Summary
Målet med denne protokol er at opnå høj rentabilitet og højt udbytte af hepatocytter og sinusformet endotelceller fra leveren. Dette opnås ved perfusing lever med en type IV collagenase løsning via portalen vene, efterfulgt af differential centrifugering hepatocytter og sinusformet endotelceller.
Abstract
Denne protokol viser en metode til at opnå høje afkast og levedygtighed for musen hepatocytter og sinusformet endotelceller (sek) egnet til dyrkning eller for at opnå cellelysater. I denne protokol, er Vena anvendes som webstedet for kateterisation, snarere end vena cava, da dette begrænser forurening af andre mulige celletyper i den endelige lever forberedelse. Der kræves ingen specielle instrumentation under hele proceduren. Vandbad bruges som en kilde til varme til at holde temperaturen af alle de buffere og løsninger. En standard peristaltisk pumpe bruges til at drive væsken, og en nedkølet bordplade centrifuge kræves til centrifugering procedurer. Den eneste begrænsning af denne teknik er placeringen af kateter inden for portåren, som udfordrende på nogle af mus i 18-25 g størrelsesområde. En fordel ved denne teknik er, at kun en vene er udnyttet for perfusion og adgang til vene er hurtig, som minimerer iskæmi og reperfusion i leveren, der reducerer leverens cellernes levedygtighed. En anden fordel i denne protokol er det let at skelne live fra døde hepatocytter af synet på grund af forskellen i cellulære tæthed under centrifugering trin. Celler fra denne protokol kan være brugt i cellekultur for enhver downstream ansøgning samt behandlet for nogen biokemiske vurdering.
Introduction
Collagenase perfusion af leveren til at opnå hepatocytter er blevet udført siden den tidlige 1950s og er blevet løbende forbedret1,2,3,4. En meget fin gennemgang af mange metoder, teknikker og reagenser, der anvendes i levercelle renseanlæg er blevet kompileret i Meyer mfl5. At opnå et tilfredsstillende udbytte af meget levedygtig hepatocytter og SEK er teknisk udfordrende. De mekaniske kræfter, der adskiller cellerne også kvaliteten af collagenase er nogle af de variabler, der er svære at styre. På grund af hepatocyt følsomhed over for mekaniske kræfter, er deres levedygtighed markant reduceret i sub-optimale betingelser, beder behovet for en protokol, der beskriver optimale betingelser for isolation. SEK synes ikke at være så følsomme over for mekanisk klipning. In situ perfusion med collagenase fordøjelse er langt den bedste metode til at forstyrre celle-celle knudepunkter for at få enkelt celle præparater fra leveren og andre organer såsom tarmen og milt6. Denne protokol viser en simpel metode til at indføre perfusion buffer ind i vena ved hjælp af en Udtrækkelig plast kateter snarere end et snit, der kan forårsage portåren til at kollapse, som beskrevet i Smedsrød mfl7.
Målet med dette manuskript er at vise de mest kritiske trin, der kræves for succes i proceduren lever overfloden. Disse skridt omfatter kateter placering, strømmen af perfusion væsker, og håndtering af væv efter fordøjelsen. Strømningshastigheder er justeret den naturlige sats af blodgennemstrømningen, men lav nok til at holde den Glisson kapsel intakt. Når leveren er korrekt fordøjet og celler adskilles i løsning, er celle rensning relativt simple om det udføres af differential centrifugering, plade vedhæftning, eller magnetisk bead rensning. Live hepatocytter har en højere massefylde og er let renset fra nonparenchymal celler (NPC) og døde hepatocytter med langsom centrifugering. For de fleste applikationer, plade vedhæftning til at adskille Kupffer celler (KC) og SEK er en fælles metode8, selv om der er rapporter, at det ikke producerer den bedste renhed af SEK9. KCs har en tendens til at overholde faste stive overflader hurtigt og petriskåle (standard polystyren) er det mest anvendte materiale til denne procedure. SEK eller KC rensning med brug af antistof konjugeret magnetiske perler er uden tvivl den bedste metode til betydelig rensning af disse celler, selvom proceduren tilføjer en anden 3-4 h til denne protokol og det samlede afkast er nedsat9. Denne betænkning viser i detaljer processen for en optimal lever perfusion, der typisk giver en høj antallet af levedygtige celler.
Protocol
Alle dyr procedurer skitseret i denne protokol er blevet godkendt af institutionelle Animal Care og brug udvalg (IACUC) på University of Lincoln - Nebraska under protokollen #1435.
1. forberedelse
- Forberedelse af løsninger og kultur medier
- Forberede alle dyrkningsmedier og buffer ifølge Tabel af materialer.
- Forberedelse af instrumenter
- Oprette et vandbad (> 10 L) på 42 ° C, en peristaltisk pumpe med variabel hastighed og klemmer til at holde kolber. Forberede buet saks og pincet (figur 1).
- På eller ved siden af vandbadet oprettet en bageplade (omkring 38 x 26 cm) med en Styrofoam pad (50 mL konisk rack), belagt med en absorberende underpad skåret i en 20 x 20 cm stykke (figur 1).
