrações diferentes (baixa e alta; baixo baseados em concentrações nas aplicações clínicas existentes e alta as concentrações foram 2x, 3x ou 5x a concentração clínica baseia-se a solubilidade máxima de cada aminoácido na água) e 2 diferentes co-solventes – e combinações selecionadas que solubilizado PP2 para posterior análise. Esta formulação de droga provou para ser eficaz como um veículo de entrega de drogas em cultura de células, bem como na vivo modelos usando administrações tanto intratraqueal e intravenosa. Da mesma forma, nosso trabalho focou a versatilidade de combinações de SAP-AA em múltiplas solubilizante, estruturalmente diferentes compostos hidrofóbicos em ambientes aquosos; especificamente, as drogas rottlerin e curcumina18. Este manuscrito descreve o método de formulação de SAP-AA e a análise de solubilidade de curcumina como exemplo da etapa principal no nosso pipeline de triagem. Este protocolo fornece uma maneira simples, pode ser reproduzida de tela para as combinações ideais de SAP-AA, que dissolvem qualquer determinado composto hidrofóbico.
Protocol
Representative Results
Discussion
O procedimento de formulação, existem várias etapas críticas e pontos a serem considerados na solução de problemas. Primeiro, como estamos trabalhando com vários componentes e concentrações, várias etapas de vórtice em todo o protocolo certifique-se de que todas as concentrações são uniforme e correto. Algumas das soluções de aminoácidos hidrofóbicos, de alta concentração podem ainda não estar completamente dissolvidas após a utilização do vortex, e neste caso, eles podem ser agitados vigorosament…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho é apoiado por institutos canadenses de pesquisa em saúde, operando concede MOP-42546 e MOP-119514.
Materials
| EAK16-I | CanPeptide Inc. | Custom peptide | Sequence: AEAKAEAKAEAKAEAK, N-terminus acetylation and C-terminus amidation, >95% pure by HPLC |
| EAK16-II | CanPeptide Inc. | Custom peptide | Sequence: AEAEAKAKAEAEAKAK, N-terminus acetylation and C-terminus amidation, >95% pure by HPLC |
| EAK16-IV | CanPeptide Inc. | Custom peptide | Sequence: AEAEAEAEAKAKAKAK, N-terminus acetylation and C-terminus amidation, >95% pure by HPLC |
| EFK8-II | CanPeptide Inc. | Custom peptide | Sequence: FEFEFKFK, N-terminus acetylation and C-terminus amidation, >95% pure by HPLC |
| A6KE | CanPeptide Inc. | Custom peptide | Sequence: AAAAAAKE, N-terminus acetylation and C-terminus amidation, >95% pure by HPLC |
| P6KE | CanPeptide Inc. | Custom peptide | Sequence: PPPPPPPKE, N-terminus acetylation and C-terminus amidation, >95% pure by HPLC |
| Alanine | Sigma-Aldrich | A7469-100G | L-Alanine |
| Isoleucine | Sigma-Aldrich | I7403-100G | L-Isoleucine |
| Leucine | Sigma-Aldrich | L8912-100G | L-Leucine |
| Methionine | Sigma-Aldrich | M5308-100G | L-Methionine |
| Proline | Sigma-Aldrich | P5607-100G | L-Proline |
| Valine | Sigma-Aldrich | V0513-100G | L-Valine |
| Phenylalanine | Sigma-Aldrich | P5482-100G | L-Phenylalanine |
| Tryptophan | Sigma-Aldrich | T8941-100G | L-Tryptophan |
| Tyrosine | Sigma-Aldrich | T8566-100G | L-Tyrosine |
| Glycine | Sigma-Aldrich | G8790-100G | L-Glycine |
| Asparagine | Sigma-Aldrich | A4159-100G | L-Asparagine |
| Glutamine | Sigma-Aldrich | G8540-100G | L-Glutamine |
| Serine | Sigma-Aldrich | A7219-100G | L-Serine |
| Threonine | Sigma-Aldrich | T8441-100G | L-Threonine |
| Histidine | Sigma-Aldrich | H6034-100G | L-Histidine |
| Lysine | Sigma-Aldrich | L5501-100G | L-Lysine |
| Arginine | Sigma-Aldrich | A8094-100G | L-Arginine |
| Aspartic Acid | Sigma-Aldrich | A7219-100G | L-Aspartic Acid |
| Glutamic Acid | Sigma-Aldrich | G8415-100G | L-Glutamic Acid |
| Cysteine | Sigma-Aldrich | C7352-100G | L-Cysteine |
| Dimethyl Sulfoxide | Sigma-Aldrich | D4540-500ML | DMSO |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | 277649-100ML | Anhydrous |
| Curcumin | Sigma-Aldrich | 08511-10MG | Hydrophobic drug, curcumin |
| Rottlerin | EMD Millipore | 557370-10MG | Hydrophobic drug, rottlerin |
| PP2 | Enzo | BML-EI297-0001 | Hydrophobic drug, PP2 |
| Scintillation Vials | VWR | 2650-66022-081 | Borosilicate Glass, with Screw Cap, 20 mL. Vials for weighing peptide. |
| Falcon 50 mL Conical Centrifugation Tubes | VWR | 352070 | Polypropylene, Sterile, 50 mL. For amino acid solutions. |
References
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