우리는 살아있는 초파리 난소 조직에는 상피 줄기 세포 계보의 세포내 pH를 이미징에 대 한 프로토콜을 제공 합니다. 유전자 변형 파리 양적 형광 이미징 사용 하 여 바이오 센서는 pH 바이오 센서, mCherry::pHluorin, 이미지를 표현 생성 하 고 표준 곡선, 생성 한 형광 강도 값을 pH 값으로 변환 하는 방법을 설명 합니다.
세포내 pH (피)에 변화 많은 세포 기능, 대사, 확산, 차별화 등의 규칙에 중요 한 역할을 재생 합니다. 일반적으로, 피 역학 순종 측정 하 고 실험적으로 피를 조작 하는 경작된 한 세포에 결정 됩니다. 그러나, 새로운 도구와 방법론의 최근 개발 그대로, 살아있는 조직 내에서 피 역학 공부를 가능 하 게 했다. 초파리 연구를 위한 하나의 중요 한 발전은 들고 피 바이오 센서는 유전자 변형 라인의 세대 mCherry::pHluorin. 여기, 우리는 우리가 일상적으로 사용 하 여 이미징 라이브 초파리 ovarioles에 대 한 mCherry::pHluorin 유전자 변형 야생 타입 라인;의 상피 뿌리 줄기 세포 (FSC) 혈통에 피를 측정 하는 프로토콜 설명 그러나, 여기에 설명 된 방법을 날개 디스크와 눈 상피를 포함 하 여 다른 조직에 쉽게 적용할 수 있습니다. 우리는 라이브 이미징, 및 취득 및 피 값을 가져올 이미지를 분석 하는 동안 난소 조직을 유지 하 FSC 혈통에 mCherry::pHluorin를 표현 하기 위한 기법을 설명 합니다.
최근 연구 결과 세포 감 별 법 그리고 발육 이상 vivo에서1,중2피에 변화에 대 한 역할을 밝혔다. 이러한 연구 발견 그 피는 차별화의 동일한 단계에서 동일한 유형의 세포에서 현저 하 게 일관 하지만 과도 한 단계에서 다른 셀으로 변경. 경우에 따라 차별화, 피에 변화 세포 운명에 변화의 결과 그냥 아니다 하지만 대신 세포 운명, pH에 민감한 규제에 영향을 통해 변화를 촉진 하는 데 도움이 방해 피에서 변화를 부분적으로 차단 단백질 또는 차별화에 필요한 화학 반응입니다. 미래 연구 피 역학에서 vivo에서의 여러 가지 역할에 더 많은 통찰력을 가능성이 있다. 그러나, 피의 정확한 측정을 얻는 이다 vivo에서 분화 하는 동안 피를 공부 하는 과제 중 하나. 분화, 세포 형태학 및 유전자 발현에 변화 등의 다른 기능과 달리 피는 고정 되어 있고 표준 방법으로 permeabilized 셀에 유지 되지 않고 셀의 정한 화학 재산입니다. 또한, 강조 하는 셀에 안정 또는 실험적인 조작으로 인해 죽어가는 피 않을 수 있습니다. 따라서, 피를 측정할 때 살아 있고 가능한 건강 한 세포를 유지 하는 것이 중요 하다. 몇 가지 중요 한 염료는 vivo에서 깊이 또는 균등 하 게 조직 침투 하지 않습니다 그들은 때문에 공부에 대 한 그들이 경우 셀 문화3, 그러나 많은 피 측정을 위해 잘 작동 적합 하지 않습니다 사용할 수 있는 정확한 측정을 제공 하기 위해 .
우회 가난한 염료 침투의 문제, 우리와 다른 사용 유전자 인코딩된 프로브, mCherry::pHluorin4,5,,67, 특히 셀에에서 표현할 수 있는 관심과 살아있는 조직에 몇 군데의 종류입니다. pHluorin는 높은 pKa와 GFP의 변종 (~ 대 7.0 ~ 4.0)을 더 쉽게 더 높은 pH;에 주름 그래서 셀에 pHluorin 분자의 인구에서 방출 된 총 형광 강도 피8증가 함께 증가 합니다. 중요 한 것은, 형광은 정상 범위 내에 cytosolic 피 값의 선형. 반면, mCherry의 형광 (pKa ~ 4.5) cytosolic 범위 내에서 pH 변화에 민감 하지 않습니다. 이 두 기자 covalently 함께 그래서 그들은 항상 동일한 금액에 존재 한 열려있는 독서 프레임으로 인코딩된 단일 공상 단백질으로 연결 됩니다. 따라서, mCherry 형광 강도 pHluorin의 비율 피 각 셀에 프로브 농도를 정상화 하는 측정을 제공 합니다. 비율 다음 알려진된 pH 값에 equilibrated 조직에서 mCherry 비율에는 pHluorin를 취득 하 여 생성 되는 표준 곡선을 사용 하 여 피 값의 견적을 변환할 수 있습니다.