- Placer et stykke malertape (5-8 cm) i nærheden. Sted en 20 cm polyester sytråd i nærheden, der er skåret og klar til brug. Få en plastik kateter med en Udtrækkelig nål (7 mm x 19 mm, figur 1).
- Forberedelse af glasvarer
- Ved hjælp af klemmer, sted og immobilisere en 1 L målekolbe i et vandbad, der indeholder 200 mL 1 x PBS med en prop, der har to 1 mL pipetter går ind i løsningen. Gummi-kork er indskåret for at tillade recirkulation af væske i et lukket kredsløb.
- Med en anden clamp, placere en 125 mL målekolbe indeholdende 45 mL Buffer 2 sammen med en prop, der har to 1 mL pipetter, hvoraf den ene er væske i bunden af kolben og den anden som forbliver over den pågældende væske og blæser ilt i kolben.
Bemærk: Hver pipette i propperne vil have en hurtig afbryde adapter fastgjort til enden for nemt skifte af slangen. Ilt vil blidt strømmende i begge målekolber via pipette i den prop, der ikke er nedsænket i væsken. - Der er afsat to sterile crystallizing retter.
2. animalske Procedure
- Varm op til PBS og Buffer 2 løsninger til 42 ° C i et vandbad og cirkulere PBS for mindst 20 mL/min. slangen i et lukket kredsløb til at holde de flydende linjer varme. Fordyb eventuelle overskydende slanger i vandbad til at forblive så tæt som muligt til 42 ° C. Dræn den mandlige ende af slangen i 1 L målekolbe indeholdende PBS.
- Placer et stykke vat på den absorberende underpad og tilføje ca. 2 mL 30% isofluran (består i polyethylen glycol 200 som formindsker fordampning satsen for isofluran) på bomuld bolden ved hjælp af en overførsel pipette.
- Afhente musen i halen, placere den i en af de crystallizing retter, og derefter hurtigt vælte parabol på vat, således at musen har en lille plads til at inhalere anæstesi. Observere åndedrætsfrekvens af musen og sikre, at musen er effektivt under anæstesi.
Bemærk: Vejrtrækning skal være langsommere og dybere, halen slatne, og poterne nonresponsive til knivspids test under anæstesi; Se IACUC retningslinjer for yderligere detaljer. - Mens musen sker under anæstesi (dette tager 1-2 min.), forberede tønde af en 10 mL sprøjte ved at trække stemplet og indsætte en lille vat. Tilføje 1-2 mL 30% isofluran med en overførsel pipette til VAT inde i tønden og Placer tønden tidsubegrænsede ned på et bord mens du venter på musen til at blive bevidstløs.
- Hurtigt tage crystallizing fadet, flip musen på ryggen og læg sprøjten tønde over sin næse. Dobbelttjekke vejrtrækning, tå knivspids og slatne hale. Alle svar til tå knivspids og slatne hale angiver, at musen ikke er fuldt ud under anæstesi. Hold sprøjten tønde over snude at opretholde bevidstløshed.
- Sted tommelfinger stifter gennem poter mus, med arme og ben strakt i liggende stilling. Våde maven og brystkassen med 70% isopropanol eller ethanol.
- Med den lige pincet i den ene hånd, løft huden nær bunden af maven. Med en saks i anden hånden, skære telt hud og bughinden. Snittet skal være vandret eller på tværs i bunden af telt huden. Sørg for at skære gennem alle lag af huden og bughinde for at få adgang til tarmen. Skære lateralt omkring maven op til brystkassen på begge sider uden nicking nogen af organer.
- Afbrød flap af huden ved at skære på tværs af de nederste ribben bur. Flytte tarmene til højre med bagsiden af pincet til at eksponere Vena.
Bemærk: Blødning fra dyret skal være minimal; dyret bør stadig vejrtrækning og under dybe anæstesi. - Placer den lukkede buet pincet nedenunder portåren mellem lever og overlegen pancreaticoduodenal vene (figur 3 pil).
- Åbn pincet nedenunder Vena. Fatte tråden og træk det forsigtigt så at det er centreret nedenunder Vena. Bind en overhånd knude omkring Vena uden gjorden det ned.
- Placer den buet pincet under portalen vene og trække det forsigtigt mod halen af musen til at ordne vene (figur 4A).
- Med kateter i anden hånden, Placer facet af nålen opad og parallel med den nederste del af portalen vene nær pincet (fig. 4B).
- Forsigtigt punktere venen med nål (fig. 4C). Sikre facet af nålen er i lumen af venen. Trække den fjederbelastet nål og fortsætte med at skubbe polymer kateteret gennem en blodåre, indtil facet er nær den venøse forgrenede. Dette er i leveren. Hvis kateteret er placeret korrekt, vil en bagsiden-flow af blod være synlig. (Figur 4D).
- Stramme overhånd knude og trække det på kateter til at hjælpe med at stabilisere det. Straks slå ned pumpen sats fra 20 mL/min. til 4 mL/min og skåret en anden større blodkar for dræning. Skære aorta abdominalis for optimale resultater.
