Methoden voor Imaging intracellulaire pH van de follikel stamcel overdrachtslijn in Live Drosophila eierstokweefsel

Summary

Wij bieden een protocol voor imaging intracellulaire pH van een geslacht epitheliale cel van de stam in levende Drosophila eierstokweefsel. We beschrijven de methoden voor het genereren van transgene vliegen uiten een pH biosensor, mCherry::pHluorin, image de biosensor met behulp van kwantitatieve fluorescentie imaging, standaard curven genereren en fluorescentie intensiteitswaarden omzetten in pH-waarden.

Abstract

Veranderingen in de intracellulaire pH (pHi) een belangrijke rol spelen bij de regulering van vele cellulaire functies, met inbegrip van het metabolisme, proliferatie en differentiatie. Typisch, pHi dynamiek zijn bepaald in gekweekte cellen, die zich lenen voor het meten en manipuleren van experimenteel pHi. Echter heeft de recente ontwikkeling van nieuwe instrumenten en methodologieën het mogelijk gemaakt om te studeren pHi dynamiek binnen intact, levend weefsel. Voor onderzoek van de Drosophila , was een belangrijke ontwikkeling de generatie van een transgene lijn uitvoering een pHi biosensor, mCherry::pHluorin. Hier beschrijven we een protocol die we regelmatig voor imaging live Drosophila ovarioles gebruiken voor het meten van pHi in de bloedlijn van de cel van de stam (FSC) epitheliale follikel in mCherry::pHluorin transgene wild type lijnen; de hier beschreven methoden kunnen echter gemakkelijk aan te passen voor andere weefsels, inclusief de vleugel schijven en oog epitheel. We beschrijven technieken voor het uitdrukken van mCherry::pHluorin in de bloedlijn van de FSC, handhaven van eierstokweefsel tijdens live imaging, verwerven en analyseren van beelden om te verkrijgen van pHi waarden.

Introduction

Recente studies bleek een rol voor veranderingen in pHi tijdens cellulaire differentiatie en dysplasie in vivo^1,2. Deze studies gevonden dat die pHi strookt opmerkelijk in cellen van hetzelfde type dezelfde stadium van differentiatie, maar dat verandert als de overgang van één fase naar de andere cellen. In sommige gevallen verstoort gedeeltelijk blokkeren van de veranderingen in pHi differentiatie, suggereren dat de verandering in pHi niet alleen een gevolg van veranderingen in het lot van de cel is, maar in plaats daarvan draagt bij tot de bevordering van de verandering in het lot van de cel, misschien via effecten op pH-gevoelige regelgevende eiwitten of chemische reacties die nodig zijn voor differentiatie. Toekomstige studies hebben het potentieel om te onthullen meer inzicht in de vele verschillende rollen van pHi dynamiek in vivo. Echter, een van de uitdagingen van het bestuderen van pHi tijdens differentiatie in vivo is het verkrijgen van nauwkeurige metingen van pHi. In tegenstelling tot andere functies van differentiatie, zoals veranderingen in de morfologie van de cellulaire en genexpressie, is pHi een onstabiele chemische eigenschap van de cel die wordt niet bewaard in cellen die zijn vastgesteld en met standaardmethoden permeabel. Bovendien, pHi mogelijk niet stabiel in cellen die zijn beklemtoond of sterven als gevolg van experimentele manipulatie. Het is dus belangrijk om te houden van cellen in levend en zo gezond mogelijk in bij het meten van pHi. Verschillende essentiële kleurstoffen zijn beschikbaar dat werk goed voor het meten van de pHi van cellen in cultuur-³, maar in veel gevallen zij zijn niet geschikt voor in vivo studies omdat zij doen niet het weefsel doordringen, diep of gelijkmatig voldoende om nauwkeurige metingen .

Om te omzeilen het probleem van de arme kleurstofpenetratie, hebben wij en anderen gebruikt een genetisch gecodeerde sonde, mCherry::pHluorin^4,5,6,7, dat kan worden uitgedrukt specifiek in de cel soorten belang en verbeelde in levend weefsel. pHluorin is een variant van GFP met een hogere pKa (~ 7.0 vs. ~ 4.0) dat past beter bij een hogere pH; Zo verhoogt de intensiteit van de fluorescentie totaal uitgestoten uit een populatie van pHluorin moleculen in de cel met de toenemende pHi⁸. Nog belangrijker is, is de fluorescentie lineaire binnen de normale cytosolische waardebereik pHi. In contrast, de fluorescentie van mCherry (pKa ~ 4.5) is ongevoelig voor pH veranderingen binnen het cytosolische bereik. Deze twee verslaggevers zijn covalent samen als een enkele chimeer eiwit, gecodeerd door een enkele open leesraam, zodat ze altijd in gelijke hoeveelheden aanwezig gekoppeld. De verhouding van pHluorin naar mCherry fluorescentie intensiteit biedt daarom een meting van pHi dat is genormaliseerd naar de concentratie van de sonde in elke cel. De ratio’s kunnen vervolgens worden geconverteerd naar raming van pHi waarden met behulp van een standaard curve die wordt gegenereerd door het verkrijgen van de pHluorin te mCherry ratio’s van weefsels die bekende pH waarden hebben zijn geëquilibreerd.

