מסיסות של תרכובות הידרופוביות בתמיסה המימית באמצעות שילובים של הרכבה עצמית פפטיד ושל חומצות אמינו
Summary
פרוטוקול זה מתאר אמצעי ישים קלינית המסת תרכובות הידרופוביות סביבה מימית באמצעות שילובים של הרכבה עצמית פפטיד ופתרונות חומצת אמינו. השיטה שלנו פותר מגבלה עיקרית של הרפוי הידרופוביות, שחסרה אמצעי בטוחה ויעילה, המסיסות ושיטות משלוח לתוך הגדרות קליניים.
Abstract
פפטידים וההספק עצמית (לטמבלים) הם מבטיחים רכב למסירה של הרפוי הידרופובי ליישומים קליניים; תכונותיהם amphipathic מאפשרים להם להתמוסס תרכובות הידרופוביות בסביבה מימית של הגוף האנושי. עם זאת, פתרונות פפטיד וההספק עצמית יש תאימות דם לקויה (למשל, osmolarity נמוך), הפרעה היישום הקליני שלהם באמצעות מינהלות תוך ורידי. לאחרונה פיתחנו פלטפורמה מוכללת עבור משלוח סמים הידרופוביות, המשלב לטמבלים עם חומצת אמינו פתרונות (SAP-AA) כדי לשפר את מסיסות סמים ולהגביר ניסוח osmolarity להשיג את הדרישות עבור שימושים קליניים. אסטרטגיה זו ניסוח נבחנה ביסודיות בהקשר של שלוש תרכובות הידרופוביות שונות מבנית – PP2, rottlerin, ו כורכומין – כדי להדגים צדדיות שלה. יתר על כן, נבחנו ההשפעות של שינוי ניסוח מרכיבים על-ידי ניתוח לטמבלים שונים 6, 20 חומצות אמינו הקיימת באופן טבעי בריכוזים נמוכים וגבוהים, ואת שני ממיסים שיתוף שונים דימתיל סולפוקסיד (דימתיל סולפוקסיד) אתנול. האסטרטגיה שלנו הוכיח כיעיל אופטימיזציה של רכיבים עבור סמים הידרופובי נתון ו פונקציה טיפולית של המדכא ניסח, PP2, נצפתה גם בתוך vitro וגם ויוו. כתב יד זה מתאר שיטת ניסוח מוכללת שלנו באמצעות שילובים SAP-AA עבור תרכובות הידרופוביות, וניתוח של מסיסות כצעד ראשון לקראת להשתמש הפוטנציאל של ניסוחים אלה במחקרים יותר פונקציונלי. אנו כוללים נציג מסיסות תוצאות ניסוח הכורכומין במתחם, הידרופובי, ולדון כמה המתודולוגיה שלנו משמש כפלטפורמה עבור מחקרים ביולוגיים עתידיים ומודלים המחלה.
Introduction
אידיוטים הם סוג של biomaterials זה נחקרו בהרחבה ככל פיגומים 3D רפואה רגנרטיבית1,2,3,4. לאחרונה אולם הם נוצלה כמו כלי רכב למסירה של הרפוי עקב שלהם תכונות ביולוגיות ייחודיות5,6,7,8. לטמבלים להרכיב באופן טבעי לתוך nanostructures יציב9, ובכך לספק אמצעי סמים עיטוף והגנה. אידיוטים הם amphipathic, המורכב דפוס מסוים של חומצת אמינו הידרופוביות, הידרופילית חזרה, הנהיגה שלהם הרכבה עצמית9,10 ומאפשר להם לשרת כמדיום בין הידרופובי הידרופילית סביבות. כתוצאה מכך, למסירה קליניים של תרופות הידרופוביות – אשר יש הזמינות הביולוגית נמוכה ביותר וספיגה בגוף עקב חוסר מסיסות סביבות מימית11,12 – לטמבלים מבטיחים כמו משלוח הרכב. יתר על כן, דפוס רצף שלהם מרמז גם כי לטמבלים יכול להיות רציונלי מעוצבים ומתוכננים להגדיל את התאימות עם כל תרופה מסוימת או מורכבים (כלומר, בהתבסס על קבוצות פונקציונליות) ולסייע נוסף מסיסות.
לטמבלים הוחלו כמו רכב משלוח סמים רבים במבחנה ועוד ויוו הגדרות13,14,15,16. הם גם הראו הביו ובטיחות נהדר. עם זאת, בשל osmolarity נמוכה של תכשירים תרופתיים SAP, הם אינם יכולים לשמש עבור זריקות תוך ורידי כמו הגדרות קליניים13. בהתחשב באיפוק זה, פיתחנו לאחרונה אסטרטגיה המשלבת לטמבלים עם חומצת אמינו פתרונות על מנת לצמצם את השימוש ממיסים שיתוף רעילים ולהגדיל את ניסוח osmolarity, ולכן, הרלוונטיות הקלינית. אנחנו בחרה להשתמש חומצות אמינו כפי שהן אבני הבניין של אידיוטים, הן כבר מקובלים מבחינה רפואית, בשילוב עם אידיוטים, הם מגבירים סמים הידרופובי מסיסות תוך הפחתת כמות SAP חובה17,18.
