Summary
Målet med detta protokoll är att få hög lönsamhet och hög avkastning av hepatocyter och sinusformad endotelceller från levern. Detta sker genom startas levern med en typ IV kollagenas lösning via portalen ven, följt av differentiell centrifugering att få hepatocyter och sinusformad endotelceller.
Abstract
Detta protokoll visar en metod för att få hög avkastning och lönsamhet för mus hepatocyter och sinusformad endotelceller (SEK) lämplig för odling eller för att erhålla cell lysates. I detta protokoll används portalen ven som platsen för kateterisering, i stället för vena cava, eftersom detta begränsar förorening av andra möjliga celltyper i slutliga lever preparatet. Det krävs ingen särskild instrumentation under hela förfarandet. Ett vattenbad används som värmekälla för att bibehålla temperaturen av alla buffertar och lösningar. En standard peristaltiska pumpen används för att driva vätskan och en kyld bordsskiva centrifug krävs för centrifugering förfaranden. Den enda begränsningen av denna teknik är placeringen av katetern inom portalen ven, vilket en utmaning på några av möss i intervallet 18-25 g storlek. En fördel med denna teknik är att endast en ven utnyttjas för perfusionen och tillgång till venen är snabbt, vilket minimerar ischemi och reperfusion av levern som minskar hepatisk cellernas viabilitet. En annan fördel med detta protokoll är att det är lätt att skilja live från döda hepatocyter av syn på grund av skillnaden i cellulära densitet under centrifugering stegen. Celler från detta protokoll kan vara används i cellodling för alla efterföljande program samt behandlas någon biokemiska bedömning.
Introduction
Kollagenas perfusion av levern för att erhålla hepatocyter har utförts sedan 1950 och har förbättrats kontinuerligt1,2,3,4. En mycket fin recension av många av de metoder, tekniker och reagenser som används i leverceller rening har sammanställts i Meyer et al5. Att få en tillfredsställande avkastning mycket livskraftig hepatocyter och SECs är tekniskt utmanande. De mekaniska krafter som separata celler inklusive kvaliteten på kollagenas är några av de variabler som är svåra att kontrollera. På grund av hepatocyte känslighet för mekaniska krafter reduceras deras livskraft markant under optimala förhållanden, föranledde behovet av ett protokoll som beskriver optimala förhållanden för isolering. SECs verkar inte vara lika känslig för mekanisk klippning. In situ perfusion med kollagenas matsmältningen är överlägset den bästa metoden att störa cell cell korsningar för att få enskild cell preparat från levern och andra organ till exempel tarmen och mjälte6. Detta protokoll visar en enkel metod för att införa perfusion buffert i portalen ven genom att använda en infällbar plast kateter i stället för ett snitt som kan orsaka portalen ven till kollaps, som beskrivs i Smedsrød et al7.
Målet med detta manuskript är att visa de mest kritiska steg som krävs för framgång i förfarandet för levern överflöd. Dessa steg omfattar katetern placering, flödet av perfusion vätskor, och hantering av vävnad efter matsmältningen. Flöden är justerad ovanför andelen naturliga blodflödet, men tillräckligt låg för att hålla den Glissons kapsel intakt. När levern är ordentligt rötas och celler separeras i lösning, är cell rening relativt enkelt om det utförs av differentiell centrifugering, plattan vidhäftning, eller magnetiska pärla rening. Levande hepatocyter har en högre densitet och renas enkelt från nonparenchymal celler (NPC) och döda hepatocyter med långsam centrifugering. För de flesta tillämpningar, plattan vidhäftning för att separera Kupffers celler (KCs) och SEK är en gemensam metod8, men det finns rapporter om att det inte producera SECs9bästa renhet. KCs har en tendens att hålla sig till fasta styva ytor snabbt och petriskålar (standard polystyren) är det vanligaste materialet för detta förfarande. SEC eller KC rening med hjälp av antikropp-konjugerad magnetiska pärlor är tveklöst den bästa metoden för betydande rening av dessa celler, men proceduren lägger till en annan 3-4 h på detta protokoll och den totala avkastningen är minskad9. Detta betänkande visar i detalj processen för en optimal leverns genomblödning som vanligtvis ger en hög antalet livskraftiga celler.
