Summary
Эта статья подробно описывает методы, которые используются для расширения человеческого мозга плода нервных стволовых клеток в культуре, а также как различать их в различные подтипы нейронов и астроциты, с упором на использование нервных стволовых клеток для изучения Зика вирусной инфекции.
Abstract
Человеческий мозг плода нервные стволовые клетки являются системы уникальный генетически модифицированных моделей для изучения влияния различных раздражителей на человеческого развития нейробиологии. Скорее, чем использовать модель животных или генетически модифицированных индуцированных плюрипотентных клеток, человеческие нервные стволовые клетки обеспечивают эффективный в vitro системы для изучения эффектов лечения, экран наркотиков, или изучить индивидуальные различия. Здесь мы предоставляем подробные протоколы для методов, используемых для расширения человеческого мозга плода нервных стволовых клеток в культуре с сыворотки свободных СМИ, чтобы дифференцировать их в различные подтипы нейронов и астроциты через различные грунтовки процедур и заморозить и восстановить Эти клетки. Кроме того мы опишем процедуру использования человеческого мозга плода, нервные стволовые клетки для изучения Зика вирусной инфекции.
Introduction
Зика вирус (ZIKV) является flavivirus, передаваемых половым путем, либо комары Aedes aegypti и Aedes albopictus векторов комаров. ZIKV недавно была определена как угроза тяжелой общественного здравоохранения из-за его простота передачи и аффилированным неврологические симптомы1. Один из самых относительно неврологические эффекты является развитие микроцефалия в зародышах родился беременных ВИЧ-инфицированных матерей2,3. Микроцефалия является расстройство нервной, где меньше, чем типичный размер головы во время внутриутробного развития и при рождении, с окружностью, менее чем в 2 стандартных отклонения ниже среднего4. Меньше окружность головы обычно сопровождается целый ряд сопутствующих заболеваний, таких, как задержки в развитии, припадки, видение и потери слуха и кормление трудности.
Недавние исследования использовали Животные модели или индуцированных плюрипотентных стволовых клеток для изучения эффекта ZIKV инфекции на развитие нервной системы5,6,,78. Хотя эти исследования способствовали наши знания о ZIKV, использование различных видов или генетически модифицированные клетки может быть много времени и/или добавить дополнительные переменные, которые могут сбить с толку эффект ZIKV на развитие нервной клетки5, 6 , 7 , 8. Однако, трудности с НСК культуры, особенно культуры не сторонник нейросферы, описанных в настоящем Протоколе, является, что культура является очень чувствительной к методам, используемым для проведения культуры9. Любые изменения в средних компонентов, или даже физической обработки культуры судна, достаточно, чтобы вызвать реакцию клетки9. Для решения этих вопросов, мы разработали в vitro плода мозг производные нервных стволовых клеток человека (hNSCs) культуры механистически допросить влияние ZIKV на фетальных нервных стволовых клеток. С помощью нашего метода, hNSCs были сохранены для более чем 80 пассажи без очевидной фенотипические изменения10. Кроме того, хромосомные изменения, такие как трисомия были либо none или минимальным11. Эта культура НСК растет как non сторонник нейросферы культуры. Одним из преимуществ neurospheres является сферах создать уникальную нишу, экологической культуры, который более отражает в vivo ниш по сравнению с двумерной культур9. Еще одним преимуществом этого протокола является, что несколько типов клеток могут быть получены от НСК культуры, позволяя следователь наблюдать последствия данной переменной на НСК выживания и дифференциации. Этот протокол применяется для лиц, желающих ответить механистический вопросы, касающиеся развития центральной нервной системы или дисфункции. Следующий протокол описывает расширить культуру НСК заразить с ZIKV, и впоследствии дифференцировать hNSCs соблюдать воздействия инфекции на процесс дифференциации. Он также включает методы для хранения hNSCs для длительного использования и различать hNSCs в различные типы нейронов, которые позволяют дальнейшее расследование ZIKV-индуцированного дефицита, способствуя мозга мальформация11. Мы считаем, что этот протокол также представляет интерес для исследователей, стремящихся понять влияние каких-либо экологических стимулов такие инфекции или токсинов на выживание нервных стволовых клеток и дифференциации.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Нервные стволовые клетки человека были первоначально получены из отбрасываются человеческого плода Кор в первом триместре12. Все процедуры протокола соблюдать руководящие принципы этики университета Техаса Медицинское отделение, относительно использования образцов человеческой ткани, и клеточных линий были одобрены институциональные Комитета по биобезопасности.
1. акции средних подготовка и стволовых клеток восстановления
- Подготовьте складе питательной среды (DFHGPS), объединяя реагентов в 1.1.1.-1.1.5 шаги.
- Добавление 210 мл Дульбекко изменение средних орла с высоким глюкозы и L-глютамин (D). Храните при 4 ° c.
- Добавьте 70 мл, ветчина F12 питательной смеси с L-глютамин добавки (F). Храните при 4 ° c.
- Добавить 4.2 мл 15 мм HEPES буфер (H) и хранить его при комнатной температуре.
- Добавить 4.2 мл 10% раствора D-глюкозы (G) и хранить его при комнатной температуре.
- Добавление 2,88 мл раствора пенициллина/стрептомицина (PS)... Алиготе Стоковый раствор в 3 мл аликвоты и хранить аликвоты при-20 ° C до тех пор, пока требуется.
Примечание: Конечная концентрация пенициллина в среде будет 100 единиц/мл, и концентрация стрептомицина будет 100 мкг/мл. Эта среда будет именоваться DFHGPS на оставшуюся часть протокола и должны храниться при температуре 4 ° C для использования в течение 1-2 недель. При необходимости, DFHGPS могут быть расширены пропорционально.
- За день до клетки восстанавливаются, пальто T75 флакон с 5 мл кондиционером среды, полученные от предыдущих культур НСК клеточной линии и оставить в инкубатора 37 ° C с 8,5% двуокиси углерода (CO2) на ночь.
