Summary
この記事は、ひと胎児脳神経幹細胞文化だけでなく、様々 な神経細胞やアストロ サイト、ジカ ウイルス感染症を研究する神経幹細胞の使用に重点を置いてにそれらを区別する方法を展開に使用する方法を詳しく説明します。
Abstract
人間の胎児脳神経幹細胞は、人間発達神経生物学の様々 な刺激の影響を研究するユニークな非遺伝子組み換えモデル システムです。むしろ動物モデルまたは遺伝子組み換え多能性細胞を使用するよりも、ひと神経幹細胞は画面薬治療の効果を調べたり、個体差を調べるに効果的な培養システムを提供します。ここでは、様々 な神経細胞やアストロ サイト別プライミング手続きにそれらを区別するために、凍結、回収する、無血清のメディアと文化における人間の胎児脳神経幹細胞を展開に使用する方法について詳細なプロトコルを提供します。これらの細胞。さらに、我々 はジカ ウイルス感染症を勉強する人間の胎児脳神経幹細胞を使用する手順をについて説明します。
Introduction
ジカ (ZIKV) は、性的、または蚊ベクトルネッタイシマカとヒトスジシマカ蚊によって媒介するフラビです。ZIKV は、伝送の容易さのための深刻な公衆衛生の脅威として最近確認され、神経学的症状1を提携します。最も感染妊婦2,3に生まれた胎児の小頭症の開発は、神経学的な影響に関する。小頭症は胎児開発の間に、平均4以下の 2 標準偏差以下のまわりで、出生時、頭は一般的なサイズより小さい神経発達障害です。小さい頭囲ではさまざまな発達の遅れ、発作、ビジョンと難聴、摂食困難など併存疾患一般的が伴われます。
最近の研究は、動物モデルを使用か、誘導多能性幹細胞神経発達5,6,7,8ZIKV 感染症の影響を研究します。これらの研究は、ZIKV、別の種の使用の私達の知識に貢献している、または遺伝子組み換え細胞が時間がかかるかに ZIKV の効果を混同するかもしれない追加の変数を追加5,細胞の神経の開発6,7,8します。 ただし、hNSC 文化、このプロトコルで記述されている非付着 neurosphere 文化特にの難点は、文化は文化9を実施する使用される方法に非常に敏感です。メディア コンポーネント、または培養器の物理的な処理も変更は9セルから反応を引き出すのに十分です。これらの問題に対処するため、胎児の神経幹細胞に及ぼす ZIKV を機械論的に尋問するの in vitroひと胎児脳由来神経幹細胞 (hNSCs) 文化を開発しました。私たちのメソッドを使用して、hNSCs なく表現型変化10以上 80 通路維持されました。さらに、トリソミーなどの染色体の変化がいずれまたは最小11。この hNSC 文化は、非付着 neurosphere 文化として育ちます。神経幹細胞の利点の 1 つは球が二次元文化9に比べて生体内でニッチのより多くの反射は文化のユニークなニッチな環境を作成します。このプロトコルの別の利点は、複数の細胞のタイプから派生できる hNSC 文化 hNSC 生存と分化に関する特定の変数の影響を観察する研究者を有効にします。このプロトコルは、中枢神経系発達や障害に関する機構の質問に答えるために見ている個人に適用されます。次のプロトコルは、ZIKV に感染し、その後分化過程で感染の影響を観察する hNSCs を区別する hNSC 文化を展開する方法について説明します。様々 な種類の脳奇形11に貢献する ZIKV による障害の調査を進めるニューロンに hNSCs を区別するために長期的な使用のための hNSCs を格納するメソッドも含まれています。このプロトコルはまた感染や神経幹細胞の生存と分化の毒素など任意の環境の刺激の影響を理解しようとする研究者を対象と考えています。
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Protocol
ひと神経幹細胞が最初の学期12で捨てられた人間胎児皮質に由来。すべてのプロトコル プロシージャ人間組織サンプルの使用に関するテキサス大学医学部倫理ガイドラインに従うし、細胞株は機関のバイオ セーフティ委員会によって承認されました。
1. 在庫中の準備と幹細胞回復
- 手順 1.1.1.-1.1.5 で試薬を組み合わせることにより培株式 (DFHGPS) を準備します。
- 高グルコースとダルベッコ変更イーグル培地および L-グルタミン (D) の 210 mL を追加します。4 ° C で保管してください。
- L - グルタミン (F) とハムの F12 栄養ミックス 70 mL を追加します。4 ° C で保管してください。
- 4.2 mL 15 mM の追加 HEPES 緩衝液 (H) し、常温で保存します。
- 4.2 mL の 10% を追加 D グルコース溶液 (G) し、常温で保存します。
- ペニシリン/ストレプトマイシン (PS) ソリューションの 2.88 mL を追加.因数に 3 ml 原液-20 ° c まで必要な因数を格納とします。
注: メディアのペニシリンの最終濃度 100 単位/ml になります、ストレプトマイシンの濃度が 100 μ g/mL になります。この媒体はプロトコルの残りのための DFHGPS と呼ばれるが、1-2 週間以内の使用のための 4 ° C で保存する必要があります。必要な場合、DFHGPS はそれに比例してスケール アップがあります。
- 一日前に細胞が回復、馴化培地 5 mL を T75 フラスコをコート、hNSC セルラインの前の文化から得られる、8.5% 二酸化炭素 (CO2) 37 ° C の定温器のまま一晩します。
注: hNSCs を現在養殖は、中型の変更中に細胞を成長している媒体を保存します。これは、それ調節されている""細胞馴化培地です。馴化培地をスクリュー キャップ チューブに保存され、7 日間約 4 ° C で保存することができます。HNSCs を受信する対応する作成者に問い合わせてください。馴化培地は絶対に必須ではありません、特に hNSCs の文化を初めて開始するときが好まれるです。 - 回復の日 20 mL DFHGPS の少なくとも 10 分の 37 ° C の水浴中 50 mL スクリュー キャップ チューブ内を暖かい水のバスでを使用する準備ができるまで保管してください。
