ライブショウジョウバエ卵巣組織の卵胞幹細胞系列のイメージング細胞内 pH の方法
Summary
ライブショウジョウバエ卵巣組織の上皮幹細胞系列の細胞内 pH のイメージングのためのプロトコルを提供します。定量的蛍光イメージングを用いたバイオ センサー pH センサー、mCherry::pHluorin、イメージを表現する遺伝子組換えハエを生成し、標準曲線を生成 pH 値に変換する蛍光強度の方法について述べる。
Abstract
細胞内 pH (pHi) の変化は、代謝、増殖、分化など多くの細胞機能の調節に重要な役割を果たします。通常、ピピのダイナミクスは、測定やピピの実験操作に適している培養細胞で決定されます。ただし、新しいツールと方法論の最近の発展が可能そのままに、ライブの組織内のピピのダイナミクスを研究します。ショウジョウバエ研究の 1 つの重要な開発だったピピ バイオ センサーを運ぶ遺伝子組換えラインの世代 mCherry::pHluorin。ここでは、我々 は mCherry::pHluorin 遺伝子の野生型の行数で卵胞上皮幹細胞 (FSC) 系統のピピを測定するイメージング ライブショウジョウバエ卵巣小管に頻繁に使用されるプロトコルについて述べるただし、ここで説明する方法は翅原基と眼の上皮を含む他の組織のために容易に適応することができます。ライブ イメージング、および集録および解析ピピ値を取得する画像中の卵巣組織の維持 FSC 系統 mCherry::pHluorin を表現するための手法について述べる。
Introduction
最近の研究は、細胞分化と異生体内で1,2ピピの変化のための役割を明らかにしました。これらの研究は、細胞 1 つの段階から別への移行が変更されるが、そのファイは著しく分化、同じステージで同じ型のセルで一貫性のあるを発見します。いくつかのケースでピピで変更を部分的にブロック分化、ピピの変化は細胞の運命の変化の結果だけではないが、代わりにおそらく pH に敏感な調節に及ぼす影響を細胞の運命の変化を促進するのに役立ちます示唆を妨害します。タンパク質や分化に必要な化学反応。今後の研究には、ピピ動態の生体内でさまざまな役割にもっと洞察力を明らかにする可能性があります。しかし、生体内での分化時にピピを研究の課題の 1 つがピピの正確な測定を取得します。分化細胞の形態と遺伝子発現の変化などの他の機能とは異なりピピはセルが固定され、標準的な方法でグリセリンのセルに保存されていないの不安定な化学プロパティです。さらに、強調している細胞の安定や実験操作の結果として死んで、ピピはできません。したがって、ピピを測定するとき生きていると可能な限り健康細胞を保つために重要です。いくつかの重要な染料が生体内研究深くまたは均等に、彼らは組織を浸透しないので、場合は細胞文化3ではなく、多くのピピを測定、それらのためによく働くが適していないいる利用可能な正確な測定を提供するために十分な.
貧しい染料の浸透の問題を回避するために私たちと他の人は、遺伝的コード化プローブ、mCherry::pHluorin4,5,6、7セルで具体的に表すことができるを使用しています。興味とイメージで生体の種類。pHluorin は高い pKa と GFP のバリアント (~ 対 7.0 〜 4.0) を折るより容易により高い ph;だから pHluorin 分子の人口から放出される総蛍光強度は φ8の増加とともに増加します。重要なは、蛍光、ピピ値の正常細胞質範囲内で線形です。対照的に、mCherry の蛍光 (pKa 〜 4.5) ゾル性細胞質範囲内の pH の変化に敏感ではないです。これらの 2 つの記者が均等に存在している常にので、1 つのオープンリーディング フレームによって符号化される単一のキメラ蛋白質として一緒にリンク共有されます。したがって、mCherry の蛍光強度を 1p-169 比は、各セルにプローブ濃度に正規化されたファイの測定を提供します。比率は、知られている pH 値を平衡して組織から mCherry 比、pHluorin を取得することによって生成された標準的なカーブを使用して φ 値の推定値に変換できます。
ここでは、mCherry::pHluorin を使用してショウジョウバエ卵巣上皮の FSC 系統のピピを測定する方法をについて説明します。このよ特徴付けられた組織は、上皮の生物学、幹細胞の自己複製と分化9,10,11, 集団細胞遊走12 などのさまざまな側面をモデルに使用されています、および開発、細胞極性13,14の保守。卵胞上皮は、germarium15,16と呼ばれる構造に組織の前方の端にある 2 つの Fsc によって生成されます。これらの細胞が自己更新し、ニッチを再入力と FSC になるまたは 3 つの異なる卵胞細胞の種類のいずれかに分化する実行できる prefollicle 細胞 (pFCs) と呼ばれる子孫を生成する成人期に定期的に分割: 極細胞、茎細胞、または本体卵胞細胞。我々, 以前では野生型組織、ファイは、Pfc の 7.0 に Fsc の約 6.8 のピピから、卵胞細胞27.3 への分化の初期段階の間に着実に増加します。深刻な pFC 分化を損なう、 DNhe2の過剰発現によるピピの増加に対し原因軽度の過剰な分化の普遍的発現ナトリウム/プロトン交換、 DNhe2、RNAi ノックダウンでこの増加をブロック表現型。これらの調査結果は、ピピは初期の FSC 系統の維持安定、生体内で増減実験できることを示しています。ここで説明する方法は、野生型組織や RNAi ノックダウンまたは利子および有糸分裂のクローンの Gal4 を使用して過剰発現を含む突然変異体の組織の様々 な形のピピを測定する使用できます。