Примечание: Если в настоящее время культивирования hNSCs, сохраните средний, что клетки растут в течение среднего изменения. Это обусловлено средний, как она «условный» клеток. Кондиционерами среднего можно хранить при 4 ° C приблизительно 7 дней и сохранен в трубу колпачок. Связаться с соответствующим автором для получения hNSCs. Кондиционерами среднего является предпочтительным, но не абсолютно необходимо, особенно при первом запуске культуры hNSCs. - День восстановления, теплый 20 мл DFHGPS в 50 мл трубки колпачок в ванну воды 37 ° C для по крайней мере 10 мин и держать его в водяной бане до готовой к использованию.
- В отдельном 15 мл трубку колпачок теплый 10 мл DFHGPS в ванну воды 37 ° C для по крайней мере 10 мин и держать его в водяной бане до готовых к использованию на шаге 1.13.
- Получить контейнер льда и всех компонентов среды (Таблица 1). Размораживание всех компонентов среды на льду и оставить их на льду при подготовке среднего изменения.
- Получить 5 мл кондиционером средних запасов (хранить при 4 ° C) и держать его в ванну воды 37 ° C до готовых к использованию на шаге 1.14. Смотрите примечание после шага 1.2, если есть нет кондиционерами средних или текущий плода нервных стволовых клеток человека культуры.
- Получить 50 мл трубки колпачок из шага 1.3 и поместите его в кабинет биобезопасности (BSC). Передача 10 мл DFHGPS в новой трубки колпачок 15 мл, а затем поместите трубки 50 мл, содержащие оставшиеся 10 мл среды DFHGPS обратно в ванну воды 37 ° C.
- Получите крио флакон hNSCs храниться в жидком азоте. Смотрите примечание после шага 1.2 Если не текущее культуру человеческого плода нервных стволовых клеток.
Примечание: Человеческие нервные стволовые клетки были первоначально производным от отбрасываются человеческий мозг плода12 и поддерживается в культуре без генетических модификаций10. 5 × 106 клеток следует разморозить и покрытием на T75 колбу. Каждый крио пузырек должен содержать 5 × 106 клеток; Таким образом необходим один флакон за флакон. - Оттепель флакон клеток в ванну воды 37 ° C, переворачивать флакон каждые 10 s для примерно 1 мин, или до тех пор, пока лед растаял и содержимое флакона полностью жидкого. Не погружайте весь флакон под водой, чтобы избежать потенциального загрязнения.
- В BSC используйте микро пипетки P1000 аспирационная талой клеток решение и добавить его каплям до 15 мл трубки из шага 1.7, содержащие 10 мл DFHGPS. Чтобы добавить в решение талой клеток каплям, медленно надавите на поршень так, чтобы одновременно выпущена только одну-две капли. Тем временем вихрем 15 мл трубки позволяют быстро смесь.
- Центрифуга суспензию клеток на 200 x g 5 мин при комнатной температуре. Выбросите супернатанта, убедившись в том сохранить клетки Пелле.
- Во время шага 1.11 получить Тюбик 50 мл, содержащие оставшиеся 10 мл на шаге 1.7. После центрифугирования Ресуспензируйте Пелле клеток в 10 мл DFHGPS и центрифуги снова на 200 x g 5 мин при комнатной температуре.
- Во время окончательного отжима Подготовьте новое средство роста на следующие таблицы 1 Добавление факторов роста в 10 мл DFHGPS среднего из шага 1.4 (Таблица 1) в BSC. Оставьте новый носитель содержит факторы роста в BSC до готовой к использованию.
- Извлечение T75 колбу с шагом 1,2 и отбросить кондиционером среднего покрытие колбы от аспирации. Затем добавьте 5 мл кондиционером СМИ из шага 1.6. в колбу с помощью Серологические Пипетки. Будьте осторожны, чтобы не поцарапать нижней части колбы.
- Получить трубки клеток из центрифуги и отказаться от супернатанта, аспирационных, оставляя нетронутыми Пелле клеток.
- Ресуспензируйте Пелле клеток в 10 мл новых средств массовой информации из шага 1.13, используя 5 мл Серологические Пипетки и закупорить вверх и вниз несколько раз. Добавьте подвеска с покрытием T75 настой из шага 1.14. Используйте остальные 5 мл для полоскания трубка, которая содержит ячейки Пелле и затем добавить эти 5 мл флакон, а также.
- Рок T75 колбу и обратно 3 раза чтобы убедиться, что клетки распределяются равномерно по всему колбу. Убедитесь, что крышка колбу потерять, чтобы разрешить поток воздуха. Под микроскопом света наблюдать клетки, делать заметки и если возможно принимать изображения.
Примечание: Клетки должен выглядеть полупрозрачные и шаровые. Сделайте Примечание Если есть клетки что смотреть темный, непрозрачный, или имеют асимметричные границы, как это может означать гибель клеток. Кроме того, наблюдать за любой грибковой или бактериальной загрязнения, таких, как средства массовой информации становится желтого цвета. - Место колбу клеток в инкубаторе 37 ° C с 8,5% CO2.
Примечание: Используйте 8,5% вместо 5,0% CO2 для поддержания pH этой сыворотки свободной культуры средств массовой информации в диапазоне 7.1-7.4.
2. НСК среднего изменения
Примечание: Изменения среднего каждые 3-4 дня.
- Включите BSC и тщательно очистить с 70% этиловом спирте. Соблюдайте клетки под микроскопом света.
Примечание: Делать заметки на внешний вид ячеек и сфере размеров. Через три дня после восстановления или проход, клетки кластера вместе и начинают формировать non сторонник neurospheres.
Предупреждение: Если клетки придерживаться нижней части колбы, культуры будет нужно быть отброшены как сотовый присоединению увеличит преждевременной дифференциации и будет не в состоянии поддерживать состояние стволовых клеток. Если есть слишком много ячеек в колбу, клетки могут образовывать большие сферах (больше чем 2 мм в диаметре) в этом случае, в центре сферы клетки начнет различать из-за отсутствия доступа к факторам роста в среднесрочной. Если наблюдаются сферах размером более 1 мм в диаметре, клетки могут быть пассированный (шаги 3.1-3.22). - Выполните шаги 1.4 и 1.5 и подготовить 10 мл свежей среды (см. шаг 1.13).
