שיטות הדמיה תאיים pH של השושלת תאי זקיק ברקמת השחלה דרוזופילה בשידור חי
Summary
אנו מספקים פרוטוקול הדמיה רמת החומציות תאיים של שושלת היוחסין תאי אפיתל ברקמת השחלה דרוזופילה בשידור חי. אנו מתארים שיטות כדי ליצור זבובים הטרנסגניים לבטא ביוסנסור pH, mCherry::pHluorin, התמונה החיישן באמצעות הדמיה פלורסצנטיות כמותית, ליצור עקומות רגיל ו להמיר ערכי העוצמה פלורסצנטיות ערכי pH.
Abstract
שינויים ב- pH תאיים (פי) תפקיד חשוב בוויסות תאיים רבים, כולל מטבוליזם, התפשטות של בידול. בדרך כלל, דינמיקה פי נקבעים בתאים בתרבית, אשר נתונות מדידה וטיפול השפעול pHi. עם זאת, ההתפתחות האחרונה של מתודולוגיות וכלים חדשים איפשרה בחקר דינמיקה פי בתוך רקמת ללא פגע, בשידור חי. דרוזופילה מחקר, פיתוח חשוב אחד היה הדור של קו הטרנסגניים נושאת ביוסנסור על פי, mCherry::pHluorin. כאן, אנו מתארים את פרוטוקול בהם אנו עושים שימוש שגרתי הדמיה ovarioles דרוזופילה בשידור חי כדי למדוד את פי בשושלת זקיק אפיתל תאי גזע (FSC) בקווים הטרנסגניים פראי סוג mCherry::pHluorin; עם זאת, בשיטות המתוארות כאן ניתן להתאים בקלות בשביל לרקמות אחרות, כולל דיסקים כנף עין האפיתל. אנו מתארים שיטות לביטוי mCherry::pHluorin בשושלת FSC, שמירה על רקמות השחלה במהלך חיים הדמיה, ואת רכישת וניתוח תמונות כדי להשיג פי ערכי.
Introduction
מחקרים שנעשו לאחרונה חשף תפקיד לשינויים בפי פי במהלך תאית התמיינות ו דיספלסיה ויוו1,2. מחקרים אלה מצאו שאת פי מתאים להפליא בתאים מאותו סוג בשלב זהה של בידול, אבל זה היא משתנה תוך תאי מעבר משלב אחד למשנהו. במקרים מסוימים, חוסמת חלקית את השינויים בפי פי משבש בידול, טוען כי השינוי שחל פי היא לא רק תוצאה של שינויים בגורל תא אבל במקום זה מסייע לקדם את השינוי בגורל תא, אולי דרך אפקטים על pH רגיש רגולטוריות חלבונים או התגובות הכימיות הדרושות עבור בידול. מחקרים עתידיים יש פוטנציאל כדי לחשוף עוד תובנות התפקידים השונים רבים של pHi dynamics ויוו. עם זאת, אחד האתגרים של הלומדים פי במהלך התמיינות ויוו הוא קבלת מדידות מדויקות של פי פי. שלא כמו תכונות אחרות של בידול, כגון שינויים מורפולוגיה הסלולר וכן ביטוי גנים, pHi הוא נכס כימי יציב של התא זה אינו נשמר בתאים קבוע, permeabilized בשיטות הרגילות. בנוסף, פי ייתכן יציב בתאים לחוצה או גוסס כתוצאה מניפולציה ניסויית. לכן חשוב לשמור תאים חי ובריא ככל האפשר כאשר מודדים את פי. מספר צבעי חיוני זמינות עבודה טוב עבור מדידה על פי של תאים תרבות3, אבל ברבות המקרים הם אינם מתאימים עבור ויוו מחקרים כי הם לא לחדור הרקמות עמוק או באופן שווה מספיק כדי לספק מדידות מדויקות .
כדי לעקוף את הבעיה של חדירה צבע עניים, אנחנו ואחרים השתמשו בדיקה גנטית מקודד, mCherry::pHluorin4,5,6,7, זה יכול לבוא לידי ביטוי במיוחד בתא סוגים של הדמיה של רקמת חיים ועניין. pHluorin הוא וריאציה של GFP עם pKa גבוה יותר (~ 7.0 לעומת ~ 4.0) זה מתקפל בקלות רבה יותר ב- pH גבוה יותר; אז עוצמת קרינה פלואורסצנטית הכולל הנפלטים אוכלוסייה של pHluorin מולקולות בתא עולה עם הגדלת פי8. חשוב, הוא ליניארי בטווח הנורמלי cytosolic פי ערכים. לעומת זאת, ידי קרינה פלואורסצנטית של mCherry (pKa ~ 4.5) חסר רגישות לשינויים pH בטווח cytosolic. אלה שני הכתבים covalently מקושרים ביחד כמו חלבון chimeric יחיד, מקודד על ידי מסגרת קריאה פתוחה יחיד, ולכן הם תמיד נוכחים בכמויות שוות. לכן, היחס בין pHluorin ל mCherry עוצמת קרינה פלואורסצנטית מספק מדידה על פי זה הוא מנורמל לריכוז בדיקה בכל תא. ניתן להמיר את היחס אז הערכות של פי ערכים באמצעות עיקול רגיל שנוצר על ידי השגת את pHluorin אל mCherry יחס רקמות זה יש כבר equilibrated לערכים הידועים pH.
