Solubilidad de compuestos hidrófobos en la solución acuosa mediante combinaciones de uno mismo-montaje de péptidos y aminoácidos
Summary
Este protocolo describe un medio clínicamente aplicable de disolver compuestos hidrofóbicos en un ambiente acuoso utilizando combinaciones de uno mismo-montaje de soluciones de péptidos y aminoácidos. Nuestro método tiene una limitación importante de la terapéutica hidrofóbica, que carecen de seguro y eficiente medio de solubilidad y entrega de métodos en contextos clínicos.
Abstract
Uno mismo-montaje péptidos (SAPs) son prometedores vehículos para la entrega de tratamientos hidrófobos para aplicaciones clínicas; sus propiedades anfipáticos que puedan disolver compuestos hidrofóbicos en el ambiente acuoso del cuerpo humano. Sin embargo, soluciones de peptide uno mismo-montaje tienen compatibilidad sanguínea deficiente (p. ej., baja osmolaridad), lo que dificulta su aplicación clínica a través de administración intravenosa. Recientemente hemos desarrollado una plataforma generalizada para la entrega de drogas hidrofóbicas, que combina programas de ajuste estructural con soluciones de aminoácidos (SAP-AA) para mejorar la solubilidad de la droga y aumentar la osmolaridad de la fórmula para alcanzar los requerimientos para aplicaciones clínicas. Esta estrategia de formulación fue probada a fondo en el contexto de tres compuestos hidrofóbicos estructuralmente diferentes: PP2 rottlerin y curcumina – para demostrar su versatilidad. Además, se analizaron efectos de cambiar componentes de la formulación mediante el análisis de 6 diferentes programas de ajuste estructural, 20 aminoácidos existentes naturalmente en concentraciones bajas y altas y dos diversos solventes Co dimetil sulfóxido (DMSO) y etanol. Nuestra estrategia demostrado para ser efectiva en la optimización de componentes para un determinado fármaco hidrofóbico y función terapéutica del inhibidor formulado, PP2, fue observado tanto in vitro como in vivo. Este manuscrito describe nuestro método de formulación generalizada utilizando SAP AA combinaciones de compuestos hidrofóbicos y análisis de solubilidad como un primer paso hacia el posible uso de estas formulaciones en estudios más funcionales. Incluyen los resultados de solubilidad representativas para la formulación de la curcumina compuesta hidrofóbica y discutir cómo nuestra metodología sirve como una plataforma para futuros estudios biológicos y modelos de la enfermedad.
Introduction
Programas de ajuste estructural son una clase de biomateriales que han sido estudiados extensivamente como andamios 3D en medicina regenerativa1,2,3,4. Más recientemente sin embargo, ellos han sido explotados como vehículos para la entrega de la terapéutica debido a sus propiedades biológicas únicas5,6,7,8. Programas de ajuste estructural naturalmente montan en nanoestructuras estable9, proporcionando así un medio de encapsulación del fármaco y la protección. Programas de ajuste estructural son anfipáticos, conformada por un patrón específico de repeticiones del aminoácido hidrofóbico e hidrofílico, conducir su uno mismo-Asamblea de9,10 y lo que les permite servir como un medio entre hidrofóbico e hidrofílico ambientes. En consecuencia, para la administración clínica de drogas hidrofóbicas, que tienen muy baja biodisponibilidad y absorción en el cuerpo debido a la falta de solubilidad en ambientes acuosos11,12 – SAPs son prometedores como una entrega vehículo. Además, su patrón de secuencia implica que SAPs pueden racionalmente diseñados y desarrollados para maximizar la compatibilidad con cualquier fármaco dado o compuesto (es decir, basadas en grupos funcionales) y además ayudar a la solubilidad.
Programas de ajuste estructural se han aplicado como vehículos de entrega de drogas eficaces en muchos in vitro e in vivo configuración13,14,15,16. También han mostrado gran seguridad y biocompatibilidad. Sin embargo, debido a la baja osmolaridad de preparaciones SAP de la droga, no puede utilizarse para inyecciones intravenosas como en ajustes clínicos13. Teniendo en cuenta esta restricción, recientemente hemos desarrollado una estrategia que combina programas de ajuste estructural con soluciones de aminoácidos con el fin de reducir el uso de solventes tóxicos Co y aumentar la osmolaridad de la formulación y por lo tanto, relevancia clínica. Se decidió utilizar los aminoácidos como son los bloques de edificio del SAPs, ya son clínicamente aceptados, y en combinación con programas de ajuste estructural, que aumentan la solubilidad de la droga hidrofóbica mientras que reduce la cantidad de SAP17,18.