여기, 우리 mCherry::pHluorin를 사용 하 여 초파리 난소의 상피 FSC 혈통의 피를 측정 하는 방법을 설명 합니다. 이 특징이 잘 조직 상피 생물학, 줄기 세포 자체 갱신 및 차별화9,10,11, 집단 셀 마이그레이션12 등의 다양 한 측면을 모델링 하는 데 사용 되었습니다. , 개발 및 세포 극성13,14의 유지 보수. 여 포 상피 조직의 앞쪽 가장자리에 germarium15,16라고 하는 구조에 있는 2 개의 FSCs에 의해 생산 됩니다. Prefollicle 셀 (pFCs), 다시 틈새를 입력 하 고는 FSC 될 하거나 세 다른 여 포 세포 유형 중 하나에 차별화 라는 자손을 생산 하 고 자기 갱신 성인 기 동안 정기적으로 이러한 세포 분열: 극 지 세포, 줄기 세포, 또는 본체 여 포 세포입니다. 우리 보여주었다 이전 wildtype 조직에는 피 차별화, pFCs에서 7.0 FSCs에 약 6.8의 피에서 여 포 세포27.3에의 초기 단계 동안 꾸준히 증가. 심각 하 게 손상 pFC 차별화 편 표현된 나트륨/양성자 교환기, DNhe2의 RNAi 최저에 의해이 증가 차단, DNhe2 의 overexpression에 의해 피를 증가 하는 반면 약한 과도 차별화 하면 표현 형입니다. 이러한 결과 피 초기 FSC 혈통에 안정적으로 유지 되 고 실험적으로 될 수 있는 증가 또는 vivo에서감소를 보여 줍니다. 여기에 설명 된 방법은 wildtype 조직 또는 돌연변이 조직, RNAi 최저 또는 overexpression Gal4 관심과 mitotic 클론을 사용 하 여를 포함 하 여 다양 한 형태의 피 측정을 사용할 수 있습니다.
여기, 우리가 wildtype 조직 내의 FSC 혈통에 셀의 피를 측정 하는 방법을 설명 합니다. 이 프로토콜 개발 되어 있으며 우리가 처음 초파리 난소 조직에 피를 공부 하기 시작 했다 이후 지난 5 년간 정제 된. 그 시간 동안, 프로토콜 성공적으로 여러 조사 연구소에서 하 고 적어도 4 개의 다른 회전 디스크와 레이저 스캔 현미경에 의해 사용 되었습니다. 우리의 원래 관찰, 그 피 증가 FSC 계보에서 ?…
The authors have nothing to disclose.
원고에 대 한 제안에 대 한 프로토콜 및 다이앤이 발사에 기여에 감사 Bryne Ulmschneider 하 고. 이 작품은 건강 그랜트 GM116384 T.G. Nystul 및 듀얼이 발사의 국가 학회에 의해 투자 되었다.
Fly Stocks | |||
UAS-mCherry::pHluorin[1] | |||
y1 w*;P{GawB}10930/CyO | Bloomington Stock Center | 7023 | |
Act-Gal4 flipout stock | Bloomington Stock Center | 4409 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Chemicals for Buffer preparation | |||
NaCl | Sigma Aldrich | S5886 | |
KCl | Sigma Aldrich | P-3911 | |
glucose | Mallinckrodt | 4912 | |
HEPES | Thermo Fisher Scientific | BP310 | |
MgSO4 | Thermo Fisher Scientific | M63 | |
CaCl2 | Sigma Aldrich | C-5080 | |
HCO3 | Sigma Aldrich | S-5761 | |
MgCl2 | Sigma Aldrich | M-9272 | |
NMDG+ | Sigma Aldrich | M-2004 | |
K2HPO4 | Mallinckrodt | 7088 | Use to Make KHPO4 pH 7.4 |
KH2PO4 | Thermo Fisher Scientific | BP362 | Use to Make KHPO4 pH 7.4 |
Concanavalin A, Alexa Fluor 647 Conjugate | Thermo Fisher Scientific | C21421 | 0.25 mg/ml dilution |
Nigericin | Thermo Fisher Scientific | N1495 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Dissection and mounting tools | |||
2 Dumont Inox forceps (Size 5) | Thermo Fisher Scientific | NC9473431 | |
2 23-gauge syringe needles | Sigma Aldrich | Z192457 | |
9-well glass dissecting dish | Thermo Fisher Scientific | 13-748B | |
Vacuum Grease | Dow Corning | 1018817 | |
22 X 40 mM glass coverslips | Thermo Fisher Scientific | 12545C | |
Round Glass Coverslips, 12mm diameter, 0.13-0.16mm thickness | Ted Pella, Inc. | 26023 | |
3-D mounting chamber | custom manufactured | .stl and .ipt files for 3-D printer included as supplemental files | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Other equipment | |||
pH meter | Thermo Fisher Scientific | 13-620-183A | Model: Accumet AB15 |
Dissection microscope | Olympus Corporation | 0H11436 | Model: SZ2-ST |
Confocal Microscope | Leica Biosystems | SP5 or SP8 laser-scanning confocal microscope with a 40× objective with a numerical aperture of 1.3 |