Solubilité des composés hydrophobes en Solution aqueuse à l’aide de combinaisons d’auto-assemblage, peptides et acides aminés
Summary
Ce protocole décrit un moyen cliniquement-il y a lieu de dissoudre des composés hydrophobes en milieu aqueux, à l’aide de combinaisons d’auto-assemblage solutions peptides et acides aminés. Notre méthode résout une limitation majeure de la thérapeutique hydrophobe, qui n’ont pas un moyen sûr et efficace des méthodes de solubilité et de la livraison en milieu clinique.
Abstract
Auto-assemblage peptides (SAPs) sont prometteurs de véhicules pour la livraison de médicaments hydrophobes pour applications cliniques ; leurs propriétés amphipathiques leur permettent de dissoudre les composés hydrophobes dans le milieu aqueux du corps humain. Cependant, les solutions de peptide auto-assemblage ont compatibilité sanguine pauvres (p. ex., faible osmolarité), qui entravent leur application clinique par l’intermédiaire des administrations par voie intraveineuse. Nous avons récemment développé une plate-forme généralisée pour la délivrance de médicaments hydrophobes, qui combine les programmes d’ajustement structurel avec des solutions acides aminés (SAP-AA) à améliorer la solubilité de la drogue et augmentent l’osmolarité de formulation pour atteindre les conditions d’utilisations cliniques. Cette stratégie de formulation a été testée dans le cadre de trois composés hydrophobes structurellement différents – PP2, le rottlerin et curcumine – afin de démontrer sa polyvalence. En outre, nous avons examiné les effets de la modification des composants de la formulation en analysant les 6 différents programmes d’ajustement structurel, 20 acides aminés naturellement existants à des concentrations faibles et élevées et deux différents co-solvants diméthylsulfoxyde (DMSO) et l’éthanol. Notre stratégie se sont révélé efficaces dans l’optimisation des composants pour un médicament hydrophobe et la fonction thérapeutique de l’inhibiteur formulé, PP2, a été observée in vitro et in vivo. Ce manuscrit décrit notre méthode de formulation généralisée à l’aide de combinaisons de SAP-AA composés hydrophobes et l’analyse de la solubilité comme une première étape vers l’utilisation potentielle de ces formulations dans les études plus fonctionnelles. Nous inclure les résultats de solubilité représentatif pour la formulation de la curcumine composée hydrophobe et discutons comment notre méthodologie sert de plate-forme pour les futures études biologiques et les modèles de maladies.
Introduction
Programmes d’ajustement structurel sont une classe des biomatériaux qui ont été étudiés intensivement comme 3D échafaudages en médecine régénérative1,2,3,4. Plus récemment cependant, elles ont été exploitées comme vecteurs d’agents thérapeutiques en raison de leurs propriétés biologiques uniques5,6,7,8. Programmes d’ajustement structurel assemblent naturellement dans des nanostructures stable9, fournissant ainsi un moyen d’encapsulation de la drogue et de la protection. Programmes d’ajustement structurel sont amphipathiques, composé d’un modèle spécifique de répétitions d’acides aminés hydrophobes et hydrophiles, conduisant leur auto-assemblage9,10 et ce qui leur permet de servir comme un milieu entre hydrophobes et hydrophiles environnements. Par conséquent, pour la livraison clinique des médicaments hydrophobes – qui ont extrêmement faible biodisponibilité et absorption dans l’organisme faute de solubilité dans un environnement aqueux11,12 – programmes d’ajustement structurel sont prometteurs comme une livraison véhicule. En outre, leur modèle de séquence implique également que programmes d’ajustement structurel peuvent être rationnellement conçus et fabriqués pour maximiser la compatibilité avec n’importe quel médicament ou composé (c.-à-d., issu des groupes fonctionnels) et aider davantage la solubilité.
Programmes d’ajustement structurel ont été utilisés comme véhicules de livraison de médicament efficace dans de nombreux in vitro et in vivo paramètres13,14,15,16. Ils ont également montré de biocompatibilité et grande sécurité. Toutefois, en raison de la faible osmolarité des préparations de SAP et les médicaments, ils ne peuvent servir pour des injections intraveineuses comme dans les milieux cliniques13. Compte tenu de cette contrainte, nous avons récemment mis au point une stratégie qui combine les programmes d’ajustement structurel avec des solutions acides aminés afin de réduire l’utilisation de solvants toxiques de co et augmentent l’osmolarité de la formulation et par conséquent, pertinence clinique. Nous avons choisi d’utiliser des acides aminés car ils constituent le fondement des programmes d’ajustement structurel, sont déjà reconnus sur le plan clinique, et en combinaison avec les programmes d’ajustement structurel, ils augmentent la solubilité de médicament hydrophobe tout en réduisant la quantité de sève nécessaire17,18.