כאן, אנו מתארים את שיטות השימוש mCherry::pHluorin כדי למדוד את פי של שושלת היוחסין FSC אפיתל בשחלה דרוזופילה . רקמת מאופיין היטב זה שימש לדגם היבטים שונים של ביולוגיה אפיתל, כגון תאי גזע התחדשות עצמית ובידול9,10,11, נדידת תאים קולקטיבית12 , ולא פיתוח ותחזוקה של התא קוטביות13,14. האפיתל זקיק מופק על ידי שני FSCs אשר שוכנים בקצה הקדמי של הרקמה במבנה הנקרא ה15,germarium16. תאים אלה לחלק באופן קבוע במהלך הבגרות עצמית לחדש ולייצר רומא, שנקרא prefollicle תאים (pFCs), באפשרותך להזין מחדש את הנישה, הופכים FSC או להבדיל לאחד שלושה סוגי תאים שונים זקיק: קוטב תאים, התאים גבעול, או תאי הגוף הראשי זקיק. הראנו קודם לכן זה ברקמת wildtype, שפי עולה בהתמדה במהלך השלבים הראשונים של בידול, בין פי של 6.8 ב FSCs אל 7.0 ב pFCs, 7.3 התאים זקיק2. חסימת עלייה זו על ידי RNAi נוקאאוט של כאמצעי ביטוי ubiquitously נתרן/פרוטון חילופי, DNhe2, קשות פוגע בידול pFC, ואילו להגדיל פי על ידי ביטוי של DNhe2 גורם מתון הבחנה עודף פנוטיפ. ממצאים אלה מדגימים כי פי נשמרת stably בשושלת FSC מוקדם, כי זה יכול להיות השפעול מוגדל או מוקטן ויוו. ניתן להשתמש בשיטות המתוארות כאן כדי למדוד את פי wildtype רקמות או צורות שונות של רקמות מוטציה, לרבות RNAi נוקאאוט או ביטוי באמצעות של Gal4 של עניין, mitotic שיבוטים.
Protocol
Representative Results
Discussion
כאן, אנו מתארים שיטה למדידת על פי של תאים בשושלת FSC בתוך רקמת wildtype. פרוטוקול זה פותחה, מעודן בחמש השנים האחרונות, מאז אנחנו הראשונים החלו ללמוד פי ברקמת השחלה דרוזופילה . במהלך זמן זה, הפרוטוקול שימש בהצלחה על ידי מספר חוקרים במעבדה שלנו, על פחות ארבעה דיסק מסתובב שונים ועל סריקת מיקרוסק…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים Bryne Ulmschneider על תרומתה הפרוטוקול ואת מספרה דיאן לקבלת הצעות על כתב היד. עבודה זו מומן על ידי מכון הלאומי של בריאות גרנט GM116384 Nystul ת. ג, די. אל הספר.
