Metoder til billeddannelse intracellulære pH af follikel stamcelle afstamning i Live Drosophila æggestokkene væv
Summary
Vi leverer en protokol for imaging intracellulære pH af en epitel stamcelle afstamning i live Drosophila æggestokkene væv. Vi beskriver metoder til at generere transgene fluer udtrykker en pH biosensor, mCherry::pHluorin, billede biosensor ved hjælp af kvantitative fluorescens imaging, generere standard kurver og konvertere fluorescens intensitetsværdierne til pH-værdier.
Abstract
Ændringer i intracellulære pH (pHi) spille en vigtig rolle i reguleringen af mange cellulære funktioner, herunder metabolisme, spredning og differentiering. Typisk, pHi dynamics bestemmes i kulturperler celler, som er indstillet til måling og eksperimentelt manipulere pHi. Den seneste udvikling af nye værktøjer og metoder har dog gjort det muligt at studere pHi dynamikken i intakt, levende væv. For Drosophila forskning, en vigtig udvikling var generation af en genetisk modificeret linje transporterer en pHi biosensor, mCherry::pHluorin. Her, beskriver vi en protokol, der vi rutinemæssigt brug for billeddiagnostiske live Drosophila ovarioles til at måle pHi i epitelial follikel stamceller (FSC) slægt i mCherry::pHluorin transgene vildtype linjer; de metoder, der beskrives her kan dog let tilpasses til andre væv, herunder wing diske og øjet epitel. Vi beskriver teknikker til at udtrykke mCherry::pHluorin i FSC afstamning, opretholde æggestokkene væv under live imaging, og erhverve og analysere billeder for at få pHi værdier.
Introduction
Nylige undersøgelser afslørede en rolle for ændringer i pHi under cellulære differentiering og dysplasi i vivo1,2. Disse undersøgelser fandt at pHi er bemærkelsesværdigt konsekvent i celler af samme type på den samme fase af differentiering, men at det ændrer som celler overgangen fra én fase til en anden. I nogle tilfælde forstyrrer blokerer ændringer i pHi delvist differentiering, tyder på, at ændringen i pHi er ikke blot en konsekvens af ændringer i celle skæbne, men i stedet bidrager til at fremme ændringer i celle skæbne, måske gennem effekter på pH-følsom regulerende proteiner eller kemiske reaktioner påkrævet for differentiering. Fremtidige undersøgelser har potentiale til at afsløre mere indsigt i de mange forskellige roller i pHi dynamics i vivo. En af udfordringerne ved at studere pHi under differentiering i vivo er imidlertid at få nøjagtige målinger af pHi. I modsætning til andre funktioner af differentiering, såsom ændringer i cellulære morfologi og genekspression, er pHi labile kemisk egenskab for den celle, der ikke er bevaret i celler, der har været fast og permeabilized med standardmetoder. Derudover kan pHi ikke være stabil i celler, der er stresset eller døende som følge af eksperimentel manipulation. Det er således vigtigt at holde celler i live og så sunde som muligt når måling pHi. Flere vitale farvestoffer findes at arbejde godt for måling pHi af celler i kultur3, men i mange tilfælde de ikke egner sig til i vivo undersøgelser, fordi de ikke trænge ind i vævet dybt eller jævnt nok til at give nøjagtige målinger .
For at omgå problemet med dårlig farvestof penetration, har vi og andre brugt en genetisk kodet sonde, mCherry::pHluorin4,5,6,7, der kan udtrykkes konkret i cellen typer af interesse og afbildet i levende væv. pHluorin er en variant af normal god landbrugspraksis med en højere pKa (~ 7.0 vs. ~ 4.0), folder mere let på højere pH; så samlede fluorescens-intensiteten udsendes fra en befolkning på pHluorin molekyler i cellen stiger med stigende pHi8. Vigtigere, er fluorescens lineær i det cytosole normalområdet af pHi værdier. I kontrast, fluorescens af mCherry (pKa ~ 4,5) er ufølsom over for pH-ændringer inden for det cytosole interval. Disse to journalister er kovalent knyttet sammen som en enkelt kimære protein, kodet af en enkelt åben behandling ramme, så de er altid til stede i lige store mængder. Derfor, forholdet mellem pHluorin til mCherry fluorescens intensitet giver en måling af pHi, der er normaliseret til koncentrationen af sonden i hver celle. Nøgletal kan derefter konverteres til skøn over pHi værdier ved hjælp af en standardkurve, der er genereret af anskaffelse af pHluorin til mCherry nøgletal fra væv, der har været ekvilibreres til kendte pH-værdier.
