活体果蝇卵巢组织中卵泡干细胞谱系的细胞内 pH 值的成像方法
Summary
我们为活体果蝇卵巢组织中的上皮干细胞谱系的细胞内 pH 的成像提供了一个协议。我们描述的方法来产生转基因苍蝇表达 ph 生物传感器, mCherry::p hluorin, 图像的生物传感器使用定量荧光成像, 生成标准曲线, 并转换荧光强度值的 ph 值。
Abstract
细胞内 pH 值 (pHi) 的变化在调节许多细胞功能, 包括新陈代谢、增殖和分化方面起着重要作用。通常, phi 动力学是确定的培养细胞, 这是经得起测量和实验操纵 phi。然而, 最近的新工具和方法的发展使得有可能研究皮动力学在完整的, 活组织。对于果蝇的研究, 一个重要的发展是产生一个携带 pHi 生物传感器的转基因线, mCherry::p hluorin。在这里, 我们描述了一个协议, 我们经常使用的成像直播果蝇ovarioles 在 mCherry 的上皮卵泡干细胞 (FSC) 谱系中测量φ::p hluorin 转基因野生型品系;然而, 这里描述的方法可以很容易地适应其他组织, 包括翼盘和眼上皮。我们描述的技术表达 mCherry::p hluorin 在 FSC 的血统, 维持卵巢组织在现场成像, 并获取和分析图像, 以获得 pHi 值。
Introduction
最近的研究揭示了一个角色的变化在 pHi 细胞分化和发育不良在体内1,2。这些研究发现, 在同一类型的细胞中, pHi 在相同的分化阶段是非常一致的, 但它随着细胞从一个阶段过渡到另一个。在某些情况下, 阻断皮下的改变会部分地破坏分化, 这表明 phi 的变化不仅是细胞命运改变的结果, 反而有助于促进细胞命运的改变, 也许通过对 pH 敏感的调控作用分化所需的蛋白质或化学反应。未来的研究有可能揭示更多的洞察力的许多不同的作用, pHi 动力学在体内。然而, 研究 phi 在分化过程中的一个挑战是在体内获得精确的φ测量。与其他分化特征不同, 如细胞形态学和基因表达的变化, φ是细胞的不稳定的化学性质, 是不保存在细胞, 已固定和化的标准方法。此外, pHi 可能不稳定的细胞, 是压力或死亡的实验操作的结果。因此, 在测量 pHi 时保持细胞存活和尽可能健康是很重要的。有几种重要的染料可用于在培养基中测量细胞的φ3, 但在许多情况下, 它们不适合用于活体研究, 因为它们不能深入或均匀地穿透组织以提供精确的测量.
为了绕过染料渗透不良的问题, 我们和其他人使用了一个基因编码探针, mCherry::p hluorin4,5,6,7, 可以在单元格中明确表示类型的兴趣和影像活组织。pHluorin 是一个变种的 GFP 与较高的 pKa (〜 7.0 vs. 4.0), 折叠更容易在较高的 pH 值;因此, 细胞中 pHluorin 分子的总荧光强度随着φ8的增加而增加。重要的是, 荧光在皮值的正常胞浆范围内是线性的。相比之下, mCherry (pKa ~ 4.5) 的荧光对胞浆范围内的 pH 变化不敏感。这两个记者是共用一个单一的嵌合蛋白, 由单一的开放阅读框架编码, 所以他们总是在同等数量的存在。因此, pHluorin 与 mCherry 荧光强度的比值提供了对每个细胞中的探针浓度进行归一化的φ的测量。然后, 该比值可以转换为φ值的估计使用一个标准的曲线, 这是产生的 pHluorin 的 mCherry 比例从组织已经平衡已知的 pH 值。
在这里, 我们描述了使用 mCherry 的方法::p hluorin 测量的上皮 FSC 谱系的皮在果蝇卵巢。该良好组织已被用于模型的许多不同方面的上皮生物学, 如干细胞自我更新和分化9,10,11, 集体细胞迁移12, 以及单元极性的开发和维护13,14。卵泡上皮是由两个演产生的, 它们驻留在组织的前边缘, 结构称为 germarium15,16。这些细胞在成年期间定期分裂, 以自我和产生后代, 称为 prefollicle 细胞 (全氟化), 可以重新进入利基, 成为一个 FSC 或分化成三种不同的卵泡细胞类型: 极性细胞, 茎细胞, 或主体卵泡细胞。我们先前显示, 在野生组织中, phi 在分化的早期阶段稳步增加, 从演的φ6.8 到7.0 的全氟化合物, 到7.3 的卵泡细胞2。通过干扰无所不在表达的钠/质子交换器, DNhe2, 阻止这种增加, 严重损害了 pFC 的分化, 而通过过度表现的DNhe2导致轻度过量分化型.这些结果表明, pHi 是稳定地保持在早期 FSC 谱系, 它可以实验增加或减少在体内。这里描述的方法可以用来测量φ在野生组织或各种形式的突变组织, 包括 rna 干扰或过度表达使用 Gal4 的兴趣, 和有丝分裂克隆。
Protocol
Representative Results
Discussion
在这里, 我们描述了一种测量野生组织中的 FSC 谱系中的细胞 pHi 的方法。自从我们开始研究皮在果蝇卵巢组织中的应用以来, 这项协议已经在过去的五年中得到了发展和完善。在此期间, 该协议已成功地应用于我们的实验室和至少四不同的旋转光盘和激光扫描显微镜的多个调查人员。我们最初的观察的重现性, φ增加作为细胞在 FSC 谱系区分从干细胞到 pFC 到卵泡细胞状态, 横跨这些多次试验?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