- 別 15 mL スクリュー キャップ チューブ 10 mL DFHGPS の少なくとも 10 分の 37 ° C の水浴中に暖かいし、1.13 のステップで使用する準備ができるまで風呂の水にそれを維持します。
- 氷の中のすべてのコンポーネント (表 1) コンテナーを取得します。氷の上のすべてのメディア コンポーネントを解凍し、中型の変更の準備中に氷の上にそれらを残します。
- (4 ° C で保存) エアコンの中の株式の 5 mL を取得し、37 ° C の水浴中 1.14 のステップで使用する準備ができるまで維持します。エアコン中または現在ひと胎児神経幹細胞文化がない場合ステップ 1.2 の後の注を参照してください。
- 手順 1.3 から 50 mL スクリュー キャップ チューブを取得し、それをバイオ セーフティ キャビネット (BSC)。新しい 15 mL スクリュー キャップ チューブに DFHGPS の 10 mL を転送し、37 ° C の水浴中残り 10 mL DFHGPS 媒体のバックアップを含む 50 mL チューブ。
- 液体窒素中で保存されている hNSCs の低温瓶を入手します。現在の人間の胎児神経幹細胞文化はない場合手順 1.2 後注を参照してください。
注: ひと神経幹細胞が、もともと捨てられた人間の胎児脳12から派生し、文化遺伝の修正10なしで維持します。5 × 10 の6セルを解凍、T75 フラスコにメッキする必要があります。各低温バイアル 5 × 106セルを含める必要があります。したがって、1 バイアルあたりフラスコが必要です。 - すべて 10 バイアルを反転で 37 ° C の水浴中細胞のバイアルを解凍 s 約 1 分または氷が溶け、バイアルの内容が完全に液体まで。潜在的な汚染を避けるために水の下で全体のバイアルを漬けないでください。
- BSC、P1000 のマイクロ ピペットを使用して、解凍細胞液を吸引し、ステップ、1.7 DFHGPS 10 ml から 15 mL チューブに drop-wise 追加。解凍のセルを追加するには、ソリューション drop-wise、ゆっくりと押し下げてプランジャーだけドロップまたは 2 つが一度に解放されるようにします。一方、簡単な混合物を許可する 15 mL チューブを旋回します。
- 室温で 5 分間 200 x g で細胞懸濁液を遠心します。細胞ペレットを保持することを確かめる、上澄みを廃棄します。
- ステップ 1.11 の間に 1.7 のステップから残り 10 ml、50 mL のチューブを取得します。遠心分離後、再停止しなさい細胞ペレット 10 mL DFHGPS と遠心分離機で再び部屋の温度で 5 分間 200 x g で。
- 最後のスピン中に BSC 手順 1.4 (表 1) から DFHGPS 培地 10 mL に成長因子を追加する次の表 1による新しい成長媒体を準備します。使用する準備ができるまで、BSC の成長因子を含む新しい媒体を残します。
- ステップ 1.2 から T75 フラスコを取得し、馴化培地フラスコを吸引によりコーティングを破棄します。1.6 のステップからエアコン メディアの 5 mL を加えます。フラスコに血清ピペットを使用します。フラスコの底に傷を付けないように注意します。
- 遠心分離機からセルのチューブを取得し、細胞ペレットをそのまま残し、それを吸引して上澄みを廃棄します。
- 5 mL の血清ピペットを使用し、上下に数回ピペッティング ステップ 1.13 から新しいメディアの 10 mL の細胞ペレットを再懸濁します。ステップ 1.14 からコート T75 フラスコに懸濁液を追加します。細胞ペレットを含まれている管を洗浄する残り 5 mL を使用し、フラスコを同様にそれらの 5 mL を追加します。
- 3 回前後の T75 フラスコをロックすると、細胞がフラスコに均等に配分を確保します。フラスコのキャップが空気の流れを許可するように緩んでいることを確認します。光学顕微鏡で細胞を観察、ノートを作る、可能であれば画像を取る。
注: セルは、半透明と球状になります。確認がある場合セルを見て暗い、不透明、または非対称的な寄宿生としてこれは細胞死を示すことができます。また色は黄色になるメディアなど、任意の真菌や細菌汚染を見る。 - 8.5% CO2と 37 ° C の定温器で細胞のフラスコを配置します。
注: は、7.1 7.4 の範囲内にこの無血清培地の pH を維持するために、5.0% CO2の代わりに 8.5% を使用します。
2. hNSC 中型の変更
注: は、媒体ごとに 3-4 日を変更します。
- BSC をオンにし、70% エタノールで徹底的に掃除します。光学顕微鏡で細胞を観察します。
注: セルの外観にメモをして、球のサイズ。3 日後に回復や通路、細胞が一緒にクラスターし、非付着性細胞を形成し始めます。
注意: セルは、フラスコの底に付着、文化が早期分化を増加する細胞接着と細胞は幹の状態を維持することができないときに破棄される必要があります。フラスコ内でセルが多すぎますがある場合は、セルがの場合大きな球 (直径 2 mm 以上) を形成、球の中心のセルは培地で成長因子へのアクセスの不足のため区別するために開始されます。球直径 1 mm 以上が認められた場合、細胞は継代 (ステップ 3.1 3.22) をすることができます。 - 1.4 と 1.5 では、手順に従って、新鮮な培地 10 mL を準備 (1.13 の手順を参照してください)。
- チルト フラスコ側、フラスコの底に沈むに球ができます。
- 任意の細胞を吸引しないように世話、5 mL の血清ピペットを使用してプールの中の上部から 5 mL エアコン メディアを削除します。きれいな 15 mL チューブに調節されたメディアの 5 mL を配置します。
- もう一度慎重に、球を回避、フラスコからエアコン メディアの追加 5 mL を取り外し、同じ 15 mL チューブに 5 mL を入れます。
- ステップ 2.2 からエアコン メディアとフラスコ内で細胞の残り 5 mL に新しいメディアの 10 mL を追加します。フラット下枠をセットし、光学顕微鏡で細胞を観察します。