- Placer den mandlige ende af slangen til hunkønsenden af kateter (figur 5A). Sikre, at der er ingen luftbobler i linjen. Pas på, at kateteret ikke er enten skubbet ind i leveren eller ud af venen. Placeringen af tråden er ikke afgørende, men det hjælper med at forhindre back-flow ud af venen og hjælper med at holde kateteret i den korrekte position (figur 5B, C).
- Brug afdækningstape til at immobilisere slange på underpad. Bruge den lige pincet til at klemme spildevand blodkar til at oppuste leveren et par gange at sikre, at alle blod har drænet ud (fig. 5D).
Bemærk: Standard laboratorium tape kan ikke arbejde; afdækningstape vil dog blive hængende til underpad, selv under våde forhold.
3. lever Perfusion
- Mens leveren skylning med PBS, måle ud af ca. 24 mg Collagenase Type IV og anbringes i kolben indeholdende 45 mL Buffer 2 i vandbad. Vær sikker på at swirl væsken i kolben, så at collagenase er helt opløst og placere kolben tilbage i klemme, så den flydende indeholdende del af kolben er fuldt neddykket i vandet.
- Observere ændring i farve af leveren, som det er skyllet med PBS. Ændre udstrømning slangen fra 1 L målekolbe til 125 mL kolbe. Ikke Tillad luftbobler til at flyde ind i leveren.
- Når perfusion buffer når leveren, kort klem stramt spildevand blodkar for at opbygge pres inden for fartøjet og lad denne væske til at fylde alle kamre af leveren. Vær sikker på ikke at afskære dræning for længe, som der kan briste tyndt bindevæv omkring leveren (Glissons kapsel) og ødelægge perfusion eller flow af væske inden for kapillær sengen af leveren.
- Tillad Buffer 2 med collagenase til perfuse gennem leveren, indtil alle 45 mL har flød gennem væv.
Bemærk: Hvis det lykkes, den Glisson kapsel bør være adskilt fra parenkym eller levervævet og leveren selv skal vises amorfe. - Tilsættes ca 10 mL Buffer 1 til andre crystallizing fadet og placere den ved siden af musen.
- Fjerne kateteret og slukke pumpen.
- Med lige pincet og saks, klippe leveren fra musen. Hvis collagenase fordøjelsen var meget effektiv, kan det være nødvendigt at have en ren og steril ske dels at øse leveren fra musen og placere den i Buffer 1.
4. hepatocyt rensning
Bemærk: Manipulation af cellerne er udført i en steril vævskultur hætte til at begrænse forureningen, hvis cellerne skal kulturperler i alle efterfølgende trin.
- Brug steril teknik, grab leveren med pincet og Ryst forsigtigt celler fra leveren. Rive ud eller trække sig tilbage den Glisson kapsel: bufferen bliver uigennemsigtigt, som cellerne er rystet fra leveren.
- Hæld den celle løsning i en 50 mL konisk med en 100 µm filter placeret over toppen.
- Tilføje flere Buffer 1 til de lever rester og fortsætte med at ryste ud celler. Fortsætte indtil leveren vises celler eller hvornår den ufordøjede dele af leveren ikke give længere celler.
- Hæld den cellulære væske i en anden 50 mL konisk indeholdende en 40 µm filter.
- Der centrifugeres den koniske i en swingende spand rotor på 100 x g i 3 min.
Bemærk: Brug ikke den maksimale bremse, da dette kan løsne den celle pellet. Bruge bremsen på 80%, som er tilstrækkelig for alle resterende centrifugering trin ved 4 ° C - Hæld supernatanten (som indeholder NPCs og døde hepatocytter) ind i en ren konisk og placere den på is. Sikre, at dette sker i én bevægelse til at observere pellet overholdelse.
- Resuspenderes i 40 mL Buffer 1. Gentag trin 4.5 og 4.6. Resuspenderes i 40 mL Buffer 3. Gentag trin 4.5 og 4.6 to gange.
- Resuspend de renset hepatocytter i varm DMEM + 10% FBS + 2 x Penicillin-Streptomycin (Pen/Strep).
- Hvis cellerne er kulturperler på kollagen overtrukne plader, tillade dem at overholde for 1t og erstat medierne mindst én gang som dette vil forhindre enhver spirende bakterielle kontaminanter.
- Gøre kollagen belagt pladerne ved at inkubere dem med 0,05% kollagen i 0,001% eddikesyre i mindst 1 time ved 37 ° C, og derefter vaske med 1 x PBS.
- Hvis hepatocyt levedygtighed er lav og der er et ønske om at få renset high-levedygtige hepatocytter og derefter bruge følgende protokol tilpasset fra Kreamer mfl10.
- Mix 9 rumfang af PVP løsning (Percoll, en 23% w/w opløsning af vand og 15-30 nm kolloid silica partikler coated i polyvinylpyrrolidon for tæthed centrifugering) og 1 rumfang af 10 x HBSS at lave en iso-osmotisk PVP løsning (SIP).
- Tilføje 24 mL af SIP til en steril 50 mL konisk, der kan være gemt i disse betingelser for op til 2 måneder ved 4 ° C.
- Justere hepatocyt koncentration på 5-10 × 106 celler/mL med næringssubstratet som har noteret i trin 4.8.
- Tilsættes 25 mL cellesuspension til hver 24 mL SIP indeholdende konisk og mix af blid inversion. Tætheden af denne løsning er 1,06 g/mL.