- Колба наклон в сторону, позволяя сферы, чтобы опускаться на дно колбы.
- Удаление 5 мл кондиционером СМИ из верхней части пуле среды с использованием 5 мл Серологические Пипетки, стараясь не аспирационная любой neurospheres. Место 5 мл кондиционером СМИ в чистые 15 мл трубку.
- Удалите дополнительные 5 мл кондиционером СМИ из колбы, снова тщательно избегая в сферах и уложите же 15 мл по 5 мл.
- Добавьте 10 мл новых средств массовой информации из шага 2.2 оставшиеся 5 мл кондиционером СМИ и клеток в колбу. Установите колбу вниз с плоским и наблюдать клетки под микроскопом света.
- Если окажется, что клетки был придыханием во время сбора обусловлено среды, спина кондиционером среднего на 100 g x 5 мин при комнатной температуре. Вновь приостановить любой клетки, которые накапливаются внизу в 1 мл кондиционером средних и затем добавить их в колбу культуры.
- Храните 10 мл неиспользуемых кондиционером СМИ от шагов 2.5/2.6 на 4 ° c в 15 мл колпачок.
- Повторите шаги 1.17/1.18.
3. НСК проход
Примечание: hNSCs должна быть что проход каждые 9-11 дней если клетки растут нормально, как время удвоения населения приблизительно 3 дня13.
- Если расширение NSCs в новый флакон, убедитесь, что все новые колбы покрыты как шаг 1.2.
- Очистить BSC как шаг 2.1 и проводить шаги 1.4 и 1.5.
- Подготовка среднего как шаг 1.13. Каждый настой T75 требует 10 мл среды. Для нескольких T75 Колб умножьте 10 мл средства массовой информации, количество настоев.
- Подготовка 1 или 3 мл Дульбекко фосфат амортизированное saline (dPBS) и глюкозы и место в ванну воды 37 ° C тепло за 10 мин (раствор трипсина) согласно томов в таблице 2. Не добавляйте трипсина или DNase в это время. DNase может потребоваться сломать любые ДНК освобожден от омертвевших клеток диссоциации механические или химические клеток.
Примечание: Для одной колбе T75 пассированной после 9-10 дней роста там будет примерно 30 × 106 клеток, если 5 × 106 первоначально были посеяны на колбу. Как правило 1 мл dPBS раствора используется для 10 × 106 клеток. Таким образом 3 мл dPBS раствора необходим для T75 колбу, пассированные после 9-10 дней. - Место чистой небольшой вес лодки и Горяева в Худ. Чистить с 70% этанола и дать высохнуть в вытяжном шкафу примерно 5 минут.
Примечание: Вес лодки будет использоваться в шагах 3.17.1. - Извлечь колбу клеток, которые будут пассированной из инкубатора и принести в BSC. Наклон колбу слегка позволяя клеток опускаться до нижней части пула носителей. Существует около 15 мл СМИ в колбу.
- Удаление около 10 мл средства массовой информации в части 5 мл (т.е. 5 + 5 мл). Поместите этот 10 мл средства массовой информации в чистые 15 мл с надписью «См» для «условных среднем». Будьте осторожны, чтобы не удалить любой из клеток, поселились в оставшиеся 5 мл СМИ в колбу; Эти клетки и 5 мл средства массовой информации будут подвергаться шаг 3,8.
- Возьмите 3 мл с кондиционерами СМИ от метро «См» (из шага 3.7) и место в 15 мл трубку под названием «решение ингибитор трипсина». Это будет использоваться на шаге 3.12. После удаления по 3 мл есть 7 мл кондиционером СМИ слева в трубке «См». Отложите «См» трубки до шага 3.9.
- Удалите по 5 мл средства массовой информации и клетки, остающиеся в колбу T75 и место в чистые 15 мл с надписью «Клетки».
- Возьмите трубка «См», содержащая 7 мл кондиционером СМИ (от шага 3.7.1) и промойте в нижней части T75 настой дважды с 3,5 мл части кондиционером СМИ, с помощью Пипетки серологические 5 мл. После каждого полоскания место 3,5 мл части в трубку «Клетки». Этот шаг предназначен для удаления всех neurospheres (клетки) из T75 колбу.
- Центрифуга «Клетки» трубки на 100 g x 5 мин при комнатной температуре. В то время как клетки спиннинг, получить dPBS/глюкозы раствор от 37 ° C водяной бане и добавьте соответствующее количество трипсина и DNase согласно таблице 2.
- После того, как трубка «Клетки» прекратил спиннинг, удалите все кондиционерами среднего супернатанта и передаче трубка «См».
- Возьмите трубку под названием «решение ингибитор трипсина» от шага 3.7.1. и добавить объем ингибитор трипсина, указанных в таблице 3. Используйте такой же объем раствора ингибитор трипсина, как был использован для решения трипсина.
- Место решение ингибитор трипсина в 37 ° C водяной бане до тех пор, пока требуется.
- Добавить решение трипсина в Пелле клеток в 15 мл трубки и Пипетка вверх и вниз примерно 5 - 10 раз с 5 мл пипетки. Закройте крышку трубки и инкубировать в ванну воды 37 ° C за 5 мин. После 5 минут, получить клетки и Пипетка вверх и вниз 5 - 10 раз. Затем Инкубируйте в ванну воды 37 ° C для дополнительных 10-15 мин.
- В течение последних 5 мин переместите решение ингибитор трипсина BSC.
- Извлечь клетки после завершения шага 2.14 и Пипетка клетки вверх и вниз до тех пор, пока сферах полностью отделить (20 - 30 раз). Затем сразу же добавьте решение ингибитор трипсина и пипетки вверх и вниз по 10 раз. Это решение диссоциированных клеток и ингибитор трипсина будет именоваться «суспензию клеток».
- Подсчитать количество клеток в суспензии клеток, выполните шаги.
- Пипетка 15 мкл предварительно смеси Трипановый синий (содержащие 5 мкл 0,4% Трипановый синий и 10 мкл dPBS) на лодке небольшой вес, а затем добавьте 5 мкл суспензии клеток. Пипетка вверх и вниз 3 - 5 раз в смесь. Затем Пипетка 10 мкл суспензии Трипановый синий/клеток на обе стороны Горяева, покрытые coverslip стекла.