- それは細胞が馴化培地のコレクション中に吸気されて表示されている場合は、室温で 5 分間 100 x g で馴化培地をスピンします。再中断馴化培地 1 mL の下部に蓄積する細胞と培養用フラスコに追加します。
- 手順 2.5/2.6 4 ° C でエアコン未使用メディアの 10 mL を 15 mL スクリュー キャップ チューブに格納します。
- 1.17/1.18 の手順を繰り返します。
3. hNSC 通路
注: hNSCs は、通路 9-11 日ごと細胞は通常、倍加時間として成長する場合は約 3 日間13する必要があります。
- 新しいフラスコに、NSCs を拡大して、すべて新しいフラスコ ステップ 1.2 のようにコーティングしていることを確認します。
- ステップ 2.1 のように BSC をきれいにし 1.4 と 1.5 の手順を実施します。
- ステップ 1.13 のようにメディアを準備します。各 T75 フラスコ 10 mL の培地が必要です。複数の T75 フラスコ フラスコの数によるメディアの 10 mL を乗算します。
- ダルベッコ リン酸緩衝生理食塩水 (dPBS)、グルコース及び表 2のボリュームによると (トリプシン溶液) の 10 分間ウォーム アップする 37 ° C の水浴の場所 1 または 3 mL を準備します。この時点ではトリプシンや DNase を追加しないでください。DNase は、機械的又は化学的細胞解離により死んだ細胞から放出された任意の DNA を分解する必要があります。
注: 1 つは成長の 9-10 日後に T75 フラスコが継代があります約 30 × 106セル、5 × 106もともとフラスコに播種した場合。通常、10 × 10 の6セルの dPBS 溶液 1 mL を使用します。したがって、9 ~ 10 日後に継代 T75 フラスコ dPBS 溶液 3 mL が必要です。 - 場所きれいな小さなボートと検定フードで重量を量る。70% エタノールできれいにし、乾いた空気で乾燥約 5 分のためのフード。
注: 重量を量るボートが 3.17.1 の手順で使用されます。 - インキュベーターから継代するが、BSC に持って来る細胞のフラスコを取得します。メディア プールの下にシンクする細胞を優しくできるフラスコを傾けます。フラスコ内のメディアの約 15 mL です。
- 5 mL の部分 (すなわち5 mL + 5 mL) の約 10 mL の培地を削除します。「馴化培地」の"CM"というラベルの付いたきれいな 15 mL チューブにこの 10 mL の培地を配置します。フラスコ; メディアの残り 5 mL に定住したセルのいずれかを吸引しないように注意これらの細胞とメディアの 5 mL は、3.8 のステップを受けるでしょう。
- 3 mL (ステップ 3.7) から「CM」チューブからエアコンのメディアを取り出して、「トリプシン阻害剤ソリューション」というラベルの付いた 15 mL チューブにします。これは、3.12 の手順で使用されます。3 mL を除去した後は、"CM"チューブに残っている調節されたメディアの 7 mL です。"CM"チューブをステップ 3.9 まで置いておきます。
- メディアや T75 フラスコ内の残りのセルの 5 mL を削除し、「セル」というラベルの付いたきれいな 15 mL チューブに配置します。
- (ステップ 3.7.1) からエアコン メディアの 7 mL を含む"CM"チューブに乗り、5 mL の血清ピペットを使用してエアコン、メディアの 3.5 mL の部分で二回 T75 フラスコの底をすすいでください。各洗浄の後に、「セル」チューブに 3.5 mL の部分を配置します。この手順の目的は、T75 フラスコからすべての細胞 (細胞) を削除することです。
- 室温で 5 分間 100 x g で「セル」チューブを遠心します。セルが回転しながら 37 ° C の水浴から dPBS/グルコース溶液を入手し、トリプシン、表 2によると DNase の適切な量を追加します。
- 「セル」チューブが回転を停止したらすべて、馴化培地培養上清を削除し、"CM"管に転送します。
- 3.7.1 のステップから「トリプシン阻害剤ソリューション」というラベルの付いた管を取る。表 3に示されているトリプシンインヒビターのボリュームを追加します。トリプシン阻害剤溶液の同じボリュームを使用して、トリプシン溶液を使用しました。
- 必要になるまで、37 ° C の水浴のトリプシン阻害剤ソリューションを配置します。
- 15 mL チューブに細胞のペレットにトリプシン溶液を追加し、上下に約 5 mL のピペットでの 5-10 倍ピペットします。チューブのキャップを閉じ、37 ° C の水浴 5 分の間孵化させなさい。5 分後、セルの取得し、ピペットの上下に 5-10 回。その後、追加の 10 〜 15 分の 37 ° C の水浴中孵化させなさい。
- 最後の 5 分には、BSC にトリプシン阻害剤溶液を移動します。
- 2.14 のステップが完了したら、セルの取得し、球が完全に分離するまで上下に細胞をピペット (20-30 回)。トリプシン阻害剤溶液と上下に 10 回ピペットはすぐに追加します。解離細胞とトリプシン ・ インヒビターのこのソリューションは、「細胞懸濁液」と呼ばします。
- 以下の手順でセル中断のセルの数をカウントします。
- 小さな重さボートにトリパン ブルー予混合気 (dPBS の 0.4% トリパン ブルー、10 μ L の 5 μ L を含む) の 15 μ L をピペット、細胞懸濁液 5 μ L を追加します。上下に 3-5 回をピペットをミックスします。その後、ガラス基板で覆われている検定のいずれかの側にトリパン ブルー/細胞懸濁液の 10 μ L をピペットします。
- 光学顕微鏡で細胞を観察し、各 4 つのコーナーのグリッド内のセルの合計数をカウントします。一緒にこれらの数字を追加します。
- 反対側のカウントを繰り返し、一緒に 2 つの側面を平均します。