- Der centrifugeres den koniske på 50 x g i 10 min. ved 4 ° C.
- Opsug SIP og flokkulant, og pelleten cellerne i HBSS.
- Cellerne vaskes ved centrifugering ved 50 x g i 10 min. ved 4 ° C.
- Gentag trin 4.10.6 endnu en gang og derefter resuspend celler i vækstmediet.
5. SEK rensning
- Sammenpresse cellerne i supernatanter fra trin 4.6 af spinning rør på 163 x g i 10 min. udsmid analysere fra rør og resuspend alle celle pellets i 5 mL af RPMI uden serum og samle dem i et rør.
- Når alle piller har været samlet, skal du føje RPMI til endelige mængden af 35 mL.
- Der centrifugeres i poolede konisk på 25 x g til 3 min. omhyggeligt Opsug den top 25 mL af RPMI med 25 mL pipette og sted dette medie som indeholder NPCs i en ren 50 mL konisk på is.
- Tilsættes 25 mL frisk RPMI tilbage til røret og resuspenderes.
- Gentag trin 5.3 for en anden vask og pool supernatanten. Smid de resterende 10 mL af medier og træpiller (pellet består primært af døde hepatocytter). Der centrifugeres poolede supernatanten ved 163 x g i 10 min.
- Under centrifugering, forberede PVP løsning forløb i en 50 mL konisk.
- Der tilsættes 15 mL 50% PVP løsning til de 50 mL konisk efterfulgt af 20 mL 25% Percoll belagt med en pipette til den langsomste udslyngning hastighed. Sørg for at observere en brydning linje på 15 mL varemærket, der afgrænser de to lag, da dette er, hvor sek og KC/Scott bliver samlet efter centrifugeringen.
- Resuspend celler tidligere pelleted i trin 5.5 i 10 mL af kolde RPMI og overlay dem på PVP løsning gradient. Vær sikker på at opretholde en klar afgrænsning mellem de to lag. Der centrifugeres gradient på 805 x g i 20 min. med en bremse på 50%.
- Opsug fra toppen ned retning til 20 mL mærket på røret og kassér dette materiale. Med 5 mL overførsel pipette, indsamle sek og KCs, der er placeret på 25/50% interface. Kassér eventuelle brune klumper af celler, som disse er døde hepatocytter.
- Placer cellerne i en 50 mL konisk og tilføje RPMI op til 50 mL mærket til at fortynde ud PVP løsning. Der centrifugeres ved 200 x g i 10 min, med 80% bremse.
- Opsug og supernatanten og resuspenderes mens vaske ud kegle i den koniske i 12 mL varm RPMI.
- Adskille sek fra KCs ved at placere supernatanten i en polystyren petriskål og inkuberes i en fugtig vævskultur inkubator for 8 min ved stuetemperatur.
- Opsug medier med 25 mL pipette og skyl pladen med det samme medie, med pipette angivet med den laveste hastighed til at indsamle de resterende sekunder mens KCs overholde pladen.
- Centrifugeres SEK på 200 x g i 10 min. og resuspend i RPMI + 5% FBS + Pen/Strep. Derefter titer celler og plads i kollagen-belagt kultur retter.
Representative Results
En demonstrational, raffineret metode for leveren perfusion og rensning/berigelse af hepatocytter og SEK præsenteres her, giver detaljerede tips til optimal celle rensning/berigelse svarende til andre trykte rapporter udarbejdet i dette henvises til anmeld 5. De kritiske trin, der bestemmer succes for cellulære rensning forekomme i rute og tekniske detaljer i proceduren collagenase perfusion og er skitseret i denne protokol. Set-up for apparatet er forholdsvis enkel og omkostningseffektiv med Sædvanligt laboratorieudstyr, i modsætning til andre systemer, der er blevet offentliggjort11 (figur 1). I dette set-up sidder bakken holder musen på vandbad med nogle af de overskydende slanger i vandbad til at holde temperaturen af væsker perfusing i leveren. Apparatet færdiggøres som vist her kan anvendes for mus og rotter, med en lidt anden geometri til rotte lever perfusion12 (figur 2).