- Соблюдать клетки под микроскопом света и подсчитать общее число ячеек в каждой из четырех углу сетки. Добавьте эти числа вместе.
- Повторите подсчета для другой стороны и в среднем две стороны вместе.
- Умножьте это число на 10000 дать общее количество клеток / мл. Умножьте это число на общее количество миллилитров рассчитать общее количество клеток в суспензии клеток. Рассчитайте, сколько объем суспензии клеток необходимо будет 5 миллион клеток в T75 настой семян.
Примечание: Как правило, после 9-10 дней, T75 будет иметь 25-30 × 106 клеток. Таким образом если пассированый всех ячеек в новые колбы, требуется в общей сложности 5-6 колб. - Добавьте объем суспензии клеток, рассчитанные на шаге 3.19 каждый T75 колбу для получения 5 × 106клеток за флакон. Если объем составляет менее 5 мл, добавьте дополнительное условие средних и составляют в общей сложности 5 мл. Настой добавьте 10 мл новой DFHGFPS СМИ содержащий факторов роста (Таблица 1).
- Повторите шаги 1.17 и 1.18 и убедитесь, что колбу помечается с типом клеток, даты, количество ячеек в колбу и номер прохода (это количество раз, которое пассированной ячейки). Затем переходите к шаги 4-9.
- Если необходимо, семя загородный клетки в один T75 колбу на плотность до 30 × 106клеток за флакон на ночь и заморозить на следующий день согласно шаг 4.
4. НСК замораживания и хранения
- На следующий день после пассированый, получить фляга из инкубатора, содержащие клетки для замораживания (из шага 3.19 и 3.22). Наклоните колбу и удалить все среднего и клетки из фляги и место в 15 мл. Затем, центрифуга трубки на 216 x g за 5 мин.
- В процессе центрифугирования Подготовьте замораживания среднего (Таблица 4). За каждые 5 × 106 клеток подготовить 1 мл замораживания среды. Количество клеток определялся в шаге 3.19 при определении сколько клеток в каждом колбу. Это число не изменится на ночь.
- Подготовьте крио заповедник флаконов с метками ячейки имя, номер прохода, количества клеток, инициалы и дата. После центрифугирования удалить супернатант стремлением и вновь приостановить Пелле клеток в замораживания среды, так что есть 5 × 106 клеток/мл. С помощью пипетки 5 мл, аликвота 1 мл флакон и уплотнение плотно (5 × 106 клеток на флакон).
- Место флаконов в крио заповедник контейнер с 250 мл изопропиловый спирт (Макс использование 5 раз за замещения изопропанола). Хранить в морозильной камере-80 ° C на ночь, а затем передать в систему хранения танк жидкого азота.
5. покрытие адэрентных НСК для проверки
- За день до пассированый (шаги 3.1-3.22), очистить BSC как в шаге 2.2 и получить 24-ну пластины и стерильные стекло 12 мм coverslips.
- С помощью щипцов, место одного coverslip на нижней части каждой скважины пластины.
- Слой скважин, содержащие скользит крышка с 0,01% поли D-Лизин (PDL) в стерильной воде и инкубировать в течение 1 ч при 37 ° c. Для 24-ну плиты используйте 250 мкл PDL в колодец.
- Удаление PDL из скважин и затем пальто с 1 мкг/см2 Ламинин/dPBS (250 мкл на хорошо). Инкубировать пластину на ночь при 37 ° C. Если не требуется следующий день, печать пластины с парафина, завернув парафина вокруг краев плиты и хранить при 4 ° C.
Примечание: Плиты, покрытые Ламинин может храниться до 2 недель если опечатаны с парафина, пока скользит крышка не сухой. - Проход клетки как описано в шагах 3.1-3.22 и затем определить количество клеток семян в 24-ну пластины с покрытием coverslips.
- Удалите любые излишки Ламинин решение из скважины через стремление и один раз прополощите 0,5 мл dPBS. Затем семена клетки в скважины на плотности тарелок 0,6-1 х 105 клеток/см2 на хорошо. Используйте любые оставшиеся клетки согласно шаги 3,16-3.21.
- Atvarious раз в течение 24-ну плиты культуры, исправить и запятнать клетки для различных маркеры стволовых клеток после шаг 9.
6. грунтовка для получения ГАМК и глутамата нейронов
- Проход клетки, как описано в 3.1-3.22 и затем определить количество клеток семян в плиту 24-Ну как в шаге 5.6.
- За день до грунтовки, подготовьте скользит крышка и Пальто плиты, как описано в шагах 5.1-5.4.
- Грунтование день получить флаконы, содержащие 2-3-дневный клетки. Место в 15 мл и Пелле клетки центрифугированием на 100 g x 5 мин.
- Подготовка среднего грунтование эпидермального фактора роста/лейкоз тормозящий фактор в Ламинин (ELL) согласно таблице 5.
- Ресуспензируйте клетки со средним ЕЛЛ.
- Семя приостановлено клетки в 24-ну плиту (следуйте шаг 5.6).
7. грунтовка для получения двигательных нейронов
- Выполните действия 6.1-6.4.
- Подготовка среды грунтовки (FHL) основные фибробластов фактор роста/гепарин/Ламинин согласно таблице 6.
- Выполните шаг 5.6.
8. Зика вирусной инфекции
Примечание: ZIKV является весьма чувствительны к температуре, так что это императив, который ZIKV складе хранятся на - 80 ° C и замораживания/оттаивания циклов избегаются. Продолжать работаете аликвоты на льду.
- Проход клетки, как описано в шагах 3.1-3.22. 3-4 миллионов клеток в общей сложности необходимы для семян 24-ну плита, поэтому, когда пассированый, количество ячеек для инфекции и заполнения в колбе, когда пассированый.
- Если заполнение клеток в 24-ну пластина для окрашивания, подготовьте coverslips и пластина согласно шаги 5.1-5.4.