- この数を 10,000 mL ごとのセルの合計数を与えるために掛けます。セル中断のセルの合計数を計算するミリリットル数の合計がこの数値を掛けます。シード T75 フラスコあたり 500 万の細胞に細胞懸濁液のどれくらいのボリュームが必要を計算します。
注: 通常後 9-10 日、T75 が 25-30 × 106セル。したがって、すべてのセルを新しいフラスコに通過、5-6 フラスコの合計が必要です。 - 細胞懸濁液フラスコあたり 5 × 106セルを取得する各 T75 フラスコに 3.19 ステップで計算された量を追加します。ボリュームが 5 mL 未満の場合は、5 mL の合計に追加条件培地を追加します。新しい DFHGFPS メディア含まれている成長因子 (表 1) の 10 mL をフラスコに追加します。
- 1.17 と 1.18 の手順を繰り返し、フラスコ (これは細胞を継回数) 通路番号、フラスコ内のセルの数、日付セルの種類のラベルがあることを確認します。手順 4 から 9 に移動します。
- 種子、必要に応じて余分な細胞の密度で 1 つの T75 フラスコは一晩、フラスコあたり 30 × 106セルまでし、ステップ 4 によると次の日を凍結します。
4. hNSC フリーズおよび記憶
- 通過、翌日は、(ステップ 3.19 と 3.22) から凍結のため細胞を含むインキュベーターからフラスコを取得します。フラスコを傾斜し、フラスコと 15 の mL の管の場所からすべての媒体およびセルを削除します。5 分 216 x g でチューブを遠心分離します。
- 遠心分離の過程で凍結中 (表 4) を準備します。ごとに 5 × 106細胞は凍結培地 1 mL を準備します。細胞の数は、各フラスコに配置するセルの数を決定する際、3.19 の手順で定められました。この番号は一晩変更されません。
- セル名、通路番号、携帯番号、イニシャルと日付のラベルを低温保存する瓶を準備します。遠心分離の後吸引により上清を除去し、再 5 × 106セル/mL があるので、中を凍結で細胞ペレットを中断します。しっかりと分注 5 mL ピペット 1 mL/バイアルとシールを使用して (5 × 106細胞バイアルあたり)。
- 250 ml のイソプロパノール (イソプロパノールの交換につき 5 回の最大利用) の低温保存容器にバイアルを配置します。一晩、-80 ° C のフリーザーで保存し、液体窒素のタンクのストレージ ・ システムに転送。
5. めっき付着 hNSC 検証
- 継前に、の日 (ステップ 3.1 3.22) は清潔 BSC 手順 2.2 のように滅菌ガラス 12 mm coverslips 24 ウェルのプレートを入手します。
- 鉗子を使用して、プレートの各ウェルの底に単一 coverslip を配置します。
- 滅菌水でカバー スリップ 0.01% ポリ D リジン (PDL) を含む井戸をコートし、37 ° C で 1 時間インキュベートします。24 ウェル プレートのウェルあたり PDL の 250 μ L を使用します。
- 、井戸から PDL を削除し、1 μ g/cm2ラミニン/dPBS (250 μ L/ウェル) とコートします。37 ° C で一晩プレートを孵化させなさいいない場合は必要な次の日はパラフィルム プレートのエッジの周りをラップすることによって板パラフィルムを封印し、4 ° C で保存
注: ラミニンをコーティングしたプレートに格納できる 2 週間カバー スリップが乾燥しない限り、パラフィルムでシールされている場合。 - 通路のセルとして 3.1-3.22 の手順の説明し、コーティング coverslips 24 ウェル プレートにシードするセルの数を決定します。
- 吸引、による井戸から任意の余分なラミニン ソリューションを削除し、濯ぎ 1 回 0.5 ml の dPBS の。0.6-1 x 105セル/cm2ウェルあたりの密度で井戸に細胞を播きます。3.16 3.21 の手順に従って残りのセルを使用します。
- 24 ウェル プレート培養中に修学時間を修正し、次のステップ 9 さまざまな幹細胞マーカーの細胞を染色します。
6. プライミング GABA およびグルタミン酸ニューロンを取得するには
- 3.1 バージョン 3.22、前述の細胞を通過し、ステップ 5.6 のように 24 ウェル プレートにシードするセルの数を決定します。
- プライミング、前日準備コート プレート手順 5.1 5.4 で説明したよう、カバー スリップ。
- プライミングの日に 2-3 日セルを含むフラスコを取得します。15 mL チューブに配置し、5 分 100 × g で遠心分離によって細胞のペレットします。
- 表 5によると表皮成長因子/白血病抑制因子/ラミニン (エル) プライミング メディアを準備します。
- エル培地で細胞を再懸濁します。
- 種子は、24 ウェル プレート (フォロー ステップ 5.6) に細胞を中断しました。
7. 運動ニューロンを取得するプライミング
- 6.1 6.4 の手順に従います。
- 表 6によると塩基性繊維芽細胞増殖因子/ヘパリン/ラミニン (FHL) プライミング メディアを準備します。
- 5.6 の手順に従ってください。
8. ジカ ウイルス感染
注: ZIKV は温度に非常に敏感、ZIKV ストック-80 ° C および凍結/解凍サイクルを格納されている命令を回避です。氷の上の因数を働き続けます。
- 3.1 3.22 の手順で説明するように細胞を通過。合計で 300 万の細胞は、感染に必要な継フラスコに播種細胞数を置く通過、したがって 24 ウェル プレートをシードする必要です。
- 24 ウェル プレートを汚すために細胞を播種、coverslips と 5.1 5.4 の手順に従ってプレートを準備します。
- 通過後、5 分間室温で 200 x g で 1.5 mL 遠心チューブ ・遠心分離機にステップ 8.2 から細胞を懸濁液の 1 mL を配置します。吸引して上清を削除します。
