Методы визуализации внутриклеточного рН линии фолликула стволовых клеток в живых тканей яичника дрозофилы
Summary
Мы предоставляем протокол для визуализации внутриклеточного рН линии эпителиальных стволовых клеток в живых тканей яичника дрозофилы . Мы описываем методы для создания трансгенных мух, выражая биосенсор рН, mCherry::pHluorin, изображение биосенсора с использованием количественных флуоресценции изображений, создания стандартных кривых и преобразовать значения интенсивности флуоресценции в значениях рН.
Abstract
Изменения в внутриклеточного рН (фи) играют важную роль в регуляции многих клеточных функций, в том числе метаболизма, пролиферации и дифференцировки. Как правило фи динамика определяются в культивируемых клеток, которые поддаются измерения и экспериментально манипулирования фи. Однако недавнее развитие новых инструментов и методологий, стало возможным для изучения динамики фи в пределах нетронутыми, живой ткани. Для исследования дрозофилы , важным событием стало поколение трансгенные линии, перевозящих биосенсор фи, mCherry::pHluorin. Здесь мы описываем протокол, который мы обычно используют для визуализации живой Drosophila ovarioles для измерения фи в линии эпителия фолликула стволовых клеток (FSC) в mCherry::pHluorin трансгенных дикого типа линий; Однако описанные здесь методы могут быть легко адаптированы для других тканей, включая крыло диски и глаз эпителия. Мы описываем методы для выражения mCherry::pHluorin в линии FSC, поддержания тканей яичника во время живых изображений и приобретения и анализ изображений для получения значений фи.
Introduction
Недавние исследования показали определенную роль для изменения в фи в клеточной дифференциации и Дисплазия в естественных условиях1,2. Эти исследования показали, что что фи удивительно последовательна в клетках того же типа на той же стадии дифференцировки, но что меняется как клетки переход от одной стадии к другой. В некоторых случаях блокировка изменения в фи частично разрушает дифференциации, предполагая, что изменения в фи является не только следствием изменения в ячейке судьба, но вместо этого помогает для содействия изменениям в судьбе ячейки, возможно, путем воздействия на рН чувствительных регулирования белки или химические реакции, необходимые для дифференциации. Будущие исследования имеют потенциал, чтобы выявить больше проницательность в много различных ролей фи динамика в естественных условиях. Однако одна из задач изучения pHi во время дифференциация в естественных условиях является получение точных измерений Пхи-Пхи. В отличие от других функций дифференциации, такие как изменения в клеточной морфологии и экспрессии генов фи является лабильным химические свойства ячейки, не сохраняется в клетках, которые были исправлены и permeabilized с стандартными методами. Кроме того фи не может быть стабильным в клетках, которые подчеркнули или умирают в результате экспериментальных манипуляций. Таким образом важно сохранить клетки жив и здоров, как возможно, когда измерения фи. Несколько жизненно важных красителей доступны, что работает хорошо для измерения фи клеток в культуре3, но во многих случаях они подходят не для в vivo исследований потому, что они не проникать в ткани, глубоко или равномерно достаточно, чтобы обеспечить точность измерений .
Чтобы обойти проблемы проникновения красителя бедных, мы и другие использовали генетически закодированный зонд, mCherry::pHluorin4,5,6,7, которое может быть выражено непосредственно в ячейке типы образов в живых тканей и интерес. pHluorin представляет собой вариант GFP с выше pKa (~ 7.0 против ~ 4.0), более легко складывается при более высоких значениях рН; Таким образом общая флуоресценции интенсивности испускаемого от населения pHluorin молекул в ячейке возрастает с увеличением фи8. Важно отметить, что флуоресценции линейной в нормальном цитозольной диапазоне значений фи. В отличие от флуоресценции mCherry (pKa ~ 4.5) является нечувствительным к изменениям рН в цитозольной диапазоне. Эти два Репортеры ковалентно связаны вместе, как единый химерных белков, кодируемых одной открытой чтении кадра, поэтому они всегда присутствуют в равных количествах. Таким образом соотношение pHluorin к интенсивности флуоресценции mCherry обеспечивает измерение фи, нормируется зонд концентрации в каждой ячейке. Коэффициенты затем может быть преобразован оценкам фи значений с помощью стандартной кривой, создаваемый путем получения pHluorin mCherry коэффициенты из тканей, которые были достижение равновесного уровня, к известным рН.