- После пассированый, место 1 мл суспензии клеток из шага 8.2 в пробки microcentrifuge 1,5 мл и центрифуги на 200 x g при комнатной температуре в течение 5 мин. Затем удалите супернатант путем аспирации.
- Ресуспензируйте гранулы из шага 8.3 на складе ZIKV приобрести разносторонность инфекции (МВД) либо 1 до 10. Объем раствора ZIKV не должен превышать 0,5 мл. Для лечения макет (контроль клетки) Ресуспензируйте клетки в том же объем и тип среды, используемые на складе ZIKV.
Примечание: ZIKV массоподготовки и инфекции подробно в предыдущей публикации11. Макет инфекций проводятся также с среднего. - Инкубируйте выше ячейки/ZIKV смесь при 37 ° C, 1 ч. перевернуть трубку 2 - 3 раза, а затем центрифуга смесь для 5 мин на 216 x g при комнатной температуре для получения гранул ячейки. Ресуспензируйте Пелле в dPBS и центрифуги снова за 5 мин на 216 x g при комнатной температуре.
- Удалить супернатант стремлением, Ресуспензируйте клетки с соответствующим среднего и загрузки зараженных клеток в колбу или пластины, необходимые для эксперимента. Если заполнение ячеек в 24-ну плиту Ресуспензируйте гранулы в 12 мл соответствующей среды, а затем добавьте 500 мкл суспензии для каждой скважины.
Примечание: на данный момент сохранить клетки в СМИ роста наблюдать последствия ZIKV стволовые клетки, или пойти на шаги 6 или 7 для изучения влияния ZIKV на процесс дифференциации.
9. Окрашивание процедура
- Чтобы исправить ячейки, удалить средний, раз прополощите 0,5 мл в колодец (24-ну Латы) лед холодной фосфат амортизированное saline (PBS).
- Удаление PBS и охватывают клетки с 0,5 мл параформальдегида 4% в PBS и оставить при комнатной температуре для 20-30 мин.
- Параформальдегида снимите и промойте клетки три раза с 0,5 мл PBS, оставляя третьего полоскания PBS на 10 мин при комнатной температуре.
- На данный момент оставить PBS на ночь и хранить пластину на 4 ° c или начать окрашивание после полоскания 10 мин.
- После полоскания 10 мин PBS, заблокировать ячейки для 45-60 мин в стационарном положении с 0,5 мл раствора 5% нормальной козьего сыворотки (НГС), 0,3% бычьим сывороточным альбумином (БСА), 0,25% Тритон X-100 в трис амортизированное saline (TBS). Например, чтобы сделать 1 мл блокирования использования решения: 10 мкл 25% Тритон X-100, 50 мкл, 100% NGS и 100 мкл BSA 3% смешанные в 840 мкл TBS.
- Во время выполнения блокировки Подготовьте решение основное антитело, убедившись, что все реагенты находятся на льду. Для проверки hNSCs, белки, например Nestin могут быть направлены с использованием соответствующих антител против них. Чтобы проверить ZIKV инфекции, используйте антитело против ZIKV пальто белка11. Для дифференциации для выявления нейрональных популяций при глиальных фибриллово кислой белка (СВМС) может использоваться для идентификации астроциты используйте маркеры например класс III β-тубулина. Концентраций первичных антител эмпирически определяются в зависимости от поставщика и много. Мы использовали большинство антитела от 1: 100 до 1: 2000 разрежения.
- Центрифуга основное антитело на 12000 g x 2 мин при температуре 4 ° C, а затем сделать разрежения; Например чтобы разведении 1: 1000 антител, мкл 7.2 желаемого антител в 7.2 мл 0,25% Тритон X-100 в TBS.
- Добавить примерно 300 мкл раствор антител в каждой скважине 24-ну плиты и инкубировать клетки с основное антитело в стационарном положении втечение 2 ч при комнатной температуре или на 4 ° c на ночь в стационарном положении.
- После инкубации Вымойте клетки с 0,5 мл TBS три раза при комнатной температуре в течение 10 минут в стационарном положении.
- Центрифуга для вторичного антитела на 12000 g x 2 мин при температуре 4 ° C, а затем разбавляют в 0,25% раствор Тритон X-100/TBS. Сделайте раствор достаточно антител для 300 мкл метки для каждой скважины. Здесь разбавляют флуоресцентные вторичных антител 1: 500 (рис. 3).
- После того, как окончательный TBS мыть, 300 мкл раствора вторичное антитело для каждой скважины и инкубировать в темноте за 1 ч при комнатной температуре в стационарном положении. С этого момента все действия должны осуществляться в темной комнате.
- Вымойте клетки три раза с TBS 10 мин в стационарном положении.
- В течение последних 10 минут вымыть разбавляют ядерных маркер DAPI ядерных пятно Рекомендуемые концентрации в TBS (обычно 1:1,000 - 1:5, 000). Сделайте достаточно решение 300 мкл метки для каждой скважины.
- После окончательной стирки 300 мкл DAPI решения для каждой скважины и инкубировать в течение 5 мин при комнатной температуре в стационарном положении. Затем промыть после 0,5 мл TBS.
- Используйте средства монтажа анти затухания для флуоресценции и 1 капля (10-15 мкл) на coverslip, который будет помещен на слайде. Тщательно используйте пинцет, чтобы удалить coverslips из 24-ну тарелка скважин и место клеточной поверхности вниз на падение средних монтажа на слайде.
- Как только coverslips размещены на слайде, место слайда в плоский слайд держатель. Убедитесь, что ярлык слайды будут всю соответствующую информацию, необходимые для идентификации ячейки на слайде, затем накройте алюминиевой фольгой держателю хранить слайды, защищенном от света.