I denne procedure, leveren er perfunderet via portalen vene i stedet for den vena cava, (som er en anden populær perfusion rute) på grund af sin brugervenlighed adgang inden for maven, og at venen feeds direkte ind i leveren. Fremviseren skal være opmærksom at Vena har flere små grene, som kan kortslutte perfusate, og kateteret placeres forbi disse filialer for optimal succes13 (figur 3). Når portalen vene er identificeret, bruges buet pincet til at tegne en kirurgisk sutur eller polyester tråd under Vena mellem leveren og den overlegne pancreas-duodenal vene. Pincet bruges også til at ordne Vena, som er under positive blodtryk (figur 4A). Nålen i kateteret placeres parallelt og ved siden af vene (fig. 4B) og facet forsigtigt bør indsættes i lumen af vene (fig. 4C). Korrekt placering vil blive angivet af blod vises langs kateteret. Når nålen er trukket kateteret skal være stabiliseret med en tråd bundet over det og blodtrykket vil tvinge blod op gennem kateteret. Det anbefales, at kateteret tilsluttes pumpe slangen, før blod spild ud (figur 4D). Når pumpen slanger er forbundet, straks skar et større blodkar som vena cava eller aorta abdominalis for blod/væske dræning (figur 5A). Det er normalt nødvendigt at skære siden af den abdominale væg af musen for tilstrækkelig dræning, som en ophobning af blod i maven gør det svært at visualisere perfusion proces, og blod kan bære over til celle rensning (figur 5 B). Når PBS begynder at perfuse leveren, leveren vil Blancher med fravær af blod (figur 5C). Hvis det kun er et par af lapper Blancher, så den sandsynlige årsag er, at kateteret er placeret for langt inde i leveren og skal være bakkes ud langsomt. Når placeringen af kateteret er bekræftet, skal du bruge vandfast afdækningstape til at sikre slangen på plads. Generelle laboratorium tape er normalt ikke tilstrækkeligt. For at bekræfte korrekt placering af kateteret, klemme skåret blodkar til at ophøre med dræning og observere øget tryk i leveren. Gøre dette vil støtte i rødmen blod ud af leveren (fig. 5D). Dette skal også ske, når collagenase løsning i første omgang går ind i leveren til at sikre, at alle fliger er udsat for collagenase. Efter collagenase løber løsning ud, en god collagenase fordøjelsen er vejledende ved separation af den Glisson kapsel fra parenkym.
Den generelle procedure for cellulære rensning er skitseret i figur 6 og figur 7 hvor hepatocytter høstes tidligt i proceduren under den lave hastighed spins og er meget ren efter 4 vasker i BSA-holdige buffere (figur 8 ). SEK er co renset med KCs på en PVP gradient (figur 9A) og derefter adskilt af selektiv vedhæftning på en kollagen-belagt polystyren petriskål. Renheden af SEK ved hjælp af denne metode er 83-90% ren og i vid udstrækning afhænger af den samlede effektivitet af collagenase fordøjelsen (fig. 9B). Kvantitative målinger ved hjælp af lys mikroskopi (som både hepatocytter og SEK har kendetegn fra andre celler) viser, at i en repræsentativ forberedelse, hepatocytter er næsten 100% ren og SEK er lidt over 89% ren (tabel 1). Alternativt kan en højere berigelse af SEK fremkommet ved magnetisk kolonne adskillelse efter PVP gradient, selv om det er uden for rammerne af denne protokol. Mere information om magnetisk separation af SEK og KCs kan findes i Meyer et al. 9 og Liu et al. 14 det skal erindres, at levedygtigheden af hepatocytter hurtigt aftager i et utilstrækkeligt fordøjet leveren, men det er ikke nødvendigt sandt for NPCs. utilstrækkeligt fordøjet lever også producere mere celleaffald, som ikke er helt elimineret i centrifugering trin.
Figur 1 : Skematisk fremstilling af perfusion suite. Kolberne er holdt på plads af klemmer (ikke vist); slangesættet indeholder væske er byttet fra 1L målekolbe 125 mL kolben under proceduren, der er repræsenteret ved den røde stiplede linje. Bemærk, at ilt foder ikke boble direkte ind i løsningerne i kolberne. Flyderne bør også takkede for at tillade et lukket kredsløb flydende flow med slangen indsættes i kærven. Dette er kritisk under opvarmning af slangen og for udslyngning af alle luft i slangen. Air bløder er sammensat af T-stikket, som er tilsluttet Tygon slanger og knivspids klemmer for hurtig åben og lukning af systemet. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2 : Perfusion suite under mus lever perfusion. Bakke med musen er placeret på hjørnet af vandbadet. Ilt er afbrudt fra collagenase løsning som der var allerede iltet under warm-up. Placering af varer er A) ilt linjer, B) 1 L målekolbe indeholdende PBS, C) 125 mL kolbe indeholdende buffer 2 med collagenase, D) pumpe, E) pumpe kontrolelementer, F) boble fælde, G) væske linje kører fra kolben, gennem pumpen og til musen. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3 : Billede af Vaskulaturen af musen maven. Indsættelse af kateteret bør være lige under gastrisk og pancreas vene udfletningerne bænken Vena (grøn prik) og tip bør placeres i nærheden af de venstre og højre hepatisk portal vener (gul prik) som danner en gaffel i de vigtigste lapper af leveren. Når korrekt placering er opnået, skal kateteret være stabiliseret med tråd ved hjælp af en simpel overhånd knude. K = nyre, L = leveren, SI = tyndtarmen. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4 : Kateter placering i portåren. (A) pincet bruges til at sikre blod overfyldning af portalen vene og ordne vene til kateter placering. (B) kateteret er linet parallelt med Vena med facet op. (C) facet af nålen i kateteret er sat ind i venen, ikke gennem en vene. (D) nålen af kateteret er tilbagetrukket og blod vil tilbagestrømning gennem kateteret som angivet ved spidsen af pincet. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5 : Korrekt lever perfusion. (A) efter kateter placering, kvindelige Luer slutningen af kateteret tilslutning til den mandlige Luer slutningen (skåret fra en 1 mL sprøjte) af pumpe slangen. (B) efter at skære en af de store faldende blodkarrene, blodet og PBS er drænet fra underlivet ved skæring side af musen med en saks. (C) leveren bør Blancher mens blodet er skyllet ud og (D) vil svulme når under pres ved at klemme shut cut blodkar med pincet. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 6 : Skematisk oversigt over hepatocyt rensning og NPC isolation. De fleste af skridt, centrifugering har til formål at fjerne levende og døde hepatocytter fra de ikke-parenkymalt celler. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 7 : Skematisk oversigt over sek berigelse og oprensning. NPCs er adskilt af PVP gradient efterfulgt af SEC adskillelse af korte vedhæftning til en standard polystyren plade. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 8 : Renset hepatocytter. Hepatocytter var belagt på kollagen belagt vævskultur plader med DMEM + 8% FBS + Pen/Strep og inkuberes i 6 h efterfulgt af billedsamling af et mikroskop på 400 X. Baren er lig med 20 µm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 9 : SEK rensning. (A) SEK og KCs blev indsamlet fra 25/50% PVP grænsefladen (gule pile) og skyllet med serumfrit medium. (B) den sek blev adskilt fra KCs af selektiv vedhæftning på standard petriskåle, vasket og belagt på kollagen-belagt væv kultur retter i RPMI + 5% FBS. Billeder er taget af en EVOS inverteret mikroskop på 400 X. Baren er lig med 20 µm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 10 : Scanning Elektron Mikroskopi af mus lever anatomi. En mus lever var perfunderet med PBS efterfulgt af fiksativ (100 mM natrium cacodylate, 12 mL 25% glutaraldehyd, 15,6 mL 16% PARAFORMALDEHYD, 2,65 mM calciumchlorid, 180.2 mM saccharose, blandet i 100 mL opløsning) med en hastighed på 1 mL/min. for 4 min. væv blev skåret i skiver og forberedt til scanning Elektron Mikroskopi. Billeder blev indsamlet på en Field Emission SEM på 10, 000 X. Gule pile angiver microvilli mellem hepatocytter. Baren er lig med 5 µm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 11 : Visualisering af døde versus levende hepatocytter. Efter 2 vasker med Buffer 1, kan pelleted hepatocytter blive vurderet for live/døde forholdet med det blotte øje. En lysere pellet (til venstre) viser, at mindst halvdelen af hepatocytter er døde. De mørkere pellet til højre er mere fast pelleted til bunden af røret og er mere end 90% live. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
| Tabel 1: Celle rensning | ||
| Celletype | % målceller | % andre celler |
| Hepatocytter | 99 | 1 |
| Sinsusoidal endothelial celler | 89,1 | 10.9 |
Tabel 1: Vurdering af celle renhed ved lysmikroskopi.
Discussion
Denne protokol fremhæver værktøjer der er til rådighed og det vil give brugeren en høj sats for succes i denne procedure. En vellykket perfusion er grundlæggende for enhver downstream ansøgning, når du arbejder med primærelementer.
Der er et par kritiske trin i proceduren, der bestemmer succes. Første, placering af kateter spidsen inden for portåren skal være korrekte. Hvis placeret for langt inde i leveren, perfunderet kun de mindre kamre. Spidsen bør være lige under de højre og venstre grene af portalen vene. Fordelen ved at bruge en polymer-composite kateter over en nål er, barb af nålen er mere tilbøjelige til at rive venen under perfusion end et kateter. Andet, collagenase kvalitet og kvantitet bestemme fordøjelsen effektiviteten af leveren. I denne procedure, præ-kvalificeret collagenase Type 4 blev brugt og det er genopslemmes på 0,5 mg/mL i Buffer 2 Hvis collagenase aktivitet til analyseres er større end 900 IU.
For enden af collagenase perfusion bør leveren bevare et noget mørkt tan brun farve. Hvis det er en lys tan farve, så er de fleste af hepatocytter døde. Leveren bør være falder fra hinanden når det er skåret fra musen. I de bedste betingelser, kan leveren være skovlede ud af kroppen hulrum af musen med en lille ske. Lever i denne tilstand giver altid meget høj cellernes levedygtighed. Hvis det tager mange forsøg på at ryste cellerne fra hinanden, hvis leveren er stadig fast under udvinding, eller hvis der er en masse af nødvendige kraft til at flytte hepatocytter gennem filtrene, vil derefter hepatocytter have en lavere rentabilitet. Hepatocytter er dækket med microvilli, som tillader dem at have en meget høj areal (figur 10). Ufuldstændig fordøjelse bevarer celle-celle kryds mellem hepatocytter, og mekanisk klipning vil rive plasmamembran fra hinanden. In situ perfusion med collagenase er den bedste metode til at bryde fra hinanden cellerne og opretholde høje levedygtighed. I Figur 11, blev to hepatocyt præparater er lavet i som cellen pellets sammenlignet efter et par vasker i Buffer 1. Pellet til venstre er lysere og indeholder en celle levedygtighed på omkring 50%. Pellet til højre er mørkere og har en levedygtighed på 92%. På samme måde, når væsken hældes fra de 50 mL konisk, de mørkere pellet er stille i røret, i modsætning til de lysere pellet, som vil glide i røret som væsken hældes ud. Lavere cellernes levedygtighed eller ineffektive perfusions kan opstå, når leveren har høje niveauer af sklerose.