Здесь мы описываем методы для использования mCherry::pHluorin для измерения фи линии эпителиальных FSC в яичнике дрозофилы . Это хорошо изученных ткани был использован для моделирования много различных аспектов эпителиальных биологии, например стволовых клеток самообновления и дифференциации9,10,11, коллективные клетки миграции12 , развития и поддержания клеток полярности13,14. Эпителий фолликула производится двумя FSCs, находящиеся у переднего края ткани в структуре, называемой germarium15,16. Эти клетки делятся регулярно во взрослом возрасте самостоятельно обновить и производят потомство, называемые prefollicle клетки (ПФУ), которые можно заново ввести нишу и стать FSC или дифференцироваться в один из трех типов клеток различных фолликул: полярные клетки, клетки стебля, или основные клетки фолликула. Мы показали ранее в wildtype ткани, pHi увеличивает устойчиво на ранних стадиях дифференцировки от Пхи примерно 6,8 в FSCs 7.0 в ПФУ, 7.3 в фолликул клетки2. Блокирование это увеличение RNAi нокдаун повсеместно выраженной натрия/Протон теплообменника, DNhe2, серьезно ухудшает ПФК дифференциации, тогда как увеличивая Сверхэкспрессия DNhe2 фи вызывает мягкая избыток дифференциация фенотип. Эти результаты демонстрируют фи стабильно сохраняется в начале линии FSC и что это может быть экспериментально увеличивается или уменьшается в естественных условиях. Методы, описанные здесь может использоваться для измерения фи в wildtype ткани или различные виды мутантов тканей, включая RNAi нокдаун или гиперэкспрессия с помощью Gal4 интерес, и митотического клонов.
Protocol
Representative Results
Discussion
Здесь мы описываем метод измерения фи клеток в FSC линии в wildtype ткани. Этот протокол разработаны и усовершенствованы за последние пять лет, поскольку мы впервые начали учиться фи в дрозофилы тканей яичника. В это время протокол успешно используется несколько следователей в нашей ла?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарим Bryne Ulmschneider за вклад в протокол и Диана Парикмахерская для предложения на рукопись. Эта работа финансировалась национального института здравоохранения грант GM116384 Nystul т.г. и парикмахерская Д.Л.
Materials
| Fly Stocks | |||
| UAS-mCherry::pHluorin[1] | |||
| y1 w*;P{GawB}10930/CyO | Bloomington Stock Center | 7023 | |
| Act-Gal4 flipout stock | Bloomington Stock Center | 4409 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chemicals for Buffer preparation | |||
| NaCl | Sigma Aldrich | S5886 | |
| KCl | Sigma Aldrich | P-3911 | |
| glucose | Mallinckrodt | 4912 | |
| HEPES | Thermo Fisher Scientific | BP310 | |
| MgSO4 | Thermo Fisher Scientific | M63 | |
| CaCl2 | Sigma Aldrich | C-5080 | |
| HCO3 | Sigma Aldrich | S-5761 | |
| MgCl2 | Sigma Aldrich | M-9272 | |
| NMDG+ | Sigma Aldrich | M-2004 | |
| K2HPO4 | Mallinckrodt | 7088 | Use to Make KHPO4 pH 7.4 |
| KH2PO4 | Thermo Fisher Scientific | BP362 | Use to Make KHPO4 pH 7.4 |
| Concanavalin A, Alexa Fluor 647 Conjugate | Thermo Fisher Scientific | C21421 | 0.25 mg/ml dilution |
| Nigericin | Thermo Fisher Scientific | N1495 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dissection and mounting tools | |||
| 2 Dumont Inox forceps (Size 5) | Thermo Fisher Scientific | NC9473431 | |
| 2 23-gauge syringe needles | Sigma Aldrich | Z192457 | |
| 9-well glass dissecting dish | Thermo Fisher Scientific | 13-748B | |
| Vacuum Grease | Dow Corning | 1018817 | |
| 22 X 40 mM glass coverslips | Thermo Fisher Scientific | 12545C | |
| Round Glass Coverslips, 12mm diameter, 0.13-0.16mm thickness | Ted Pella, Inc. | 26023 | |
| 3-D mounting chamber | custom manufactured | .stl and .ipt files for 3-D printer included as supplemental files | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Other equipment | |||
| pH meter | Thermo Fisher Scientific | 13-620-183A | Model: Accumet AB15 |
| Dissection microscope | Olympus Corporation | 0H11436 | Model: SZ2-ST |
| Confocal Microscope | Leica Biosystems | SP5 or SP8 laser-scanning confocal microscope with a 40× objective with a numerical aperture of 1.3 |
References
- Grillo-Hill, B. K., Choi, C., Jimenez-Vidal, M., Barber, D. L. Increased H+ efflux is sufficient to induce dysplasia and necessary for viability with oncogene expression. eLife. 03270, (2015).