Hemos escudriñado combinaciones AA SAP como plataforma generalizada de solubilidad de la droga hidrofóbica y posterior entrega crear una tubería de la proyección de múltiples pasos y aplicando a inhibidor de la fuente, PP2, como un compuesto hidrofóbico modelo. En este proceso, se examinó el efecto de cambiar componentes de la formulación, en última instancia prueba 6 diferentes programas de ajuste estructural, todos los 20 aminoácidos en 2 concentraciones diferentes (bajo y alto; bajo basados en concentraciones en aplicaciones clínicas existentes y de alta las concentraciones fueron x 2, x 3 o x 5 la concentración clínica se basa en la solubilidad máxima de cada aminoácido en el agua) y 2 diferentes solventes Co – y las combinaciones que solubilizados PP2 para su posterior análisis. Esta formulación de la droga demostró para ser eficaz como un vehículo de entrega de droga en cultivo celular, así como en vivo modelos utilizando administración intratraqueal e intravenosa. Además, nuestro trabajo se refirió a la versatilidad de combinaciones de SAP-AA en múltiples solubilizantes, estructuralmente diferentes compuestos hidrofóbicos en ambientes acuosos; específicamente, los medicamentos rottlerin y curcumina18. Este manuscrito describe el método de formulación SAP-AA y el análisis de solubilidad de la curcumina como ejemplo de la etapa primaria en nuestros proyectos de investigación. Este protocolo proporciona una forma simple y reproducible a la pantalla de las óptimas combinaciones de SAP-AA, que disuelven cualquier compuesto hidrofóbico dado.
Protocol
Representative Results
Discussion
En el procedimiento de formulación, hay varios pasos críticos y puntos a considerar en la solución de problemas. En primer lugar, como estamos trabajando con diversos componentes y las concentraciones, varios pasos de vórtice a través del protocolo que sean todas las concentraciones de uniforme y correcta. Algunas de las soluciones de alta concentración, hidrofóbico aminoácido pueden todavía no ser disuelto totalmente después de Vortex, y en este caso, pueden ser sacudidos vigorosamente a mano para ayudar en el…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo es apoyado por los institutos canadienses de investigación en salud, de funcionamiento otorga 42546 fregona y mopa-119514.
Materials
| EAK16-I | CanPeptide Inc. | Custom peptide | Sequence: AEAKAEAKAEAKAEAK, N-terminus acetylation and C-terminus amidation, >95% pure by HPLC |
| EAK16-II | CanPeptide Inc. | Custom peptide | Sequence: AEAEAKAKAEAEAKAK, N-terminus acetylation and C-terminus amidation, >95% pure by HPLC |
| EAK16-IV | CanPeptide Inc. | Custom peptide | Sequence: AEAEAEAEAKAKAKAK, N-terminus acetylation and C-terminus amidation, >95% pure by HPLC |
| EFK8-II | CanPeptide Inc. | Custom peptide | Sequence: FEFEFKFK, N-terminus acetylation and C-terminus amidation, >95% pure by HPLC |
| A6KE | CanPeptide Inc. | Custom peptide | Sequence: AAAAAAKE, N-terminus acetylation and C-terminus amidation, >95% pure by HPLC |
| P6KE | CanPeptide Inc. | Custom peptide | Sequence: PPPPPPPKE, N-terminus acetylation and C-terminus amidation, >95% pure by HPLC |
| Alanine | Sigma-Aldrich | A7469-100G | L-Alanine |
| Isoleucine | Sigma-Aldrich | I7403-100G | L-Isoleucine |
| Leucine | Sigma-Aldrich | L8912-100G | L-Leucine |
| Methionine | Sigma-Aldrich | M5308-100G | L-Methionine |
| Proline | Sigma-Aldrich | P5607-100G | L-Proline |
| Valine | Sigma-Aldrich | V0513-100G | L-Valine |
| Phenylalanine | Sigma-Aldrich | P5482-100G | L-Phenylalanine |
| Tryptophan | Sigma-Aldrich | T8941-100G | L-Tryptophan |
| Tyrosine | Sigma-Aldrich | T8566-100G | L-Tyrosine |
| Glycine | Sigma-Aldrich | G8790-100G | L-Glycine |
| Asparagine | Sigma-Aldrich | A4159-100G | L-Asparagine |
| Glutamine | Sigma-Aldrich | G8540-100G | L-Glutamine |
| Serine | Sigma-Aldrich | A7219-100G | L-Serine |
| Threonine | Sigma-Aldrich | T8441-100G | L-Threonine |
| Histidine | Sigma-Aldrich | H6034-100G | L-Histidine |
| Lysine | Sigma-Aldrich | L5501-100G | L-Lysine |
| Arginine | Sigma-Aldrich | A8094-100G | L-Arginine |
| Aspartic Acid | Sigma-Aldrich | A7219-100G | L-Aspartic Acid |
| Glutamic Acid | Sigma-Aldrich | G8415-100G | L-Glutamic Acid |
| Cysteine | Sigma-Aldrich | C7352-100G | L-Cysteine |
| Dimethyl Sulfoxide | Sigma-Aldrich | D4540-500ML | DMSO |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | 277649-100ML | Anhydrous |
| Curcumin | Sigma-Aldrich | 08511-10MG | Hydrophobic drug, curcumin |
| Rottlerin | EMD Millipore | 557370-10MG | Hydrophobic drug, rottlerin |
| PP2 | Enzo | BML-EI297-0001 | Hydrophobic drug, PP2 |
| Scintillation Vials | VWR | 2650-66022-081 | Borosilicate Glass, with Screw Cap, 20 mL. Vials for weighing peptide. |
| Falcon 50 mL Conical Centrifugation Tubes | VWR | 352070 | Polypropylene, Sterile, 50 mL. For amino acid solutions. |
References
- Holmes, T. C., de Lacalle, S., Su, X., Liu, G., Rich, A., Zhang, S. Extensive neurite outgrowth and active synapse formation on self-assembling peptide scaffolds. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 97 (12), 6728-6733 (2000).