Da levende hepatocytter har en højere vægtfylde end døde hepatocytter, vil centrifugering procedurer resultere i et præparat, der er meget ren i levedygtige hepatocytter15. Hvis der er en betydelig mængde af døde hepatocytter, (som ofte opstår, når betingelserne er suboptimal), levende kan celler være yderligere beriget og adskilt fra døde celler ved hjælp af PVP forløb. Derudover da levende hepatocytter pellet hurtigere end døde hepatocytter, øges aspiration af de top 3rd af toerstoffet også forholdet mellem levende døde celler i toerstoffet. Disse procedurer er hurtige og nemme metoder til at adskille lever fra dødt hepatocytter og celle debris når behov for10,16. Dette er især nyttigt, hvis prøven er kostbar, og kun et par millioner celler er påkrævet for eksperimentet.
Afslutningsvis, er dette en nem og effektiv metode for høst hepatocytter og SEK fra leveren. I løbende priser er omkostningerne til at udføre denne procedure, herunder alle reagenser og engangsartikler under 75 USD pr. forberedelse. Hvis flere mus er ønsket, er det bedst at fortsætte med en hepatocyt rensning og holde NPC fraktion på is, indtil alle mus der er blevet behandlet. NPCs er generelt stabilt på isen for mindst 5 h, men længere tid er ikke blevet testet i dette laboratorium.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at oplyse.
Acknowledgments
Finansieringen er fastsat i del af NIH fra grant R01HL130864.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 L Erlenmeyer flask | Fisher Scientific | S63274 | |
| 250 mL Erlenmeyer flask | Fisher Scientific | S63271 | |
| silicone tubing | Cole-Parmer | 96400-14 | This tubing runs from the flasks through the pump to the T connector and then to the 1.0 mL syringe that is connected to the catheter. |
| Tygon tubing | Fisher Scientific | R3603 | Used as an adaptor between 96400-14 and pipettes and T connector. This may also be used for the oxygen tubing. |
| T-connectors | Cole-Parmer | EW-06294-82 | |
| Quick dissconnects | Fisher Scientific | 6150-0010 | |
| Pinch Clamps | Fisher Scientific | 6165-0002 | |
| Masterflex L/S Variable speed Pump, model 7553-70 | Cole-Parmer | EW-07559-00 | Periplastic pump with variable speed |
| Pump head, model 7014-20 | Cole-Parmer | EW-07014-20 | |
| glass graduated 1.0 mL pipettes | Fisher Scientific | 13-678 | |
| curved non-serrated scissors | Fine Science Tools | 14069-12 | |
| Dumont forceps | Fine Science Tools | 11252-20 | |
| Curved forceps | Fine Science Tools | 13009-12 | |
| 10 mL syringe | Fisher Scientific | 03-377-23 | Only barrel of syringe will be needed |
| sterlized spoon | Home supply store | ||
| Cotton ball(s) | Home supply store | ||
| Polyester sewing thread | Home supply store | ||
| Masking tape | Home supply store | ||
| thumb tacks | Home supply store | ||
| styrofoam pad | 50 mL conical rack | ||
| cookie/baking sheet | Home supply store | ||
| Absorbant underpads | Fisher Scientific | 14-206-64 | |
| 19 L water bath | Fisher Scientific | TSCOL19 | |
| BD Insyte Autogaurd Shielded IV Catheter 24 guage | Becton Dickinson | 381412 | Plastic cathetar with retractable needle |
| Crystallizing dishes 100x50 | VWR | 89000-290 | |
| Polystyrene petri dishes | Sigma Aldrich | P5481-500EA | |
| 50 mL conical tubes | Fisher Scientific | 12-565-270 | |
| graduated pipettes (5 mL) | Fisher Scientific | 170355 | |
| graduated pipettes (25 mL) | Fisher Scientific | 170357 | |
| EasyStrainer 100 μM | Greiner bio-one | 542000 | 100 μm filter |
| EasyStrainer 40 μM | Greiner bio-one | 542040 | 40μm filter |
| Sterile transfer pipettes | Fisher Scientific | 13-711-20 | |
| Refrigerated swinging bucket centrifuge | Sorvall Legend XTR | 75-217-406 | Centrifuge with swinging bucket rotar |
| Galaxy 170R tissue culture incubator | Eppendorf | CO170R-120-0000 | Humidified tissue culture incubator |
| Reagents | |||
| Name | Compound | Grams (g/L) | Millimolar (mM) |
| Buffer 1, pH 7.4 | NaCl | 8.3 | 142 |
| KCl | 0.5 | 6.7 | |
| HEPES | 2.4 | 10 | |
| BSA | 15 | 0.226 | |
| Buffer 2, pH 7.4 | NaCl | 3.9 | 66.74 |
| KCl | 0.5 | 6.71 | |
| CaCl2 | 0.7 | 6.31 | |
| HEPES | 24 | 100 | |
