자기 조립 펩타이드와 아미노산의 조합을 사용 하 여 수 용액에서 소수 성 화합물의 용 해도
Summary
이 프로토콜 자체 조립 펩타이드와 아미노산 솔루션의 조합을 사용 하는 수성 환경에서 소수 성 화합물을 녹 이기의 임상 적용 방법을 설명 합니다. 우리의 방법은 소수 치료 학, 임상 설정으로 안전 하 고 효율적 수단 가용성 및 배달 방법의 부족의 주요 한계를 해결 합니다.
Abstract
자가 조립 펩 티 드 (얼 간)는 임상 응용 프로그램; 소수 성 치료제의 배달에 대 한 유망한 차량 그들의 amphipathic 속성의 수성 환경에서 소수 성 화합물을 분해 하도록 수 있습니다. 그러나, 자가 조립 펩 티 드 솔루션은 가난한 혈액 호환성 (예를 들어, 낮은 osmolarity), 정 맥 행정을 통해 그들의 임상 응용 프로그램을 방해. 우리는 최근이 아미노산 솔루션 (SAP-AA) 약물 용 해도 향상 및 배합 osmolarity 임상 사용에 대 한 요구 사항에 도달 증가 얼 간 결합 소수 성 약물 전달에 대 한 일반화 된 플랫폼을 개발 했습니다. 이 공식 전략 3 구조적으로 다른 소수 성 화합물-PP2, rottlerin, 및 curcumin-그 다양성을 설명 하기 위하여의 맥락에서 철저 하 게 테스트 되었습니다. 또한, 우리 6 다른 얼 간, 낮은 농도에서 20 자연스럽 게 기존 아미노산 및 두 개의 서로 다른 공동 용 디 메 틸 sulfoxide (DMSO) 및 에탄올을 분석 하 여 배합 구성 요소 변경의 효과 검사 합니다. 특정된 소수 성 약물 및 공식화 억제제, PP2, 치료 기능에 대 한 구성 요소를 최적화에 효과가 입증 하는 우리의 전략은 체 외에서 그리고 vivo에서모두 관찰 되었다. 이 원고는 소수 성 화합물 및 기능적 연구에이 공식의 사용 가능성을 향한 첫 걸음으로 용 해도의 분석에 대 한 SAP-AA 조합을 사용 하 여 우리의 일반적인된 배합 방법을 설명 합니다. 우리는 소수 성 화합물, curcumin의 정립에 대 한 대표적인 용 해도 결과 포함 하 고 어떻게 우리의 방법론 미래 생물학 연구 및 질병 모델에 대 한 플랫폼 역할을 토론.
Introduction
얼 간 재생 의학1,2,,34에서 3D 공중 발판으로 광범위 하 게 연구 하는 생체 재료의 클래스는. 그러나 최근에, 그들은 있다 되었습니다 악용 치료제 때문에 그들의 독특한 생물 속성5,6,,78의 납품을 위한 차량으로. 얼 간 자연스럽 게 안정 nanostructures9, 마약 캡슐화 하 고 보호 하는 수단 제공으로 조립. 얼 간은 amphipathic, 소수 성 및 친수성 아미노산 반복, 운전의 특정 패턴의 구성 그들의 자기 조립을9,10 , 소수 성 및 친수성 사이 매체 역할을 수 있도록 환경입니다. 따라서, 소수 성 약물-임상 배달에 있는 매우 낮은 생체 이용률과 신체에 흡수 수성 환경11,12 -가용성의 부족으로 인해 얼 간은 배달 약속 차량입니다. 또한, 그들의 순서 패턴 또한 그 얼 간 합리적으로 설계 하 고 수 하 어떤 주어진 약물 호환성 최대화 또는 복합 (즉, 기능 그룹에 따라) 추가 가용성 엔지니어링을 의미 합니다.
얼 간 효과적인 마약 배달 차량 많은 생체 외에서 그리고 vivo에서 설정13,14,,1516으로 적용 되어 있다. 그들은 또한 중대 한 안전 및 생체 적합성 표시. 그러나, SAP 약물 준비의 낮은 osmolarity, 때문에 그들은 임상 설정13에서 정 맥 주사에 대 한 사용할 수 없습니다. 이 구속을 고려 하면 우리 최근 얼 간 독성 공동의 사용을 감소 하 고 배합 osmolarity 증가 아미노산 솔루션과 결합 하는 전략을 개발 했다 따라서, 임상 관련성. 우리 얼 간의 빌딩 블록으로 아미노산을 사용 하기로 이미 임상 허용, 고 얼 간와 함께, 그들은 증가 소수 성 약물의 용 해도17,18필수 SAP의 양을 줄이는.