Materials
| Fly Stocks | |||
| UAS-mCherry::pHluorin[1] | |||
| y1 w*;P{GawB}10930/CyO | Bloomington Stock Center | 7023 | |
| Act-Gal4 flipout stock | Bloomington Stock Center | 4409 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chemicals for Buffer preparation | |||
| NaCl | Sigma Aldrich | S5886 | |
| KCl | Sigma Aldrich | P-3911 | |
| glucose | Mallinckrodt | 4912 | |
| HEPES | Thermo Fisher Scientific | BP310 | |
| MgSO4 | Thermo Fisher Scientific | M63 | |
| CaCl2 | Sigma Aldrich | C-5080 | |
| HCO3 | Sigma Aldrich | S-5761 | |
| MgCl2 | Sigma Aldrich | M-9272 | |
| NMDG+ | Sigma Aldrich | M-2004 | |
| K2HPO4 | Mallinckrodt | 7088 | Use to Make KHPO4 pH 7.4 |
| KH2PO4 | Thermo Fisher Scientific | BP362 | Use to Make KHPO4 pH 7.4 |
| Concanavalin A, Alexa Fluor 647 Conjugate | Thermo Fisher Scientific | C21421 | 0.25 mg/ml dilution |
| Nigericin | Thermo Fisher Scientific | N1495 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dissection and mounting tools | |||
| 2 Dumont Inox forceps (Size 5) | Thermo Fisher Scientific | NC9473431 | |
| 2 23-gauge syringe needles | Sigma Aldrich | Z192457 | |
| 9-well glass dissecting dish | Thermo Fisher Scientific | 13-748B | |
| Vacuum Grease | Dow Corning | 1018817 | |
| 22 X 40 mM glass coverslips | Thermo Fisher Scientific | 12545C | |
| Round Glass Coverslips, 12mm diameter, 0.13-0.16mm thickness | Ted Pella, Inc. | 26023 | |
| 3-D mounting chamber | custom manufactured | .stl and .ipt files for 3-D printer included as supplemental files | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Other equipment | |||
| pH meter | Thermo Fisher Scientific | 13-620-183A | Model: Accumet AB15 |
| Dissection microscope | Olympus Corporation | 0H11436 | Model: SZ2-ST |
| Confocal Microscope | Leica Biosystems | SP5 or SP8 laser-scanning confocal microscope with a 40× objective with a numerical aperture of 1.3 |
References
- Grillo-Hill, B. K., Choi, C., Jimenez-Vidal, M., Barber, D. L. Increased H+ efflux is sufficient to induce dysplasia and necessary for viability with oncogene expression. eLife. 03270, (2015).
- Ulmschneider, B., Grillo-Hill, B. K., Benitez, M., Azimova, D. R., Barber, D. L., Nystul, T. G. Increased intracellular pH is necessary for adult epithelial and embryonic stem cell differentiation. J. Cell Biol. 215 (3), 345-355 (2016).
- Han, J., Burgess, K. Fluorescent Indicators for Intracellular pH. Chemical reviews. 110 (5), 2709-2728 (2010).
- Koivusalo, M., Welch, C., et al. Amiloride inhibits macropinocytosis by lowering submembranous pH and preventing Rac1 and Cdc42 signaling. J. Cell Biol. 188 (4), 547-563 (2010).
- Choi, C. -. H., Webb, B. A., Chimenti, M. S., Jacobson, M. P., Barber, D. L. pH sensing by FAK-His58 regulates focal adhesion remodeling. J. Cell Biology. 202 (6), 849-859 (2013).
- Rossano, A. J., Chouhan, A. K., Macleod, G. T. Genetically encoded pH-indicators reveal activity-dependent cytosolic acidification of Drosophila motor nerve termini in vivo. J. Phys. 591 (7), 1691-1706 (2013).
- Grillo-Hill, B. K., Webb, B. A., Barber, D. L. Ratiometric imaging of pH probes. Methods in Cell Biol. 123, 429-448 (2014).
- Miesenböck, G., De Angelis, D. A., Rothman, J. E. Visualizing secretion and synaptic transmission with pH-sensitive green fluorescent proteins. Nature. 394 (6689), 192-195 (1998).
- Kirilly, D., Xie, T. The Drosophila ovary: an active stem cell community. Cell research. 17 (1), 15-25 (2007).
- Sahai-Hernandez, P., Castanieto, A., Nystul, T. G. Drosophila models of epithelial stem cells and their niches. Wiley interdisciplinary reviews. Dev. Biol. 1 (3), 447-457 (2012).
- Losick, V. P., Morris, L. X., Fox, D. T., Spradling, A. Drosophila stem cell niches: a decade of discovery suggests a unified view of stem cell regulation. Dev. Cell. 21 (1), 159-171 (2011).
- Pocha, S. M., Montell, D. J. Cellular and molecular mechanisms of single and collective cell migrations in Drosophila: themes and variations. Ann Rev. of Gen. 48, 295-318 (2014).
- St Johnston, D., Ahringer, J. Cell polarity in eggs and epithelia: parallels and diversity. Cell. 141 (5), 757-774 (2010).
- Castanieto, A., Johnston, M. J., Nystul, T. G. EGFR signaling promotes self-renewal through the establishment of cell polarity in Drosophila follicle stem cells. eLife. 3, (2014).
- Margolis, J., Spradling, A. Identification and behavior of epithelial stem cells in the Drosophila ovary. Development. 121 (11), 3797-3807 (1995).
- Nystul, T. G., Spradling, A. An epithelial niche in the Drosophila ovary undergoes long-range stem cell replacement. Cell stem cell. 1 (3), 277-285 (2007).
- Morris, L. X., Spradling, A. C. Long-term live imaging provides new insight into stem cell regulation and germline-soma coordination in the Drosophila ovary. Development. 138 (11), 2207-2215 (2011).
- Lee, T., Luo, L. Mosaic analysis with a repressible cell marker (MARCM) for Drosophila neural development. Trends in neuro. 24 (5), 251-254 (2001).