| BSA | 15 | 0.226 | |
| Phenol Red | 0.01 | 0.03 | |
| Buffer 3, pH 7.4 | NaCl | 8 | 137 |
| KCl | 0.35 | 4.7 | |
| MgSO4 | 0.08 | 0.66 | |
| CaCl2 | 0.18 | 1.62 | |
| HEPES | 2.4 | 10 | |
| BSA | 15 | 0.226 | |
| PBS, pH 7.4 | NaCl | 8 | 137 |
| KCl | 0.2 | 2.7 | |
| Na2HPO4-7H2O | 1.15 | 4.3 | |
| KH2PO4 | 0.2 | 1.4 | |
| Other reagents | |||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Percoll (PVP solution) | GE Healthcare | 288555 | |
| Collagenase Type IV | Sigma Aldrich | C5138 | |
| Isoflurane | Abcam | ab144581 | |
| Hepatocyte Growth Medium | |||
| DMEM | Gibco | 11965118 | |
| 10% by volume fetal bovine serum | Gibco | 10437010 | |
| Pen/Strep (2x) | Gibco | 15140148 | |
| Long-term Hepatocyte Growth Medium | |||
| DMEM | |||
| 10% by volume fetal bovine serum | Gibco | 10437010 | |
| Pen/Strep (2x) | Gibco | 15140148 | |
| Glucagon | Sigma | G3157-2mg | 14 ng/mL |
| Insulin | Sigma | I9278-5mL | 0.5 U/mL |
| Hydrocortisone | Sigma | H0888-1g | 7.5 mg/mL |
| Epidermal Growth Factor | BD Biosciences | 354001-100ug | 20 ng/mL |
| LSEC medium | |||
| RPMI | Gibco | 11875119 | |
| 10% by volume fetal bovine serum | Gibco | 10437010 | |
| Pen/Strep (2x) | Gibco | 15140148 |
References
- Berry, M. N., Friend, D. S. High-yield preparation of isolated rat liver parenchymal cells: a biochemical and fine structural study. J Cell Biol. 43 (3), 506-520 (1969).
- Seglen, P. O. Preparation of isolated rat liver cells. Methods Cell Biol. 13, 29-83 (1976).
- Miller, L. L., Bly, C. G., Watson, M. L., Bale, W. F. The dominant role of the liver in plasma protein synthesis; a direct study of the isolated perfused rat liver with the aid of lysine-epsilon-C14. J Exp Med. 94 (5), 431-453 (1951).
- Edstrom, S., Ekman, L., Ternell, M., Lundholm, K. Isolation of mouse liver cells: perfusion technique and metabolic evaluation. Eur Surg Res. 15 (2), 97-102 (1983).
- Meyer, J., Gonelle-Gispert, C., Morel, P., Buhler, L. Methods for Isolation and Purification of Murine Liver Sinusoidal Endothelial Cells: A Systematic Review. PLoS One. 11 (3), 0151945 (2016).
- Sies, H. The use of perfusion of liver and other organs for the study of microsomal electron-transport and cytochrome P-450 systems. Methods Enzymol. 52, 48-59 (1978).
- Smedsrod, B. Protocol for preparation of mouse liver Kupffer cells and liver sinusoidal endothelial cells. Munin open research archive. , University of Tromsø. 1-10 (2012).
- Smedsrod, B., Pertoft, H., Eggertsen, G., Sundstrom, C. Functional and morphological characterization of cultures of Kupffer cells and liver endothelial cells prepared by means of density separation in Percoll, and selective substrate adherence. Cell Tissue Res. 241 (3), 639-649 (1985).
- Meyer, J., Lacotte, S., Morel, P., Gonelle-Gispert, C., Buhler, L. An optimized method for mouse liver sinusoidal endothelial cell isolation. Exp Cell Res. 349 (2), 291-301 (2016).
- Kreamer, B. L., et al. Use of a low-speed, iso-density percoll centrifugation method to increase the viability of isolated rat hepatocyte preparations. In Vitro Cell Dev Biol. 22 (4), 201-211 (1986).
- Meijer, D. K., Keulemans, K., Mulder, G. J. Isolated perfused rat liver technique. Methods Enzymol. 77, 81-94 (1981).
- Gopalakrishnan, S., Harris, E. N. In vivo liver endocytosis followed by purification of liver cells by liver perfusion. J Vis Exp. (57), e3138 (2011).
- Cook, M. J. The Anatomy of the Laboratory Mouse. , Academic Press. 2008 edn (1965).
- Liu, J., et al. Advanced Method for Isolation of Mouse Hepatocytes Liver Sinusoidal Endothelial Cells, and Kupffer Cells. Methods Mol Biol. 1540, 249-258 (2017).
- Knobeloch, D. E., Ehnert, S., Schyschka, L., Buchler, P., Schoenberg, M., Kleeff, J., Thasler, W. E., Nussler, N. C., Godoy, P., Hengstler, J., Nussler, A. K. Human Hepatocytes: Isolation, Culture, and Quality Procedures. Methods in Molecular Biology. 806, 99-120 (2012).
- Clarke, B. L., Weigel, P. H. Recycling of the asialoglycoprotein receptor in isolated rat hepatocytes. ATP depletion blocks receptor recycling but not a single round of endocytosis. J Biol Chem. 260 (1), 128-133 (1985).