Nous avons scruté les combinaisons de SAP-AA comme plate-forme généralisée pour la solubilité de médicament hydrophobe et sa fourniture ultérieur en créant un pipeline de dépistage multi-étapes et en appliquant à l’inhibiteur de la Src, PP2, comme un composé hydrophobe de modèle. Dans ce processus, nous avons examiné l’effet de la modification des composants de la formulation – essai en fin de compte 6 différents programmes d’ajustement structurel, tous les 20 acides aminés à 2 concentrations différentes (bas et haut ; faible basées sur les concentrations dans les applications cliniques existantes et de haute les concentrations étaient x 2, x 3 ou x 5 la concentration clinique basée sur la solubilité maximale de chaque acide aminé dans l’eau) et 2 co-solvants différentes – et combinaisons sélectionnées qui solubilisent PP2 pour une analyse ultérieure. Cette formulation du médicament s’est avéré efficace comme un véhicule de livraison de drogue en culture cellulaire, ainsi que dans vivo modèles à l’aide d’administration intratrachéale tant par voie intraveineuse. De même, notre travail a touché sur la polyvalence des combinaisons de SAP-AA dans plusieurs solubilisants, structurellement différents composés hydrophobes dans un environnement aqueux ; plus précisément, la drogue le rottlerin et curcumine18. Ce manuscrit présente la méthode de formulation de SAP-AA et analyse de la solubilité de la curcumine à titre d’exemple de l’étape primaire dans notre pipeline de dépistage. Ce protocole fournit une manière simple et reproductible à l’écran pour les combinaisons de SAP-AA optimales, qui dissoudra tout composé hydrophobe donnée.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dans la procédure de formulation, il y a différentes étapes critiques et des points à considérer en dépannage. Tout d’abord, comme nous travaillons avec différents composants et les concentrations, plusieurs étapes de vortex dans tout le protocole s’assurer que toutes les concentrations sont uniforme et correcte. Certaines des solutions acides aminés de haute concentration, hydrophobe peuvent toujours pas complètement dissoute après utilisation du vortex, et dans ce cas, ils peuvent être secoués vigoureu…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail est soutenu par les instituts de recherche en santé du Canada, subventions de fonctionnement MOP-42546 et MOP-119514.
Materials
| EAK16-I | CanPeptide Inc. | Custom peptide | Sequence: AEAKAEAKAEAKAEAK, N-terminus acetylation and C-terminus amidation, >95% pure by HPLC |
| EAK16-II | CanPeptide Inc. | Custom peptide | Sequence: AEAEAKAKAEAEAKAK, N-terminus acetylation and C-terminus amidation, >95% pure by HPLC |
| EAK16-IV | CanPeptide Inc. | Custom peptide | Sequence: AEAEAEAEAKAKAKAK, N-terminus acetylation and C-terminus amidation, >95% pure by HPLC |
| EFK8-II | CanPeptide Inc. | Custom peptide | Sequence: FEFEFKFK, N-terminus acetylation and C-terminus amidation, >95% pure by HPLC |
| A6KE | CanPeptide Inc. | Custom peptide | Sequence: AAAAAAKE, N-terminus acetylation and C-terminus amidation, >95% pure by HPLC |
| P6KE | CanPeptide Inc. | Custom peptide | Sequence: PPPPPPPKE, N-terminus acetylation and C-terminus amidation, >95% pure by HPLC |
| Alanine | Sigma-Aldrich | A7469-100G | L-Alanine |
| Isoleucine | Sigma-Aldrich | I7403-100G | L-Isoleucine |
| Leucine | Sigma-Aldrich | L8912-100G | L-Leucine |
| Methionine | Sigma-Aldrich | M5308-100G | L-Methionine |
| Proline | Sigma-Aldrich | P5607-100G | L-Proline |
| Valine | Sigma-Aldrich | V0513-100G | L-Valine |
| Phenylalanine | Sigma-Aldrich | P5482-100G | L-Phenylalanine |
| Tryptophan | Sigma-Aldrich | T8941-100G | L-Tryptophan |
| Tyrosine | Sigma-Aldrich | T8566-100G | L-Tyrosine |
| Glycine | Sigma-Aldrich | G8790-100G | L-Glycine |
| Asparagine | Sigma-Aldrich | A4159-100G | L-Asparagine |
| Glutamine | Sigma-Aldrich | G8540-100G | L-Glutamine |
| Serine | Sigma-Aldrich | A7219-100G | L-Serine |
| Threonine | Sigma-Aldrich | T8441-100G | L-Threonine |
| Histidine | Sigma-Aldrich | H6034-100G | L-Histidine |
| Lysine | Sigma-Aldrich | L5501-100G | L-Lysine |
| Arginine | Sigma-Aldrich | A8094-100G | L-Arginine |
| Aspartic Acid | Sigma-Aldrich | A7219-100G | L-Aspartic Acid |
| Glutamic Acid | Sigma-Aldrich | G8415-100G | L-Glutamic Acid |
| Cysteine | Sigma-Aldrich | C7352-100G | L-Cysteine |
| Dimethyl Sulfoxide | Sigma-Aldrich | D4540-500ML | DMSO |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | 277649-100ML | Anhydrous |
| Curcumin | Sigma-Aldrich | 08511-10MG | Hydrophobic drug, curcumin |
| Rottlerin | EMD Millipore | 557370-10MG | Hydrophobic drug, rottlerin |
| PP2 | Enzo | BML-EI297-0001 | Hydrophobic drug, PP2 |
| Scintillation Vials | VWR | 2650-66022-081 | Borosilicate Glass, with Screw Cap, 20 mL. Vials for weighing peptide. |
| Falcon 50 mL Conical Centrifugation Tubes | VWR | 352070 | Polypropylene, Sterile, 50 mL. For amino acid solutions. |
References
- Holmes, T. C., de Lacalle, S., Su, X., Liu, G., Rich, A., Zhang, S. Extensive neurite outgrowth and active synapse formation on self-assembling peptide scaffolds. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 97 (12), 6728-6733 (2000).