- Хранить слайды на 4 ° c и позволяют монтаж среднего затвердеть на ночь. Следующий день наблюдать слайда с помощью микроскопа epifluorescent с УФ-2E фильтр (340-380 Нм), GFP HYQ BP фильтр (450-490 Нм) или Y-2E/C Техас красный фильтр (540-580 Нм), 20 кратным увеличением.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Искусственный hNSCs в пролиферативной стадии их будет расти как non сторонник neurospheres (рис. 1). Сразу же после прохождения НСК там будет много отдельных клеток, которые будет агрегировать и начинают форме сфер в ближайшие несколько дней (рис. 1A и 1B). Здоровые сферах должно быть примерно 1-2 мм в диаметре 9-10 дней после прохода (рис. 1 c). Сферы, которые больше чем 2 мм разработает темный центр и факторы роста в среднесрочной не сможет достичь в центре сферы, что приводит к нежелательной дифференциации клетки. Здоровые шары появляются полупрозрачные и отображать псевдо-ресничек вокруг краев области (рис. 1 c).
Покрытие neurospheres на адэрентных поверхности для окрашивания целей приведет к росту адэрентных сфер (рис. 2A). Эти сферы будут прикасаться к поверхности сосуда культуры и имеют некоторые прогнозы, растяжения на поверхности сосуда, при сохранении центральной области (рисунок 2A). Грунтование и дифференциации клеток требуют клетки придерживаться покрытие скольжения в нижней части пластины культуры клетки, например 24-ну плиты. После соответствующей грунтовки шаги и добавлением дифференциации среднего клетки будут разбросаны по поверхности сосуда культуры и расти в взаимосвязанные монослоя клеток (рис. 2B).
Либо подтвердить действительность НСК культуры или фенотип дифференцированных клеток, может использоваться флуоресцентные иммуногистохимия. Nestin является промежуточного накаливания, обычно выражается в NSCs и может быть использован для проверки НСК культуры (рис. 3A). Для проверки наличия нейронов после дифференциации, класс III β-тубулина обычно может использоваться для метки нейронов (рис. 3B). Хотя шаг грунтовка используется для достижения более высокий процент нейронов после дифференциации, по-прежнему будет астроциты в культуре. Глиальные фибриллово кислые белки (СВМС) может использоваться для астроциты метки для того, чтобы определить какой процент дифференцированных клеток стали астроциты или нейронов.
Мы обнаружили, что линии K048 NSCs был заражен африканских и азиатских штаммов ZIKV, обнаруженных immunofluorescent окрашивание с специфическим антителом ZIKV. Представитель изображения показаны на рисунке 4. Макет инфекции не сделал вызывают изменения в НСК морфологии или выживания (рис. 4A, 4 C). ZIKV стремится остаться в регионе периферийных инфицированной клетки один день поста 1-часовой инфекции, но заполняет всю ячейку в 3-7 дней (рис. 4б4 D, 4E). Заметно, с же MOI (0.1), примерно 5% инфекции в K048 клетки значительно меньше, чем тех, кто недавно сообщили ZIKV инфекции скорость (до 80%), в человеческой кожи индуцированной NSCs7. Это исследование, отчетности 80% инфективности, используемый прототип африканских штамм ZIKV (MR766), который может приспособить нейротропные фенотип в течение более чем 140 проходы в клетках мозга мыши.
Рисунок 1: светлые области изображения культуры НСК. (A-C) Представитель светлые области изображения, полученные при 10-кратном НСК культуры 1, 4 и 9 дней после пассированый, соответственно. Масштаб бары: 60 µm. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2: светлые области изображения адэрентных культур. (A) представитель светлые области изображения, полученные при 10-кратном адэрентных НСК культуры, через 7 дней после покрытия. (B) представитель светлые области изображения, принятыми на 10 крат приверженца дифференцированных клеток после ELL грунтовки и 9 дней дифференциации. Масштаб бары: 60 µm. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3: люминесцентные изображения hNSCs и дифференцированной культур. (A) представитель флуоресцентных изображений, снятых при 20-кратном о сторонником hNSCs, окрашенных с ядерными маркер, DAPI (синий) и стволовых клеток маркер Nestin (красный). Линейки: 60 мкм (B) представитель флуоресцентных изображений, снятых на 60 X увеличением дифференцированных клеток, окрашенных с нейронных маркер βIII-тубулина (зеленый), экзоцитоз чайник СВМС (красный) и ядерных маркеров DAPI (синий). Масштаб бары: 10 мкм. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 4: ZIKV инфекции человека плода мозг производные NSCs. Человеческого NSCs, макет лечили (A и C), привитых на 1 час с Африканской линии штамм ZIKV в МВД 0.1 (B и D), или азиатских штамм ZIKV недавно изолированы от комаров в Мексике в 2016 (E). Immunofluorescent окрашивание обнаруживает маркировки ZIKV антител в NSCs на одного до семи дней поста прививка (1 dpi в B, 7 ДОИ в D и 3 ДОИ в E). Масштаб бары 10 мкм в A-D и 5 мкм в э. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
| DFHGPS СМИ для одного T75 | 10 мл |
| ТЭС * | 173 МКЛ |
| 200 мм L-глютамина | 50 МКЛ |
| 10 мг/мл инсулин ** | 25 МКЛ |
| 20 мкг/мл-эпидермального фактора роста | 10 МКЛ |
| 20 мкг/мл основные фибробластический фактор роста | 10 МКЛ |
| 10 мкг/мл лейкемии ингибитор фактор | 10 МКЛ |
| 5 мг/мл гепарина | 10 МКЛ |
| * Смесь, содержащую 100 мкг/мл трансферрин, 100 мкм putresine, 20 Нм прогестерона и селенит натрия 30 Нм. Смесь изготавливается из концентрированного запасов, и аликвоты хранятся при температуре-80 ° C и preferablly используются в течение 6 недель подготовки. Концентрированные запасы являются 10 мг/мл трансферрин, путресцин 30 мм, 10 мкм прогестерона и селенит натрия 15 мкм, температуре-80 ° c. | |
| ** Инсулин растворяется в 0.01 N hydroen хлорид, фильтруется через фильтр привязки низкопротеиновое 0,2 мкм и хранить при 4 ° c до 6 недель. | |
Таблица 1: факторы роста для новой среды распространения.
| dPBS * | 1 мл | b 3 мл |
| 10% раствор глюкозы | 60 МКЛ | 180 МКЛ |
| 2,5% трипсина | 10 МКЛ | 30 МКЛ |
| Dnase ** | 5 МКЛ | 15 МКЛ |
| * Дульбекко фосфат амортизированное saline | ||
| ** Дезоксирибонуклеаза | ||
| для 10 миллионов клеток | ||
| b для 30 миллионов клеток | ||
Таблица 2: Подготовка трипсина.