우리는 자세히 조사 SAP AA 조합 소수 성 약물의 용 해도 및 후속 배달을 위한 일반화 된 플랫폼으로 여러 단계의 심사 파이프라인을 만들고 Src 반응 억제제, PP2 모델 소수 성 화합물으로 서 그것을 적용 하 여. 이 과정에서 우리는 정립의 구성 요소를 변경-궁극적으로 테스트 6 다른 얼 간, 2 다양 한 농도 (낮은, 높은, 낮은에 따라 기존 임상 응용 프로그램에 높은 농도에서 모두 20 아미노산의 효과 검사 농도 했다 2 배, 3 배, 또는 물에서 각 아미노산의 최대 용 해도 기반으로 하는 임상 농도 5 배), 그리고 2 다른 공동 용 매-및 추가 분석을 위해 PP2 solubilized 선택한 조합. 이 약물 배합 vivo 모델 intratracheal 및 정 맥 행정을 사용 하 여 세포 배양에 약 배달 차량으로 효과가 입증 했다. 마찬가지로, 우리의 작업 solubilizing 여러 SAP AA 조합의 다양성에 감동을; 수성 환경에서 구조적으로 다른 소수 성 화합물 특히,는 약 rottlerin 및 curcumin18. 이 원고는 SAP AA 배합 방법 및 우리의 심사 파이프라인에서 기본 단계의 예로 curcumin 가용성의 분석을 설명합니다. 이 프로토콜 어떤 주어진된 소수 성 화합물을 분해 최적의 SAP AA 조합에 대 한 화면으로 간단 하 고 재현성을 제공 합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
수립 절차에서 다양 한 중요 한 단계 및 문제 해결에 고려해 야 할 점이 있다. 첫째, 우리는 다양 한 구성 요소와 농도 일으로 프로토콜을 통해 여러 개의 소용돌이 단계 모든 농도 균일 하 고 올바른 인지 확인 합니다. 고 농도, 소수 성 아미노산 솔루션의 일부 수 있습니다 여전히 하지 완전히 용 해 vortexing, 후 고이 경우에, 그들은 과정에서 도움을 손으로 적극적으로 흔들릴 수 있습니다. 마찬가?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 건강 연구의 캐나다 학회에 의해 지원 하 고, 걸 레-42546 및 걸 레 119514 부여 운영 합니다.
Materials
| EAK16-I | CanPeptide Inc. | Custom peptide | Sequence: AEAKAEAKAEAKAEAK, N-terminus acetylation and C-terminus amidation, >95% pure by HPLC |
| EAK16-II | CanPeptide Inc. | Custom peptide | Sequence: AEAEAKAKAEAEAKAK, N-terminus acetylation and C-terminus amidation, >95% pure by HPLC |
| EAK16-IV | CanPeptide Inc. | Custom peptide | Sequence: AEAEAEAEAKAKAKAK, N-terminus acetylation and C-terminus amidation, >95% pure by HPLC |
| EFK8-II | CanPeptide Inc. | Custom peptide | Sequence: FEFEFKFK, N-terminus acetylation and C-terminus amidation, >95% pure by HPLC |
| A6KE | CanPeptide Inc. | Custom peptide | Sequence: AAAAAAKE, N-terminus acetylation and C-terminus amidation, >95% pure by HPLC |
| P6KE | CanPeptide Inc. | Custom peptide | Sequence: PPPPPPPKE, N-terminus acetylation and C-terminus amidation, >95% pure by HPLC |
| Alanine | Sigma-Aldrich | A7469-100G | L-Alanine |
| Isoleucine | Sigma-Aldrich | I7403-100G | L-Isoleucine |
| Leucine | Sigma-Aldrich | L8912-100G | L-Leucine |
| Methionine | Sigma-Aldrich | M5308-100G | L-Methionine |
| Proline | Sigma-Aldrich | P5607-100G | L-Proline |
| Valine | Sigma-Aldrich | V0513-100G | L-Valine |
| Phenylalanine | Sigma-Aldrich | P5482-100G | L-Phenylalanine |
| Tryptophan | Sigma-Aldrich | T8941-100G | L-Tryptophan |
| Tyrosine | Sigma-Aldrich | T8566-100G | L-Tyrosine |
| Glycine | Sigma-Aldrich | G8790-100G | L-Glycine |
| Asparagine | Sigma-Aldrich | A4159-100G | L-Asparagine |
| Glutamine | Sigma-Aldrich | G8540-100G | L-Glutamine |
| Serine | Sigma-Aldrich | A7219-100G | L-Serine |
| Threonine | Sigma-Aldrich | T8441-100G | L-Threonine |
| Histidine | Sigma-Aldrich | H6034-100G | L-Histidine |
| Lysine | Sigma-Aldrich | L5501-100G | L-Lysine |
| Arginine | Sigma-Aldrich | A8094-100G | L-Arginine |
| Aspartic Acid | Sigma-Aldrich | A7219-100G | L-Aspartic Acid |
| Glutamic Acid | Sigma-Aldrich | G8415-100G | L-Glutamic Acid |
| Cysteine | Sigma-Aldrich | C7352-100G | L-Cysteine |
| Dimethyl Sulfoxide | Sigma-Aldrich | D4540-500ML | DMSO |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | 277649-100ML | Anhydrous |
| Curcumin | Sigma-Aldrich | 08511-10MG | Hydrophobic drug, curcumin |
| Rottlerin | EMD Millipore | 557370-10MG | Hydrophobic drug, rottlerin |
| PP2 | Enzo | BML-EI297-0001 | Hydrophobic drug, PP2 |
| Scintillation Vials | VWR | 2650-66022-081 | Borosilicate Glass, with Screw Cap, 20 mL. Vials for weighing peptide. |
| Falcon 50 mL Conical Centrifugation Tubes | VWR | 352070 | Polypropylene, Sterile, 50 mL. For amino acid solutions. |
References
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