- Davis, M. E., Motion, J. P. M., et al. Injectable self-assembling peptide nanofibers create intramyocardial microenvironments for endothelial cells. Circulation. 111 (4), 442-450 (2005).
- Matson, J. B., Stupp, S. I. Self-assembling peptide scaffolds for regenerative medicine. Chem. Commun. 48 (1), 26-33 (2012).
- Tatman, P. D., Muhonen, E. G., Wickers, S. T., Gee, A. O., Kim, E., Kim, D. Self-assembling peptides for stem cell and tissue engineering. Biomater. Sci. 4 (4), 543-554 (2016).
- Keyes-Baig, C., Duhamel, J., Fung, S. -. Y., Bezaire, J., Chen, P. Self-assembling peptide as a potential carrier of hydrophobic compounds. J. Am. Chem. Soc. 126 (24), 7522-7532 (2004).
- Kumar, P., Pillay, V., Modi, G., Choonara, Y. E., du Toit, L. C., Naidoo, D. Self-assembling peptides: implications for patenting in drug delivery and tissue engineering. Recent Pat. Drug Deliv. Formul. 5 (1), 24-51 (2011).
- Wang, H., Yang, Z. Short-peptide-based molecular hydrogels: novel gelation strategies and applications for tissue engineering and drug delivery. Nanoscale. 4, 5259-5267 (2012).
- French, K. M., Somasuntharam, I., Davis, M. E. Self-assembling peptide-based delivery of therapeutics for myocardial infarction. Adv. Drug Deliv. Rev. 96, 40-53 (2016).
- Zhang, S., Holmes, T., Lockshin, C., Rich, A. Spontaneous assembly of a self-complementary oligopeptide to form a stable macroscopic membrane. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 90 (8), 3334-3338 (1993).
- Bowerman, C. J., Nilsson, B. L. Self-assembly of amphipathic β-sheet peptides: insights and applications. Biopolymers. 98 (3), 169-184 (2012).
- Amidon, G., Lennernäs, H., Shah, V., Crison, J. A theoretical basis for a biopharmaceutic drug classification: the correlation of in vitro drug product dissolution and in vivo bioavailability. Pharm. Res. 12 (3), 413-420 (1995).
- Shi, Y., Porter, W., Merdan, T., Li, L. C. Recent advances in intravenous delivery of poorly water-soluble compounds. Expert Opin. Drug Deliv. 6 (12), 1261-1282 (2009).
- Bawa, R., Fung, S. -. Y., et al. Self-assembling peptide-based nanoparticles enhance cellular delivery of the hydrophobic anticancer drug ellipticine through caveolae-dependent endocytosis. Nanomedicine. 8 (5), 647-654 (2012).
- Liu, J., Zhang, L., Yang, Z., Zhao, X. Controlled release of paclitaxel from a self-assembling peptide hydrogel formed in situ and antitumor study in vitro. Int. J. Nanomed. 6, 2143-2153 (2011).
- Wu, Y., Sadatmousavi, P., Wang, R., Lu, S., Yuan, Y., Chen, P. Self-assembling peptide-based nanoparticles enhance anticancer effect of ellipticine in vitro and in vivo. Int. J. Nanomed. 7, 3221-3233 (2012).
- Fung, S. Y., Yang, H., et al. Self-Assembling Peptide as a Potential Carrier for Hydrophobic Anticancer Drug Ellipticine: Complexation, Release and In Vitro Delivery. Adv. Funct. Mater. 19 (1), 74-83 (2009).
- Fung, S. -. Y., Oyaizu, T., et al. The potential of nanoscale combinations of self-assembling peptides and amino acids of the Src tyrosine kinase inhibitor in acute lung injury therapy. Biomaterials. 32 (16), 4000-4008 (2011).
- Pacheco, S., Kanou, T., et al. Formulation of hydrophobic therapeutics with self-assembling peptide and amino acid: A new platform for intravenous drug delivery. J. Control. Release. 239, 211-222 (2016).