Her, beskriver vi metoder til at bruge mCherry::pHluorin til at måle pHi af epitel FSC slægt i Drosophila æggestokken. Denne godt karakteriseret væv er blevet brugt til at modellere mange forskellige aspekter af epithelial biology, såsom stamcelle selvfornyelse og differentiering9,10,11, kollektive celle migration12 , samt udvikling og vedligeholdelse af celle polaritet13,14. Follikel epitel er produceret af to FSCs, der er placeret på den forreste kant af væv i en struktur kaldet germarium15,16. Disse celler deler sig regelmæssigt i voksenalderen selv forny og producere afkom, kaldet prefollicle celler (PFC), der kan enten genindtræde niche og blive en FSC eller differentiere i en af tre forskellige follikel celletyper: polar celler, stilk celler, eller hoveddelen follicle celler. Vi viste tidligere, i vildtype væv, pHi stiger støt i de tidlige stadier af differentiering, fra en pHi af ca 6,8 i FSCs 7.0 i PFC, 7.3 i follicle celler2. Blokerer denne stigning af RNAi knockdown af en allestedsnærværende udtrykt natrium/proton varmeveksler, DNhe2, alvorligt svækker pFC differentiering, der henviser til, at øge pHi ved overekspression af DNhe2 forårsager en mild overskydende differentiering fænotype. Disse resultater viser at pHi bevares stabilt i den tidlige FSC afstamning, og at det kan være eksperimentelt steget eller faldet i vivo. De metoder, der beskrives her kan bruges til at måle pHi i enten vildtype væv eller forskellige former for mutant væv, herunder RNAi knockdown eller overekspression ved hjælp af en Gal4 af interesse og mitotiske kloner.
Protocol
Representative Results
Discussion
Her, beskriver vi en metode til måling af pHi af celler i FSC afstamning i vildtype væv. Denne protokol er blevet udviklet og raffineret i de seneste fem år, siden vi først begyndte at studere pHi i Drosophila æggestokkene væv. I løbet af denne tid, har protokollen været anvendt med succes af flere efterforskere i vores laboratorium og på mindst fire forskellige spinning disc og laser scanning mikroskoper. Reproducerbarhed af vores oprindelige observation, at pHi stigninger som celler i FSC afstamning d…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker Bryne Ulmschneider for bidrag til protokollen og Diane Barber for forslag om håndskriftet. Dette arbejde blev finansieret af en National Institute of Health grant GM116384 TG Nystul og D.L. Barber.
Materials
| Fly Stocks | |||
| UAS-mCherry::pHluorin[1] | |||
| y1 w*;P{GawB}10930/CyO | Bloomington Stock Center | 7023 | |
| Act-Gal4 flipout stock | Bloomington Stock Center | 4409 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chemicals for Buffer preparation | |||
| NaCl | Sigma Aldrich | S5886 | |
| KCl | Sigma Aldrich | P-3911 | |
| glucose | Mallinckrodt | 4912 | |
| HEPES | Thermo Fisher Scientific | BP310 | |
| MgSO4 | Thermo Fisher Scientific | M63 | |
| CaCl2 | Sigma Aldrich | C-5080 | |
| HCO3 | Sigma Aldrich | S-5761 | |
| MgCl2 | Sigma Aldrich | M-9272 | |
| NMDG+ | Sigma Aldrich | M-2004 | |
| K2HPO4 | Mallinckrodt | 7088 | Use to Make KHPO4 pH 7.4 |
| KH2PO4 | Thermo Fisher Scientific | BP362 | Use to Make KHPO4 pH 7.4 |
| Concanavalin A, Alexa Fluor 647 Conjugate | Thermo Fisher Scientific | C21421 | 0.25 mg/ml dilution |
| Nigericin | Thermo Fisher Scientific | N1495 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dissection and mounting tools | |||
| 2 Dumont Inox forceps (Size 5) | Thermo Fisher Scientific | NC9473431 | |
| 2 23-gauge syringe needles | Sigma Aldrich | Z192457 | |
| 9-well glass dissecting dish | Thermo Fisher Scientific | 13-748B | |
| Vacuum Grease | Dow Corning | 1018817 | |
| 22 X 40 mM glass coverslips | Thermo Fisher Scientific | 12545C | |
| Round Glass Coverslips, 12mm diameter, 0.13-0.16mm thickness | Ted Pella, Inc. | 26023 | |
| 3-D mounting chamber | custom manufactured | .stl and .ipt files for 3-D printer included as supplemental files | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Other equipment | |||
| pH meter | Thermo Fisher Scientific | 13-620-183A | Model: Accumet AB15 |
| Dissection microscope | Olympus Corporation | 0H11436 | Model: SZ2-ST |
| Confocal Microscope | Leica Biosystems | SP5 or SP8 laser-scanning confocal microscope with a 40× objective with a numerical aperture of 1.3 |
References
- Grillo-Hill, B. K., Choi, C., Jimenez-Vidal, M., Barber, D. L. Increased H+ efflux is sufficient to induce dysplasia and necessary for viability with oncogene expression. eLife. 03270, (2015).