- Davis, M. E., Motion, J. P. M., et al. Injectable self-assembling peptide nanofibers create intramyocardial microenvironments for endothelial cells. Circulation. 111 (4), 442-450 (2005).
- Matson, J. B., Stupp, S. I. Self-assembling peptide scaffolds for regenerative medicine. Chem. Commun. 48 (1), 26-33 (2012).
- Tatman, P. D., Muhonen, E. G., Wickers, S. T., Gee, A. O., Kim, E., Kim, D. Self-assembling peptides for stem cell and tissue engineering. Biomater. Sci. 4 (4), 543-554 (2016).
- Keyes-Baig, C., Duhamel, J., Fung, S. -. Y., Bezaire, J., Chen, P. Self-assembling peptide as a potential carrier of hydrophobic compounds. J. Am. Chem. Soc. 126 (24), 7522-7532 (2004).
- Kumar, P., Pillay, V., Modi, G., Choonara, Y. E., du Toit, L. C., Naidoo, D. Self-assembling peptides: implications for patenting in drug delivery and tissue engineering. Recent Pat. Drug Deliv. Formul. 5 (1), 24-51 (2011).
- Wang, H., Yang, Z. Short-peptide-based molecular hydrogels: novel gelation strategies and applications for tissue engineering and drug delivery. Nanoscale. 4, 5259-5267 (2012).
- French, K. M., Somasuntharam, I., Davis, M. E. Self-assembling peptide-based delivery of therapeutics for myocardial infarction. Adv. Drug Deliv. Rev. 96, 40-53 (2016).
- Zhang, S., Holmes, T., Lockshin, C., Rich, A. Spontaneous assembly of a self-complementary oligopeptide to form a stable macroscopic membrane. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 90 (8), 3334-3338 (1993).
- Bowerman, C. J., Nilsson, B. L. Self-assembly of amphipathic β-sheet peptides: insights and applications. Biopolymers. 98 (3), 169-184 (2012).
- Amidon, G., Lennernäs, H., Shah, V., Crison, J. A theoretical basis for a biopharmaceutic drug classification: the correlation of in vitro drug product dissolution and in vivo bioavailability. Pharm. Res. 12 (3), 413-420 (1995).
- Shi, Y., Porter, W., Merdan, T., Li, L. C. Recent advances in intravenous delivery of poorly water-soluble compounds. Expert Opin. Drug Deliv. 6 (12), 1261-1282 (2009).
- Bawa, R., Fung, S. -. Y., et al. Self-assembling peptide-based nanoparticles enhance cellular delivery of the hydrophobic anticancer drug ellipticine through caveolae-dependent endocytosis. Nanomedicine. 8 (5), 647-654 (2012).
- Liu, J., Zhang, L., Yang, Z., Zhao, X. Controlled release of paclitaxel from a self-assembling peptide hydrogel formed in situ and antitumor study in vitro. Int. J. Nanomed. 6, 2143-2153 (2011).
- Wu, Y., Sadatmousavi, P., Wang, R., Lu, S., Yuan, Y., Chen, P. Self-assembling peptide-based nanoparticles enhance anticancer effect of ellipticine in vitro and in vivo. Int. J. Nanomed. 7, 3221-3233 (2012).
- Fung, S. Y., Yang, H., et al. Self-Assembling Peptide as a Potential Carrier for Hydrophobic Anticancer Drug Ellipticine: Complexation, Release and In Vitro Delivery. Adv. Funct. Mater. 19 (1), 74-83 (2009).
- Fung, S. -. Y., Oyaizu, T., et al. The potential of nanoscale combinations of self-assembling peptides and amino acids of the Src tyrosine kinase inhibitor in acute lung injury therapy. Biomaterials. 32 (16), 4000-4008 (2011).
- Pacheco, S., Kanou, T., et al. Formulation of hydrophobic therapeutics with self-assembling peptide and amino acid: A new platform for intravenous drug delivery. J. Control. Release. 239, 211-222 (2016).