我们感谢 (Ulmschneider 对《议定书》的贡献和戴安娜理发师对手稿的建议。这项工作由国家卫生研究所资助, GM116384 T.G. Nystul 和 d.l 理发。
Materials
| Fly Stocks | |||
| UAS-mCherry::pHluorin[1] | |||
| y1 w*;P{GawB}10930/CyO | Bloomington Stock Center | 7023 | |
| Act-Gal4 flipout stock | Bloomington Stock Center | 4409 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chemicals for Buffer preparation | |||
| NaCl | Sigma Aldrich | S5886 | |
| KCl | Sigma Aldrich | P-3911 | |
| glucose | Mallinckrodt | 4912 | |
| HEPES | Thermo Fisher Scientific | BP310 | |
| MgSO4 | Thermo Fisher Scientific | M63 | |
| CaCl2 | Sigma Aldrich | C-5080 | |
| HCO3 | Sigma Aldrich | S-5761 | |
| MgCl2 | Sigma Aldrich | M-9272 | |
| NMDG+ | Sigma Aldrich | M-2004 | |
| K2HPO4 | Mallinckrodt | 7088 | Use to Make KHPO4 pH 7.4 |
| KH2PO4 | Thermo Fisher Scientific | BP362 | Use to Make KHPO4 pH 7.4 |
| Concanavalin A, Alexa Fluor 647 Conjugate | Thermo Fisher Scientific | C21421 | 0.25 mg/ml dilution |
| Nigericin | Thermo Fisher Scientific | N1495 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dissection and mounting tools | |||
| 2 Dumont Inox forceps (Size 5) | Thermo Fisher Scientific | NC9473431 | |
| 2 23-gauge syringe needles | Sigma Aldrich | Z192457 | |
| 9-well glass dissecting dish | Thermo Fisher Scientific | 13-748B | |
| Vacuum Grease | Dow Corning | 1018817 | |
| 22 X 40 mM glass coverslips | Thermo Fisher Scientific | 12545C | |
| Round Glass Coverslips, 12mm diameter, 0.13-0.16mm thickness | Ted Pella, Inc. | 26023 | |
| 3-D mounting chamber | custom manufactured | .stl and .ipt files for 3-D printer included as supplemental files | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Other equipment | |||
| pH meter | Thermo Fisher Scientific | 13-620-183A | Model: Accumet AB15 |
| Dissection microscope | Olympus Corporation | 0H11436 | Model: SZ2-ST |
| Confocal Microscope | Leica Biosystems | SP5 or SP8 laser-scanning confocal microscope with a 40× objective with a numerical aperture of 1.3 |
References
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