כבר בחנו מקרוב את SAP-AA שילובים כפלטפורמה כללית סמים הידרופובי מסיסות ואספקה הבאים על ידי יצירת צינור רב שלבי סינון, החלתו על החומר המדכא Src, PP2, כמו תרכובת הידרופובי מודל. בתהליך זה, בדקנו את האפקט של שינוי הרכיבים של ניסוח – בסופו של דבר בדיקות 6 לטמבלים שונים, כל 20 חומצות האמינו בריכוזים שונים 2 (נמוך ולא גבוה; נמוך מבוסס על ריכוזים ב קיימים יישומים קליניים, וגבוה ריכוזי היו 2 x, 3 x או 5 x ריכוז קלינית המבוסס על המסיסות המרבי לכל חומצה אמינית במים), 2 ממיסים שיתוף שונים – ואת השילובים שנבחרו solubilized PP2 לצורך ניתוח נוסף. זה ניסוח הסמים הוכיח כיעיל כרכב משלוח סמים תרבית תאים, כמו גם ב- vivo מודלים המשתמשים הממשלים הן intratracheal והן תוך ורידית. כמו כן, העבודה שלנו נגע על צדדיות של SAP-AA צירופי מרובה solubilizing, תרכובות הידרופוביות שונות מבנית בסביבה מימית; באופן ספציפי, תרופות rottlerin, כורכומין18. כתב יד זה מתאר את שיטת ניסוח SAP-AA וניתוח של כורכומין מסיסות כדוגמה הצעד העיקרי בצבר ההקרנה שלנו. פרוטוקול זה מספק דרך פשוטה לשחזור למסך השילובים SAP-AA אופטימלית, אשר להמיס כל המתחם הידרופובי נתון.
Protocol
Representative Results
Discussion
בהליך ניסוח, ישנם שלבים קריטיים ונקודות שונות לשקול בפתרון. ראשית, כפי שאנחנו עובדים עם רכיבים שונים ריכוזים, מרובי שלבים מערבולת לאורך כל הפרוטוקול להבטיח כי כל ריכוזי אחידה ונכונה. חלק מהפתרונות חומצת אמינו הידרופוביות, ריכוז גבוה עשוי עדיין לא להיות התפרקה לחלוטין לאחר vortexing, במקרה זה, ?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכת על ידי מוסדות הקנדי למחקר בריאות, הפועלים מעניק מגב-42546 ומגב-119514.
Materials
| EAK16-I | CanPeptide Inc. | Custom peptide | Sequence: AEAKAEAKAEAKAEAK, N-terminus acetylation and C-terminus amidation, >95% pure by HPLC |
| EAK16-II | CanPeptide Inc. | Custom peptide | Sequence: AEAEAKAKAEAEAKAK, N-terminus acetylation and C-terminus amidation, >95% pure by HPLC |
| EAK16-IV | CanPeptide Inc. | Custom peptide | Sequence: AEAEAEAEAKAKAKAK, N-terminus acetylation and C-terminus amidation, >95% pure by HPLC |
| EFK8-II | CanPeptide Inc. | Custom peptide | Sequence: FEFEFKFK, N-terminus acetylation and C-terminus amidation, >95% pure by HPLC |
| A6KE | CanPeptide Inc. | Custom peptide | Sequence: AAAAAAKE, N-terminus acetylation and C-terminus amidation, >95% pure by HPLC |
| P6KE | CanPeptide Inc. | Custom peptide | Sequence: PPPPPPPKE, N-terminus acetylation and C-terminus amidation, >95% pure by HPLC |
| Alanine | Sigma-Aldrich | A7469-100G | L-Alanine |
| Isoleucine | Sigma-Aldrich | I7403-100G | L-Isoleucine |
| Leucine | Sigma-Aldrich | L8912-100G | L-Leucine |
| Methionine | Sigma-Aldrich | M5308-100G | L-Methionine |
| Proline | Sigma-Aldrich | P5607-100G | L-Proline |
| Valine | Sigma-Aldrich | V0513-100G | L-Valine |
| Phenylalanine | Sigma-Aldrich | P5482-100G | L-Phenylalanine |
| Tryptophan | Sigma-Aldrich | T8941-100G | L-Tryptophan |
| Tyrosine | Sigma-Aldrich | T8566-100G | L-Tyrosine |
| Glycine | Sigma-Aldrich | G8790-100G | L-Glycine |
| Asparagine | Sigma-Aldrich | A4159-100G | L-Asparagine |
| Glutamine | Sigma-Aldrich | G8540-100G | L-Glutamine |
| Serine | Sigma-Aldrich | A7219-100G | L-Serine |
| Threonine | Sigma-Aldrich | T8441-100G | L-Threonine |
| Histidine | Sigma-Aldrich | H6034-100G | L-Histidine |
| Lysine | Sigma-Aldrich | L5501-100G | L-Lysine |
| Arginine | Sigma-Aldrich | A8094-100G | L-Arginine |
| Aspartic Acid | Sigma-Aldrich | A7219-100G | L-Aspartic Acid |
| Glutamic Acid | Sigma-Aldrich | G8415-100G | L-Glutamic Acid |
| Cysteine | Sigma-Aldrich | C7352-100G | L-Cysteine |
| Dimethyl Sulfoxide | Sigma-Aldrich | D4540-500ML | DMSO |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | 277649-100ML | Anhydrous |
| Curcumin | Sigma-Aldrich | 08511-10MG | Hydrophobic drug, curcumin |
| Rottlerin | EMD Millipore | 557370-10MG | Hydrophobic drug, rottlerin |
| PP2 | Enzo | BML-EI297-0001 | Hydrophobic drug, PP2 |
| Scintillation Vials | VWR | 2650-66022-081 | Borosilicate Glass, with Screw Cap, 20 mL. Vials for weighing peptide. |
| Falcon 50 mL Conical Centrifugation Tubes | VWR | 352070 | Polypropylene, Sterile, 50 mL. For amino acid solutions. |
References
- Holmes, T. C., de Lacalle, S., Su, X., Liu, G., Rich, A., Zhang, S. Extensive neurite outgrowth and active synapse formation on self-assembling peptide scaffolds. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 97 (12), 6728-6733 (2000).