- ZIKV 入荷か 1 ~ 10 の感染 (MOI) の多様性を獲得する手順 8.3 からペレットを再懸濁します。ZIKV ソリューションの量が 0.5 mL を超えない。模擬治療 (制御の細胞)、同じボリュームと ZIKV ストックに使用されるメディアのタイプの細胞を再懸濁します。
注: ZIKV の在庫の準備や感染症は、以前出版11に説明します。モックの感染媒体とわれています。 - 1, 2-3 回、チューブを反転、細胞ペレットを取得するために室温で 216 x g で 5 分間混合物を遠心分離セル/ZIKV 混合物 37 ° C で上記インキュベートします。室温で 216 x g で dPBS と再び 5 分間遠心でペレットを再懸濁します。
- 清を吸引によって除去、適切な培地で細胞を再懸濁します、フラスコまたは実験に必要なプレートに感染した細胞を読み込みます。24 ウェル プレートに細胞を播種する場合は、適切な媒体の 12 mL にペレットを再懸濁し、各ウェルに懸濁液 500 μ L を追加します。
注: この時点で幹細胞に対する ZIKV の影響を観察するための成長媒体にセルを維持または 6 または 7 ZIKV の分化過程に及ぼす影響を研究するための手順に進みます。
9. 汚損プロシージャ
- セルを修正するには、培地を取り除き、濯ぎ 1 回 0.5 ml の氷冷リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) (24 ウェル プレート) ウェルあたり。
- PBS を削除し 0.5 ml の PBS で 4% パラホルムアルデヒドのセルをカバーし、20-30 分の室温で残します。
- 削除、パラホルムアルデヒドとセル 3 回 0.5 mL の PBS、室温で 10 分間に 3 番目の PBS リンスを残してをすすいでください。
- この時点で一晩で PBS を残すと、4 ° C でプレートは保管にまたは 10 分すすぎ後染色を開始します。
- 10 分 PBS 洗浄の後は、5% ヤギ血清 (NGS) 0.3% ウシ血清アルブミン (BSA) の 0.5 mL の溶液を静止位置で 45-60 分間細胞をブロック 0.25% トリトン X-100 トリス緩衝生理食塩水 (TBS) で。たとえば、1 mL のソリューションの使用をブロックする: 25% の 10 μ L トリトン X-100, 100% の 50 μ L、NGS と 3 %bsa の 100 μ L TBS の 840 μ L の混合
- ブロックの段階では、すべての試薬は氷で保たれることを確かめて、一次抗体ソリューションを準備します。HNSCs を検証するためは、適切な抗体を使用して、Nestin など蛋白質を対象指定できます。ZIKV 感染を検証するには、ZIKV コート蛋白質11に対して抗体を使用します。分化、グリア線維性酸性蛋白 (GFAP) は、アストロ サイトを識別するために使用できますが、神経細胞集団を識別するためにクラス III β-チューブリンなどのマーカーを使用します。一次抗体の濃度は、経験的にベンダーおよび多くによって決まります。配分希釈 1: 100 からほとんど抗体を使いました。
- 一次抗体 4 ° C で 2 分間 12,000 × g で遠心分離し、希薄;例えば抗体の 1: 1000 希釈をするためには、追加の 0.25 %7.2 mL に目的とする抗体の 7.2 μ L TBS でトリトン X-100
- 24 ウェル プレートの各ウェルに抗体溶液の約 300 μ L を追加し、静止位置で一晩室温でまたは 4 ° C で 2 時間静止位置に一次抗体と細胞をインキュベートします。
- 、孵化後 3 回静止位置に各 10 分の室温で TBS の 0.5 mL でセルを洗います。
- 二次抗体 4 ° C で 2 分間 12,000 × g で遠心分離し、0.25% トリトン X-100/tbs 系溶液で希釈します。各ウェルに 300 μ L を追加する十分な抗体溶液を作る。ここでは、蛍光の二次抗体 1: 500 (図 3) を希釈します。
- 最後の TBS を洗って後、二次抗体の解決の 300 μ L を各ウェルに追加し、静止位置に室温で 1 時間暗闇の中で孵化させなさい。この時点から、すべてのステップは、暗い部屋で行われなければなりません。
- 静止位置に各 10 分の TBS にセルを 3 回洗います。
- 最後の 10 分の洗浄中に核マーカー核 DAPI 染色 TBS (通常縮尺 - 1:5, 000) の推奨濃度を希釈します。各ウェルに 300 μ L を追加する十分なソリューションを確認します。
- 最終的な洗浄後各ウェルに DAPI 溶液 300 μ L を追加し、静止位置に室温で 5 分間インキュベートします。その後、TBS の 0.5 mL で 1 回洗浄します。
- 蛍光とスライドに配置されます coverslip あたり 1 滴 (10-15 μ L) の耐フェード マウント媒体を使用します。慎重にピンセットを使用して 24 ウェル プレート井戸から coverslips を削除し、スライドに取り付け中ドロップに細胞表面を置きなさい。
- Coverslips がスライド上に配置される、フラット スライド ホルダーにスライドを配置します。確認ラベルのスライドに、スライドを光から保護を保つためにアルミ箔でホルダーをカバーし、そのスライドのセルを識別するために必要なすべての関連情報。
- 4 ° C でスライドを保存でき、一晩を固めるためメディアをマウント。次の日、UV-2E/C フィルター (340-380 nm)、GFP HYQ BP フィルター (450-490 nm) または Y-2E/C テキサス epifluorescent 顕微鏡を使用してスライドを観察 (540-580 nm) の赤色のフィルター、20 倍の倍率。
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Representative Results