| Кондиционерами СМИ | 1 мл | b 3 мл |
| Ингибитор трипсина | 10 МКЛ | 30 МКЛ |
| для 10 миллионов клеток | ||
| b для 30 миллионов клеток |
Таблица 3: Подготовка ингибитор трипсина.
| DFHGPS * | 0,7 мл | 2.1 млb |
| FBS ** 20% | 0,2 мл | 0,6 мл |
| ДМСО *** 10% | 0,1 мл | 0,3 мл |
| * Пенициллин стрептомицином, DMEM, HEPES, глюкоза, F12 | ||
| ** Плода бычьим сывороточным | ||
| Диметилсульфоксид | ||
| для 5 миллионов клеток в одном флаконе | ||
| b три флаконов, 5 миллионов клеток/флакон | ||
Таблица 4: подготовка замораживания среднего.
| DFGHPS * для одной скважины в пластине 24-а | 1 мл |
| ТЭС ** | 17.3 МКЛ |
| 200 мм L-глютамина | 5 МКЛ |
| 10 мг/мл инсулина | 2.5 МКЛ |
| 20 мкг/мл-эпидермального фактора роста | 1 МКЛ |
| 10 мкг/мл лейкемия ингибирующего фактора | 1 МКЛ |
| 1 мг/мл Ламинин | 1 МКЛ |
| * Содержащие пенициллин стрептомицином, DMEM, HEPES, глюкоза, F12 | |
| ** Содержит 100 мкг/мл трансферрин, 100 мкм putresine, | |
| 20 Нм прогестерона и селенит натрия 30 Нм | |
Таблица 5: Подготовка ELL грунтование среды.
| DFGHPS * для одной скважины в пластине 24-а | 1 мл |
| ТЭС ** | 17.3 МКЛ |
| 200 мм L-глютамина | 5 МКЛ |
| 10 мг/мл инсулина | 2.5 МКЛ |
| 20 мкг/мл основные фибробластический фактор роста | 0.5 МКЛ |
| 5 мг/мл гепарина | 0.5 МКЛ |
| 1 мг/мл Ламинин | 1 МКЛ |
| * Содержащие пенициллин стрептомицином, DMEM, HEPES, глюкоза, F12 | |
| ** Содержит 100 мкг/мл трансферрин, 100 мкм putresine, | |
| 20 Нм прогестерона и селенит натрия 30 Нм | |
Таблица 6: Подготовка FHL грунтование среды.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Способность культуры и манипулировать hNSCs предоставляет важнейшим инструментом, который может использоваться для различных целей, от моделирования болезней человека для высокой пропускной способности наркотиков скрининг10,11,12,14, 15,16,17. Многие вопросы еще предстоит решить такие как человеческий мозг плода NSCs или их потомства чувствительны к ZIKV инфекции, ли различных штаммов ZIKV заразить NSCs с равной эффективностью и как инфекции во время нейронных развития приводит к микроцефалия. Мы использовали эту культуру НСК расследовать Зика вирус связанные невропатология11,14. С помощью трех штаммов клеток, изолированных от трех отдельных доноров, мы могл также индивидуальные различия восприимчивости к неврологического дефицита наблюдаемых следующие ZIKV инфекции11. Один из недостатков этого метода является доступность НСК образцы и обусловлено важное значение для надлежащей культуры среднего. Чтобы обойти этот барьер, обращайтесь соответствующий автор устроить передаче материала, как клетки, используемые в настоящем Протоколе не коммерчески доступных.
В vitro исследования с использованием hNSCs не только предоставляют уникальную возможность заглянуть в поведение основных стволовых клеток, они также обеспечивают отличную платформу для проведения доклинических исследований. Однако технические проблемы культивирования hNSCs может служить препятствием для их использования в качестве эффективного и воспроизводимые модели. В этом протоколе мы наметили ключевые шаги и методологии, которые могут быть использованы для снижения изменчивости в культивирования методов и урожайности культуры здорового и стабильного НСК стволовых клеток. Недостатком использования НСК нейросферы культуры является, что клетки очень чувствительны к любых раздражителей. Даже с подробного протокола выше важно обратить пристальное внимание на сколько обрабатываются колбы или блюда hNSCs, как тончайшие вариации на протокол может привести к изменениям в поведении нейросферы.
Наиболее важной частью этой бумаги методы это коктейль факторов роста и подготовка различных средств массовой информации. Если время удвоения НСК культуры является очень низким, или много adherie клетки к судну культуры (когда они должны быть не сторонник), первый шаг заключается в обеспечении соответствующей концентрации факторов роста используются и не истек. Все факторы роста в этом протоколе имеют очень короткий срок годности после размораживания (5-6 дней). Кроме того мы использовали факторы роста от нескольких компаний и заметил различия в качестве и концентрации, необходимые для поддержания культуры. Таким образом мы настоятельно рекомендуем использовать точный факторы роста, подробно изложены в Таблице материалов. Passaging шаг (шаги 3.1-3.22) является также распространенным источником ошибок. Если есть много мертвых клеток после процесса диссоциации, уменьшить количество времена закупорить вверх и вниз к разъединять клетки, как слишком много физической диссоциации может привести к смерти клетки. Кроме того если есть много кластеры клеток после диссоциации шаг, повышения бодрости или количество времена закупорить вверх и вниз, как эти кластеры будут быстро стать большой сфер, которые не будут оставаться жизнеспособными в культуре. Если культура поддерживается должным образом, инфекция с ZIKV является относительно простым.