- Davis, M. E., Motion, J. P. M., et al. Injectable self-assembling peptide nanofibers create intramyocardial microenvironments for endothelial cells. Circulation. 111 (4), 442-450 (2005).
- Matson, J. B., Stupp, S. I. Self-assembling peptide scaffolds for regenerative medicine. Chem. Commun. 48 (1), 26-33 (2012).
- Tatman, P. D., Muhonen, E. G., Wickers, S. T., Gee, A. O., Kim, E., Kim, D. Self-assembling peptides for stem cell and tissue engineering. Biomater. Sci. 4 (4), 543-554 (2016).
- Keyes-Baig, C., Duhamel, J., Fung, S. -. Y., Bezaire, J., Chen, P. Self-assembling peptide as a potential carrier of hydrophobic compounds. J. Am. Chem. Soc. 126 (24), 7522-7532 (2004).
- Kumar, P., Pillay, V., Modi, G., Choonara, Y. E., du Toit, L. C., Naidoo, D. Self-assembling peptides: implications for patenting in drug delivery and tissue engineering. Recent Pat. Drug Deliv. Formul. 5 (1), 24-51 (2011).
- Wang, H., Yang, Z. Short-peptide-based molecular hydrogels: novel gelation strategies and applications for tissue engineering and drug delivery. Nanoscale. 4, 5259-5267 (2012).
- French, K. M., Somasuntharam, I., Davis, M. E. Self-assembling peptide-based delivery of therapeutics for myocardial infarction. Adv. Drug Deliv. Rev. 96, 40-53 (2016).
- Zhang, S., Holmes, T., Lockshin, C., Rich, A. Spontaneous assembly of a self-complementary oligopeptide to form a stable macroscopic membrane. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 90 (8), 3334-3338 (1993).
- Bowerman, C. J., Nilsson, B. L. Self-assembly of amphipathic β-sheet peptides: insights and applications. Biopolymers. 98 (3), 169-184 (2012).
- Amidon, G., Lennernäs, H., Shah, V., Crison, J. A theoretical basis for a biopharmaceutic drug classification: the correlation of in vitro drug product dissolution and in vivo bioavailability. Pharm. Res. 12 (3), 413-420 (1995).
- Shi, Y., Porter, W., Merdan, T., Li, L. C. Recent advances in intravenous delivery of poorly water-soluble compounds. Expert Opin. Drug Deliv. 6 (12), 1261-1282 (2009).
- Bawa, R., Fung, S. -. Y., et al. Self-assembling peptide-based nanoparticles enhance cellular delivery of the hydrophobic anticancer drug ellipticine through caveolae-dependent endocytosis. Nanomedicine. 8 (5), 647-654 (2012).
- Liu, J., Zhang, L., Yang, Z., Zhao, X. Controlled release of paclitaxel from a self-assembling peptide hydrogel formed in situ and antitumor study in vitro. Int. J. Nanomed. 6, 2143-2153 (2011).
- Wu, Y., Sadatmousavi, P., Wang, R., Lu, S., Yuan, Y., Chen, P. Self-assembling peptide-based nanoparticles enhance anticancer effect of ellipticine in vitro and in vivo. Int. J. Nanomed. 7, 3221-3233 (2012).
- Fung, S. Y., Yang, H., et al. Self-Assembling Peptide as a Potential Carrier for Hydrophobic Anticancer Drug Ellipticine: Complexation, Release and In Vitro Delivery. Adv. Funct. Mater. 19 (1), 74-83 (2009).
- Fung, S. -. Y., Oyaizu, T., et al. The potential of nanoscale combinations of self-assembling peptides and amino acids of the Src tyrosine kinase inhibitor in acute lung injury therapy. Biomaterials. 32 (16), 4000-4008 (2011).
- Pacheco, S., Kanou, T., et al. Formulation of hydrophobic therapeutics with self-assembling peptide and amino acid: A new platform for intravenous drug delivery. J. Control. Release. 239, 211-222 (2016).