増殖期培養 hNSCs は、非付着性細胞 (図 1) として成長します。HNSC 通過直後多くの個々 のセルを集計して次の数日 (図 1 aと1 b) 形球を開始になります。健康的な球は、直径 1-2 mm 程度次の通路 (図 1) 9-10 日をする必要があります。2 mm よりも大きくなる球は暗い中心を開発して、培地で成長因子は不要な分化の結果、球の中心のセルに到達することはできません。健康的な球は、球 (図 1) の端のまわりの擬似繊毛を表示し、半透明表示します。
染色用付着表面の神経幹細胞をめっき付着性球 (図 2 a) の成長になります。これらの球は培養器の表面に触れるし、中部圏域 (図 2 a) を維持しながら、容器の表面に広がるいくつかの突起を持ちます。プライミングとセルを区別する 24 ウェル プレートなどの細胞培養プレートの下部にカバー スリップに付着する細胞が必要です。適切なプライミングの手順と分化培地の添加に続いて細胞が培養器の表面に広がって、細胞 (図 2 b) の相互接続された単分子膜として成長します。
HNSC 文化の妥当性や分化細胞の表現型を確認か、免疫組織染色を使用できます。Nestinは NSCs でよく表される中間径フィラメントを hNSC 文化 (図 3 a) を確認する使用することができます。ニューロンの分化の存在を確認するには、クラス III β-チューブリンはラベル ニューロン (図 3 b) へ一般に使用できます。プライミングの手順は、ニューロンの分化のより高いパーセントを達成するために使用されますが、されますが、アストロ サイトの文化。グリア線維性酸性蛋白(GFAP) は、分化した細胞の割合となったアストロ サイトまたはニューロンを定量化するためにアストロ サイトをラベルに使用できます。
NSCs K048 行が特定 ZIKV 抗体を用いた免疫蛍光染色によって検出された ZIKV のアフリカとアジアの両方の系統に感染していたことがわかった。代表的なイメージは、図 4のとおりです。モックの感染は hNSC 形態の生存 (図 4 a、4 C) 変更を引き出さなかった。ZIKV は 1 時間の感染症に感染した細胞 1 日ポストの周辺地域で滞在する傾向があるが、3 ~ 7 日 (図 4 b, 4 D, 4 e) で全体のセルを塗りつぶします。著しく、同じ MOI (0.1)、K048 セルの推定 5% の感染率は、それらは最近 ZIKV を報告したよりも大幅に低い感染率 (80% まで) は人間の皮膚誘起 NSCs7で。80% 感染を報告、この研究は、プロトタイプのマウスの脳細胞で 140 以上の通路中に神経親和性の表現型を適応している可能性があります ZIKV (MR766) のアフリカのひずみを使用しました。
図 1: hNSC 文化の明視野イメージ。(A ~ C)それぞれ hNSC 文化 1、4、9 日通過後の 10 倍の倍率で撮影した代表的な明るいフィールド画像。スケール バー: 60 μ m.この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2: 付着性文化の明視野イメージ。(めっき後 7 日倍 10 付着 hNSC 文化で撮影した A) 代表的な明るいフィールド画像。(付着性の 10 倍の倍率で撮影した B) 代表的な明るいフィールド画像区別エル細胞プライミングと分化の 9 日間。スケール バー: 60 μ m.この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 3: hNSCs と差別化された文化の蛍光イメージ。(A) 代表的な蛍光画像 (赤) 付着性 hNSCs 核マーカー、DAPI (青)、幹細胞マーカー Nestinとステンド グラスの 20 倍の倍率で撮影します。スケール バー: 60 μ m (B) 代表的な蛍光画像 (青) の分化した細胞で神経マーカー βIII-チューブリン (緑)、アストロ サイト メーカー (赤)、GFAP、核マーカー DAPI 染色の 60 倍の倍率で撮影します。バーをスケール: 10 μ m.この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 4: ZIKV 感染人間の胎児脳由来 NSCs 。模擬人間 NSCs が扱われたか (A、C) 1 時間 0.1 (B、D) の MOI で ZIKV のアフリカの血統ひずみまたは 2016 (E) で最近メキシコで蚊から分離した ZIKV のアジア株を接種しました。免疫蛍光染色 1 〜 7 日接種 (b 1 dpi、7 D、dpi とホ 3 dpi) で NSCs で ZIKV 抗体の分類を検出します。スケール e A D、および 5 μ m での 10 μ m のバーこの図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
| 1 コート t75 フラスコの DFHGPS メディア | 10 mL |
| TPPS * | 173 Μ L |
| 200 mM L ーゼ | 50 Μ L |
| 10 mg/mL インスリン * * | 25 Μ L |
| 20 μ G/ml 表皮成長因子 | 10 Μ L |
| 20 μ G/ml 塩基性繊維芽細胞成長因子 | 10 Μ L |
| 10 μ G/ml 白血病阻害因子 | 10 Μ L |
| 5 mg/mL のヘパリン | 10 Μ L |
| * 30 nM のナトリウム亜セレン酸、20 nM プロゲステロン 100 μ M putresine 100 μ g/mL トランスフェリンを含んでいる混合物。 混合物は濃縮株から作られ因数は-80 ° C で保存、preferablly 6 週間の準備で使用されます。 集中して株が 10 mg/mL トランスフェリン、30 mM プトレシン、10 μ M のプロゲステロン、15 μ M 亜セレン酸ナトリウム-80 ° C で保存されています。 | |
| * * インスリンは 0.01 N hydroen 塩化物、0.2 μ M 低蛋白結合フィルター、濾過し、6 週間まで 4 ° C で保存で分解します。 | |
表 1: 新しい増殖中の成長因子。
| dPBS * | 1 mL、 | 3 mLb |
| 10% ブドウ糖 | 60 Μ L | 180 Μ L |