- Ulmschneider, B., Grillo-Hill, B. K., Benitez, M., Azimova, D. R., Barber, D. L., Nystul, T. G. Increased intracellular pH is necessary for adult epithelial and embryonic stem cell differentiation. J. Cell Biol. 215 (3), 345-355 (2016).
- Han, J., Burgess, K. Fluorescent Indicators for Intracellular pH. Chemical reviews. 110 (5), 2709-2728 (2010).
- Koivusalo, M., Welch, C., et al. Amiloride inhibits macropinocytosis by lowering submembranous pH and preventing Rac1 and Cdc42 signaling. J. Cell Biol. 188 (4), 547-563 (2010).
- Choi, C. -. H., Webb, B. A., Chimenti, M. S., Jacobson, M. P., Barber, D. L. pH sensing by FAK-His58 regulates focal adhesion remodeling. J. Cell Biology. 202 (6), 849-859 (2013).
- Rossano, A. J., Chouhan, A. K., Macleod, G. T. Genetically encoded pH-indicators reveal activity-dependent cytosolic acidification of Drosophila motor nerve termini in vivo. J. Phys. 591 (7), 1691-1706 (2013).
- Grillo-Hill, B. K., Webb, B. A., Barber, D. L. Ratiometric imaging of pH probes. Methods in Cell Biol. 123, 429-448 (2014).
- Miesenböck, G., De Angelis, D. A., Rothman, J. E. Visualizing secretion and synaptic transmission with pH-sensitive green fluorescent proteins. Nature. 394 (6689), 192-195 (1998).
- Kirilly, D., Xie, T. The Drosophila ovary: an active stem cell community. Cell research. 17 (1), 15-25 (2007).
- Sahai-Hernandez, P., Castanieto, A., Nystul, T. G. Drosophila models of epithelial stem cells and their niches. Wiley interdisciplinary reviews. Dev. Biol. 1 (3), 447-457 (2012).
- Losick, V. P., Morris, L. X., Fox, D. T., Spradling, A. Drosophila stem cell niches: a decade of discovery suggests a unified view of stem cell regulation. Dev. Cell. 21 (1), 159-171 (2011).
- Pocha, S. M., Montell, D. J. Cellular and molecular mechanisms of single and collective cell migrations in Drosophila: themes and variations. Ann Rev. of Gen. 48, 295-318 (2014).
- St Johnston, D., Ahringer, J. Cell polarity in eggs and epithelia: parallels and diversity. Cell. 141 (5), 757-774 (2010).
- Castanieto, A., Johnston, M. J., Nystul, T. G. EGFR signaling promotes self-renewal through the establishment of cell polarity in Drosophila follicle stem cells. eLife. 3, (2014).
- Margolis, J., Spradling, A. Identification and behavior of epithelial stem cells in the Drosophila ovary. Development. 121 (11), 3797-3807 (1995).
- Nystul, T. G., Spradling, A. An epithelial niche in the Drosophila ovary undergoes long-range stem cell replacement. Cell stem cell. 1 (3), 277-285 (2007).
- Morris, L. X., Spradling, A. C. Long-term live imaging provides new insight into stem cell regulation and germline-soma coordination in the Drosophila ovary. Development. 138 (11), 2207-2215 (2011).
- Lee, T., Luo, L. Mosaic analysis with a repressible cell marker (MARCM) for Drosophila neural development. Trends in neuro. 24 (5), 251-254 (2001).