Protocol
Representative Results
Discussion
ここでは、野生型組織内 FSC 系統の細胞のピピの測定法について述べる.このプロトコルを開発し、ショウジョウバエ卵巣組織のピピを勉強する最初を開始して以来、過去 5 年間で洗練されました。その間、プロトコルは、複数の捜査官当研究室と、少なくとも 4 つの異なる回転する円盤とレーザ走査型顕微鏡で正常に使用されています。当社独自の観測、ピピ増加卵胞細胞状態に pFC ?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ブリーネ Ulmschneider に原稿に関する提案プロトコルおよびダイアン床屋への貢献ありがちましょう。この仕事健康付与 GM116384 T.G. Nystul と d. l. 床屋の国立研究所によって資金を供給されました。
Materials
| Fly Stocks | |||
| UAS-mCherry::pHluorin[1] | |||
| y1 w*;P{GawB}10930/CyO | Bloomington Stock Center | 7023 | |
| Act-Gal4 flipout stock | Bloomington Stock Center | 4409 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chemicals for Buffer preparation | |||
| NaCl | Sigma Aldrich | S5886 | |
| KCl | Sigma Aldrich | P-3911 | |
| glucose | Mallinckrodt | 4912 | |
| HEPES | Thermo Fisher Scientific | BP310 | |
| MgSO4 | Thermo Fisher Scientific | M63 | |
| CaCl2 | Sigma Aldrich | C-5080 | |
| HCO3 | Sigma Aldrich | S-5761 | |
| MgCl2 | Sigma Aldrich | M-9272 | |
| NMDG+ | Sigma Aldrich | M-2004 | |
| K2HPO4 | Mallinckrodt | 7088 | Use to Make KHPO4 pH 7.4 |
| KH2PO4 | Thermo Fisher Scientific | BP362 | Use to Make KHPO4 pH 7.4 |
| Concanavalin A, Alexa Fluor 647 Conjugate | Thermo Fisher Scientific | C21421 | 0.25 mg/ml dilution |
| Nigericin | Thermo Fisher Scientific | N1495 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dissection and mounting tools | |||
| 2 Dumont Inox forceps (Size 5) | Thermo Fisher Scientific | NC9473431 | |
| 2 23-gauge syringe needles | Sigma Aldrich | Z192457 | |
| 9-well glass dissecting dish | Thermo Fisher Scientific | 13-748B | |
| Vacuum Grease | Dow Corning | 1018817 | |
| 22 X 40 mM glass coverslips | Thermo Fisher Scientific | 12545C | |
| Round Glass Coverslips, 12mm diameter, 0.13-0.16mm thickness | Ted Pella, Inc. | 26023 | |
| 3-D mounting chamber | custom manufactured | .stl and .ipt files for 3-D printer included as supplemental files | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Other equipment | |||
| pH meter | Thermo Fisher Scientific | 13-620-183A | Model: Accumet AB15 |
| Dissection microscope | Olympus Corporation | 0H11436 | Model: SZ2-ST |
| Confocal Microscope | Leica Biosystems | SP5 or SP8 laser-scanning confocal microscope with a 40× objective with a numerical aperture of 1.3 |
References
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