В то время как ZIKV инфекция лечение, подробно изложены в настоящем Протоколе, можно использовать эту систему культуры НСК для широкого спектра исследований. Эта модель система может использоваться для экрана наркотиков, изучение индивидуальной чувствительности и расследования основных механизмов различных заболеваний и расстройств развития14. Эта система идеально подходит для геномных исследований, поскольку искусственный клетки не были генетически манипулировать и показать мало, чтобы без хромосомных аномалий, даже до 80 проходы10,11. Мы считаем, что эта культура система идеально подходит для моделирования в vitro как экологические раздражители, такие как инфекции, наркотики, алкоголь, токсинов, и т.д. могут влиять на развитие нервной системы.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют никаких конфликтов интересов объявить.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана средств от Джон S. Dunn фонда и института для человека инфекции и иммунитет университета Техаса Медицинское отделение (P.W.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Gibco | 11965-092 | |
| F12 | Gibco | 11765-054 | |
| Glucose (10%) | Sigma | G8644 | |
| HEPES (1M) | Corning/cellgro | 25-060-c1 | |
| Pen Strep (100x) | Gibco | 15140-122 | |
| Insulin | Sigma | I4011 | |
| L-Glutamine | Gibco | 25030-081 | |
| Transferrin | Sigma | T2036 | |
| Progesterone | Sigma | P8783 | |
| Putrescine | Sigma | P5780 | |
| Sodium selenite | Sigma | S5261 | |
| Heparin Sigma | Sigma | H3149 | |
| basic fibroblast growth factor | R&D system | 233-FB | |
| epidermal growth factor | R&D system | 236-EG | |
| leukemia inhibitory factor | R&D system | 7734-LF | |
| Laminin | Invitrogen | 23017-015 | |
| 2.5% trypsin | Gibco | 15090-046 | |
| Trypsin inhibitor | Sigma | T6522 | |
| Poly-D-Lysine hydrobromide(PDL) | Sigma | P6407-5MG | |
| B-27 supplement | Gibco/Invitrogen | 17504-044 | |
| Fetal bovine serum | Gibco | 16000-044 | |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma | D2650-100ml | |
| Dulbecco's phosphate-buffered saline | Corning/cellgro | 21-031-CV | |
| Bovine serum albumin | Sigma | A4378-25G | |
| Normal goat serum | Jackson ImmunoResearch Lab | 005-000-121 | |
| Triton X-100 | FisherBiotech | BP151-500 | |
| Nestin antibody | BD Transduction Laboratories | 611659 | 1:200 dilution |
| Class III beta-tubulin antibody (TuJ1) | Covnce | MMS-435p | 1:2000 dulution |
| GFAP antibody | Millipore | AB5804 | 1:1000 dilution |
| DAPI | Molecular Probes | D1306 | 1:2000 dilution |
| ZIKV antibody | World Reference Collection for Emerging Viruses and Arboviruses at the University of Texas Medical Branch | 1:2000 dilution | |
| Fluoromount G | SouthernBiotech | 0100-01 | |
| CO2 incubator | Thermo Forma | Model# 3110 | |
| Centrifuge | Thermo fisher Scientific | 75004221 | |
| Biological safety cabinet | Forma scientific Claas II A/B3 | Model# 1284 | |
| Freezer (-80 °C) | Forma scientific,Inc | model# 8516 | |
| Microscope(phase contrast image) | Hp 2230 workstation | Product#NOE25us#ABA | |
| Microscope (epifluorescent image) | Nikon Eclipse 80i | ||
| Confocal Microscope | Nikon TE2000-E microscope with C1si confocal system |
References
- Centers for Disease Control and Prevention. All countries and territories with active Zika virus transmisson. , (2016).
- Brasil, P., et al. Zika Virus Infection in Pregnant Women in Rio de Janeiro. N Engl J Med. 375 (24), 2321-2334 (2016).
- Hills, S. L., et al. Transmission of Zika Virus Through Sexual Contact with Travelers to Areas of Ongoing Transmission - Continental United States, 2016. MMWR Morb Mortal Wkly Rep. 65 (8), 215-216 (2016).
- Centers for Disease Control and Prevention. Facts about microcephaly. , (2016).
- Garcez, P. P., et al. Zika virus impairs growth in human neurospheres and brain organoids. Science. 352 (6287), 816-818 (2016).
- Li, C., et al. Zika Virus Disrupts Neural Progenitor Development and Leads to Microcephaly in Mice. Cell Stem Cell. 19 (5), 672 (2016).
- Tang, H., et al. Zika Virus Infects Human Cortical Neural Progenitors and Attenuates Their Growth. Cell Stem Cell. 18 (5), 587-590 (2016).
- Wu, K. Y., et al. Vertical transmission of Zika virus targeting the radial glial cells affects cortex development of offspring mice. Cell Res. 26 (6), 645-654 (2016).
- Jensen, J. B., Parmar, M. Strengths and limitations of the neurosphere culture system. Mol Neurobiol. 34 (3), 153-161 (2006).
- Wu, P., et al. Region-specific generation of cholinergic neurons from fetal human neural stem cells grafted in adult rat. Nat Neurosci. 5 (12), 1271-1278 (2002).
- McGrath, E. L., et al. Differential Responses of Human Fetal Brain Neural Stem Cells to Zika Virus Infection. Stem Cell Reports. 8 (3), 715-727 (2017).
- Svendsen, C. N., et al. A new method for the rapid and long term growth of human neural precursor cells. J Neurosci Methods. 85 (2), 141-152 (1998).
- Tarasenko, Y. I., Yu, Y., Jordan, P. M., Bottenstein, J., Wu, P. Effect of growth factors on proliferation and phenotypic differentiation of human fetal neural stem cells. J Neurosci Res. 78 (5), 625-636 (2004).
- Barrows, N. J., et al. A Screen of FDA-Approved Drugs for Inhibitors of Zika Virus Infection. Cell Host Microbe. 20 (2), 259-270 (2016).
- Jakel, R. J., Schneider, B. L., Svendsen, C. N. Using human neural stem cells to model neurological disease. Nat Rev Genet. 5 (2), 136-144 (2004).
- Lopez-Garcia, I., et al. Development of a stretch-induced neurotrauma model for medium-throughput screening in vitro: identification of rifampicin as a neuroprotectant. Br J Pharmacol. , (2016).
- Mich, J. K., et al. Prospective identification of functionally distinct stem cells and neurosphere-initiating cells in adult mouse forebrain. Elife. 3, e02669 (2014).