| 2.5% トリプシン | 10 Μ L | 30 Μ L |
| Dnase * * | 5 Μ L | 15 Μ L |
| ダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水 | ||
| * * デオキシリボヌクレアーゼ | ||
| 、 1000 万セル | ||
| 3000 万セルのb | ||
表 2: トリプシンの準備。
| エアコンのメディア | 1 mL、 | 3 mLb |
| トリプシンインヒビター | 10 Μ L | 30 Μ L |
| 、 1000 万セル | ||
| 3000 万セルのb |
表 3: トリプシンインヒビターの準備。
| DFHGPS * | 0.7 mL、 | 2.1 mLb |
| FBS * * 20% | 0.2 mL | 0.6 mL |
| DMSO * * * 10% | 0.1 mL | 0.3 mL |
| * DMEM、F12、HEPES、グルコース、ペニシリン ・ ストレプトマイシン | ||
| * * 胎児血清 | ||
| ジメチルスルホキシド | ||
| 、 1 バイアル 500 万セル | ||
| b 3 つの容器、500 万セル/バイアル | ||
表 4: 凍結媒体の準備。
| DFGHPS * 24 ウェル プレートで 1 つも | 1 mL |
| TPPS * * | 17.3 Μ L |
| 200 mM L グルタミン | 5 Μ L |
| 10 mg/mL インスリン | 2.5 Μ L |
| 20 μ G/ml 表皮成長因子 | 1 Μ L |
| 10 μ G/ml 白血病の抑制的な要因 | 1 Μ L |
| 1 mg/mL ラミニン | 1 Μ L |
| * 含む DMEM、F12、HEPES、グルコース、ペニシリン ・ ストレプトマイシン | |
| * * 100 μ g/mL トランスフェリン、100 μ M putresine を含む | |
| 20 nM プロゲステロンと 30 nM のナトリウム亜セレン酸 | |
表 5: エル プライミング媒体の準備。
| DFGHPS * 24 ウェル プレートで 1 つも | 1 mL |
| TPPS * * | 17.3 Μ L |
| 200 mM L グルタミン | 5 Μ L |
| 10 mg/mL インスリン | 2.5 Μ L |
| 20 μ G/ml 塩基性繊維芽細胞成長因子 | 0.5 Μ L |
| 5 mg/mL のヘパリン | 0.5 Μ L |
| 1 mg/mL ラミニン | 1 Μ L |
| * 含む DMEM、F12、HEPES、グルコース、ペニシリン ・ ストレプトマイシン | |
| * * 100 μ g/mL トランスフェリン、100 μ M putresine を含む | |
| 20 nM プロゲステロンと 30 nM のナトリウム亜セレン酸 | |
表 6: FHL プライミング媒体の準備。
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Discussion
文化、hNSCs を操作することは、さまざまな高スループット薬剤のスクリーニングの10、11,12,14、人間病気のモデリングから目的のために使用できる重要なツールを提供します 15,16,17。多くの質問がどのように人間の胎児脳 NSCs など対処する残ったまたは彼らの子孫、ZIKV 感染症、ZIKV の異なった緊張が等しい効率 NSCs を感染させるかどうか、小頭症で神経系の発達の間に感染症がどのように結果を受けやすい。ジカ ウイルス神経病理11,14を調査するこの hNSC 文化を使いました。3 つの個々 のドナー細胞の 3 系統を使用しても神経学的な欠損観測次 ZIKV 感染症の11への感受性に個体差を比較することとしております。この手法の限界は、hNSC サンプルへのアクセシビリティと適切な文化に不可欠な馴化培地があります。この障壁を回避するためにこのプロトコルでセルは市販されていない物質移動を手配する対応する著者にお問い合わせください。
In vitroの研究だけではなく hNSCs を使用して基本的な幹細胞の挙動にユニークな洞察力を提供する、彼らはまた前臨床研究を実施する優れたプラットフォームを提供します。ただし、hNSCs の培養の技術的な課題は、効果的かつ再現可能なモデルとしてそれらを使用して障害物として使用できます。このプロトコルの主な手順や養殖方法の可変性を減らすために使用することができますし、健康的で安定した hNSC 幹細胞文化をもたらす方法論を概説しました。HNSC neurosphere カルチャを使用しての欠点は、細胞があらゆる刺激に非常に敏感です。にしても上記の詳細なプロトコル neurosphere 行動の変化でプロトコルに微妙な変化が発生するフラスコまたは hNSCs の料理の処理量に細心の注意を払うことが重要です。
本方法の最も重要な部分は成長因子カクテルと異なった媒体の準備です。HNSC 文化の倍加時間が非常に少ない場合や文化容器 (非付着がする) 時期に多くの細胞 adherie 最初のステップは、使用されている成長因子が適切な濃度であることを確認することで、期限が切れていません。このプロトコルのすべての成長要因は、一度解凍 (5-6 日) 非常に短い貯蔵寿命を持ってください。さらに、複数の企業から成長因子を使用し、品質と文化を維持するために必要な濃度の違いに気づいた私たち。したがって、材料表に正確な成長因子の使用を強くお勧めします。Passaging ステップ (ステップ 3.1 3.22) はまたエラーの一般的なソースです。解離過程に続く多くの死んだ細胞が存在する場合のようにあまりにも多くの物理的な解離細胞死につながる、細胞を分離する上下ピペッティングの回数を減らします。また、解離のステップの後で細胞の多くのクラスターが存在する場合活力またはこれらのクラスターとして上下、ピペッティングの回数がすぐに増加は文化で実行可能になります大きな球になります。文化を適切に維持する場合、ZIKV の感染は比較的簡単です。