- Ulmschneider, B., Grillo-Hill, B. K., Benitez, M., Azimova, D. R., Barber, D. L., Nystul, T. G. Increased intracellular pH is necessary for adult epithelial and embryonic stem cell differentiation. J. Cell Biol. 215 (3), 345-355 (2016).
- Han, J., Burgess, K. Fluorescent Indicators for Intracellular pH. Chemical reviews. 110 (5), 2709-2728 (2010).
- Koivusalo, M., Welch, C., et al. Amiloride inhibits macropinocytosis by lowering submembranous pH and preventing Rac1 and Cdc42 signaling. J. Cell Biol. 188 (4), 547-563 (2010).
- Choi, C. -. H., Webb, B. A., Chimenti, M. S., Jacobson, M. P., Barber, D. L. pH sensing by FAK-His58 regulates focal adhesion remodeling. J. Cell Biology. 202 (6), 849-859 (2013).
- Rossano, A. J., Chouhan, A. K., Macleod, G. T. Genetically encoded pH-indicators reveal activity-dependent cytosolic acidification of Drosophila motor nerve termini in vivo. J. Phys. 591 (7), 1691-1706 (2013).
- Grillo-Hill, B. K., Webb, B. A., Barber, D. L. Ratiometric imaging of pH probes. Methods in Cell Biol. 123, 429-448 (2014).
- Miesenböck, G., De Angelis, D. A., Rothman, J. E. Visualizing secretion and synaptic transmission with pH-sensitive green fluorescent proteins. Nature. 394 (6689), 192-195 (1998).
- Kirilly, D., Xie, T. The Drosophila ovary: an active stem cell community. Cell research. 17 (1), 15-25 (2007).
- Sahai-Hernandez, P., Castanieto, A., Nystul, T. G. Drosophila models of epithelial stem cells and their niches. Wiley interdisciplinary reviews. Dev. Biol. 1 (3), 447-457 (2012).
- Losick, V. P., Morris, L. X., Fox, D. T., Spradling, A. Drosophila stem cell niches: a decade of discovery suggests a unified view of stem cell regulation. Dev. Cell. 21 (1), 159-171 (2011).
- Pocha, S. M., Montell, D. J. Cellular and molecular mechanisms of single and collective cell migrations in Drosophila: themes and variations. Ann Rev. of Gen. 48, 295-318 (2014).
- St Johnston, D., Ahringer, J. Cell polarity in eggs and epithelia: parallels and diversity. Cell. 141 (5), 757-774 (2010).
- Castanieto, A., Johnston, M. J., Nystul, T. G. EGFR signaling promotes self-renewal through the establishment of cell polarity in Drosophila follicle stem cells. eLife. 3, (2014).
- Margolis, J., Spradling, A. Identification and behavior of epithelial stem cells in the Drosophila ovary. Development. 121 (11), 3797-3807 (1995).
- Nystul, T. G., Spradling, A. An epithelial niche in the Drosophila ovary undergoes long-range stem cell replacement. Cell stem cell. 1 (3), 277-285 (2007).
- Morris, L. X., Spradling, A. C. Long-term live imaging provides new insight into stem cell regulation and germline-soma coordination in the Drosophila ovary. Development. 138 (11), 2207-2215 (2011).
- Lee, T., Luo, L. Mosaic analysis with a repressible cell marker (MARCM) for Drosophila neural development. Trends in neuro. 24 (5), 251-254 (2001).