Hier beschrijven we de methoden voor het gebruik van mCherry::pHluorin voor het meten van de pHi van de epitheliale FSC overdrachtslijn in de Drosophila eierstok. Dit goed gekarakteriseerd weefsel is gebruikt om het model van de vele verschillende aspecten van de epitheliale biologie, zoals de cel van de stam zelf-vernieuwing en differentiatie^9,10,11, collectieve cel migratie¹² , en de ontwikkeling en het onderhoud van^13,14van de polariteit van de cel. Het epitheel van de follikel wordt geproduceerd door twee FSCs die zich op de voorste rand van het weefsel in een structuur genaamd de germarium^{15,16 bevinden}. Deze cellen verdelen regelmatig tijdens volwassenheid zichzelf vernieuwen en produceren nakomelingen, oftewel prefollicle cellen (PFK’s), die kunnen de niche opnieuw in te voeren en geworden een FSC of in een van drie verschillende follikel celtypes te differentiëren: polar cellen, cellen van de stengel, of hoofdtekst follikel cellen. We bleek eerder dat in wildtype weefsel, de pHi gestaag toeneemt tijdens de vroege stadia van differentiatie, vanuit een pHi van ongeveer 6,8 in FSCs naar 7.0 in PFK’s, tot 7.3 in follikel cellen². Het blokkeren van deze stijging door RNAi knockdown van een overal uitgedrukt natrium/proton-wisselaar, DNhe2, ernstig schaadt pFC differentiatie, overwegende dat de toenemende pHi door overexpressie van DNhe2 veroorzaakt een milde overtollige differentiatie fenotype. Deze bevindingen tonen aan dat pHi stabiel in de vroege FSC bloedlijn wordt gehandhaafd en dat het experimenteel kan worden verhoogd of verlaagd in vivo. De hier beschreven methoden kunnen worden gebruikt voor het meten van pHi wildtype weefsel of verschillende vormen van mutant weefsel, met inbegrip van RNAi knockdown of overexpressie met behulp van een Gal4 van belang, en de mitotische klonen.

Protocol

Opmerking: voor het meten van pHi in de bloedlijn van de FSC, wij berekenen van de verhouding tussen de intensiteit van de fluorescentie van pHluorin naar mCherry in FSCs, PFK’s en follikel cellen in fysiologische omstandigheden en zet de verhoudingen in pHi waarden met standaard kalibratiekrommen voor elke cel type 7. Eerste, levende imaging experimenten worden uitgevoerd voor het meten van de intensiteit van de fluorescentie van pHluorin en mCherry in germaria ontleed in een buffer met NaHCO <…

Representative Results

Hier hebben we het proces voor het meten van pHi in de follikel epitheel, waarbij verschillende stappen beschreven. Eerst worden de eierstokken ontleed van vliegen genotype de juiste hulpprogramma’s voor ontleden en montage (Figuur 1). De ovarioles zijn dan beeld met behulp van kwantitatieve fluorescentie microscopie en de beelden worden geanalyseerd om te verkrijgen van de metingen van pHi. Voor elke afbeelding, worden de celtypes van belang geïdentificeerd…

Discussion

Hier beschrijven we een methode voor het meten van de pHi van cellen in de bloedlijn van FSC binnen wildtype weefsel. Dit protocol heeft ontwikkeld en verfijnd in de afgelopen vijf jaar, omdat we eerst begonnen te studeren pHi in Drosophila eierstokweefsel. Gedurende die tijd, het protocol heeft met succes gebruikt door meerdere onderzoekers in ons lab en op ten minste vier verschillende draaiende schijf en laser scannen microscopen. De reproduceerbaarheid van onze oorspronkelijke waarneming, dat pHi verhogingen…

Materials

Fly Stocks
UAS-mCherry::pHluorin[1]
y1 w*;P{GawB}10930/CyO	Bloomington Stock Center	7023
Act-Gal4 flipout stock	Bloomington Stock Center	4409
Name	Company	Catalog Number	Comments
Chemicals for Buffer preparation
NaCl	Sigma Aldrich	S5886
KCl	Sigma Aldrich	P-3911
glucose	Mallinckrodt	4912
HEPES	Thermo Fisher Scientific	BP310
MgSO4	Thermo Fisher Scientific	M63
CaCl2	Sigma Aldrich	C-5080
HCO3	Sigma Aldrich	S-5761
MgCl2	Sigma Aldrich	M-9272
NMDG+	Sigma Aldrich	M-2004
K2HPO4	Mallinckrodt	7088	Use to Make KHPO4 pH 7.4
KH2PO4	Thermo Fisher Scientific	BP362	Use to Make KHPO4 pH 7.4
Concanavalin A, Alexa Fluor 647 Conjugate	Thermo Fisher Scientific	C21421	0.25 mg/ml dilution
Nigericin	Thermo Fisher Scientific	N1495
Name	Company	Catalog Number	Comments
Dissection and mounting tools
2 Dumont Inox forceps (Size 5)	Thermo Fisher Scientific	NC9473431
2 23-gauge syringe needles	Sigma Aldrich	Z192457
9-well glass dissecting dish	Thermo Fisher Scientific	13-748B
Vacuum Grease	Dow Corning	1018817
22 X 40 mM glass coverslips	Thermo Fisher Scientific	12545C
Round Glass Coverslips, 12mm diameter, 0.13-0.16mm thickness	Ted Pella, Inc.	26023
3-D mounting chamber	custom manufactured		.stl and .ipt files for 3-D printer included as supplemental files
Name	Company	Catalog Number	Comments
Other equipment
pH meter	Thermo Fisher Scientific	13-620-183A	Model: Accumet AB15
Dissection microscope	Olympus Corporation	0H11436	Model: SZ2-ST
Confocal Microscope	Leica Biosystems		SP5 or SP8 laser-scanning confocal microscope with a 40× objective with a numerical aperture of 1.3