ZIKV 感染症はこのプロトコルの詳細な治療が、幅広い研究の文化に位置するこの hNSC のシステムを使用することが可能です。このモデル システムは、画面の薬、個々 の感受性を調べるし、様々 な疾患や発達障害14の基になるメカニズムを調査する使用できます。このシステムは、培養細胞を遺伝子操作されていない示しほとんどない染色体異常、さらに最大 80 通路10,11以来にもゲノム研究に最適です。この培養システムの in vitroモデル化に最適な神経系の発達に影響を与える感染症、薬、アルコール、有害物質、等することができますなどの環境刺激方法考えます。
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Disclosures
著者の利害の衝突を宣言するあります。
Acknowledgments
この作品は、ジョン s. ダン財団とヒトへの感染と免疫のテキサス大学医学部 (P.W.) の研究所からの資金によって支えられました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Gibco | 11965-092 | |
| F12 | Gibco | 11765-054 | |
| Glucose (10%) | Sigma | G8644 | |
| HEPES (1M) | Corning/cellgro | 25-060-c1 | |
| Pen Strep (100x) | Gibco | 15140-122 | |
| Insulin | Sigma | I4011 | |
| L-Glutamine | Gibco | 25030-081 | |
| Transferrin | Sigma | T2036 | |
| Progesterone | Sigma | P8783 | |
| Putrescine | Sigma | P5780 | |
| Sodium selenite | Sigma | S5261 | |
| Heparin Sigma | Sigma | H3149 | |
| basic fibroblast growth factor | R&D system | 233-FB | |
| epidermal growth factor | R&D system | 236-EG | |
| leukemia inhibitory factor | R&D system | 7734-LF | |
| Laminin | Invitrogen | 23017-015 | |
| 2.5% trypsin | Gibco | 15090-046 | |
| Trypsin inhibitor | Sigma | T6522 | |
| Poly-D-Lysine hydrobromide(PDL) | Sigma | P6407-5MG | |
| B-27 supplement | Gibco/Invitrogen | 17504-044 | |
| Fetal bovine serum | Gibco | 16000-044 | |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma | D2650-100ml | |
| Dulbecco's phosphate-buffered saline | Corning/cellgro | 21-031-CV | |
| Bovine serum albumin | Sigma | A4378-25G | |
| Normal goat serum | Jackson ImmunoResearch Lab | 005-000-121 | |
| Triton X-100 | FisherBiotech | BP151-500 | |
| Nestin antibody | BD Transduction Laboratories | 611659 | 1:200 dilution |
| Class III beta-tubulin antibody (TuJ1) | Covnce | MMS-435p | 1:2000 dulution |
| GFAP antibody | Millipore | AB5804 | 1:1000 dilution |
| DAPI | Molecular Probes | D1306 | 1:2000 dilution |
| ZIKV antibody | World Reference Collection for Emerging Viruses and Arboviruses at the University of Texas Medical Branch | 1:2000 dilution | |
| Fluoromount G | SouthernBiotech | 0100-01 | |
| CO2 incubator | Thermo Forma | Model# 3110 | |
| Centrifuge | Thermo fisher Scientific | 75004221 | |
| Biological safety cabinet | Forma scientific Claas II A/B3 | Model# 1284 | |
| Freezer (-80 °C) | Forma scientific,Inc | model# 8516 | |
| Microscope(phase contrast image) | Hp 2230 workstation | Product#NOE25us#ABA | |
| Microscope (epifluorescent image) | Nikon Eclipse 80i | ||
| Confocal Microscope | Nikon TE2000-E microscope with C1si confocal system |
References
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