Protocol
Alla djur procedurer som beskrivs i detta protokoll har godkänts av den institutionella djur vård och användning kommittén (IACUC) på universitet av Lincoln - Nebraska enligt protokollet #1435.
1. beredning
- Beredning av lösningar och kultur media
- Förbereda alla kultur media och buffert enligt Tabell för material.
- Beredning av instrument
- Ställa in ett vattenbad (> 10 L) vid 42 ° C, en Peristaltisk pump med variabel hastighet och klämmor för att hålla kolvar. Förbereda böjd sax och pincett (figur 1).
- På eller i anslutning till vattenbadet, Ställ in en plåt (ca 38 x 26 cm) med en frigolit pad (50 mL koniska rack), belagd med en absorberande underpad skuren i en 20 x 20 cm bit (figur 1).
- Lägg en bit maskeringstejp (5-8 cm) i närheten. Plats en 20 cm polyester sytråd i närheten som är skurna och klar att användas. Få en plast kateter med en indragbar nål (7 mm x 19 mm, figur 1).
- Beredning av glasvaror
- Hjälp av klämmor, placera och immobilisera en 1 L mätkolv i vattenbadet som innehåller 200 mL 1 x PBS med en propp som har två 1 mL pipetter går i lösning. Gummi korken är spårat för att tillåta återcirkulation av vätskan i en sluten krets.
- Med en annan klämma, placera en 125 mL mätkolv som innehåller 45 mL buffert 2 tillsammans med en propp som har två 1 mL pipetter, varav en är i vätskan i nedre delen av kolven och den andra som förblir ovanför vätskan och blåser syre in kolven.
Obs: Varje pipett i proppar kommer att ha en snabb koppla från adaptern kopplade till slutet för lätt byte av slangen. Syre kommer vara försiktigt flyter in båda kolvarna via pipetten i proppen som inte är nedsänkt i vätskan. - Avsätt två sterila utkristalliseras rätter.
2. djurens förfarande
- Värm upp de PBS och buffert 2 lösningarna till 42 ° C i vattenbadet och cirkulera PBS för minst 20 mL/min hos slangen i en sluten krets att hålla de flytande linjerna varm. Doppa något överskott slangar i vattenbadet att förbli så nära som möjligt till 42 ° C. Dränera den manliga slutet av slangen till 1 L mätkolv som innehåller PBS.
- Placera en bomullstuss på det absorberande underpad och tillsätt ca 2 mL 30% isofluran (som består i polyetylenglykol 200 vilket minskar avdunstningen av isofluran) på bomullstuss med överföring pipett.
- Plocka upp musen i svansen, placera den i en av de crystallizing rätterna och sedan snabbt störta skålen på bomullstuss så att musen har ett litet utrymme att andas in anestesi. Iaktta andning graden av musen och se till att musen är effektivt under narkos.
Obs: Andning ska vara långsammare och djupare, svansen slapp och tassar inte svarar på nypa prov under narkos; Se IACUC riktlinjer för ytterligare detaljer. - Medan musen går under anestesi (detta tar 1-2 min), förbereda trumman av en 10 mL spruta genom att dra ut kolven och infoga en liten bomullstuss. Tillsätt 1 – 2 mL 30% isofluran med överföring pipett till bomullstuss inuti tunnan och placera fat fast ner på ett bord i väntan på musen för att bli medvetslös.
- Snabbt ta av crystallizing skålen, flip musen på ryggen och placera sprutcylindern över nosen. Dubbelkolla andning, tå nypa och slapp svans. Eventuella svar till tå nypa och slapp svans anger att musen inte fullt under narkos. Håll sprutcylindern över nosen att bibehålla medvetslöshet.
- Plats tummen nubb genom tassar av musen, med armar och ben utsträckta i ryggläge. Blöt i buk och bröstkorg med 70% isopropanol eller etanol.
- Med raka pincetten i ena handen, lyft upp huden nära basen av buken. Med sax i andra handen, skär tented hud och bukhinnan. Snittet ska vara horisontell eller över basen av tält huden. Var noga med att skära igenom alla lager av hud och bukhinna för att få tillgång till tarmen. Skär sido runt buken upp till bröstkorgen på båda sidor utan Hack någon av organ.
- Klipp av fliken av hud genom att skära över nedre revbenen. Flytta tarmarna till höger med baksidan av tången att exponera portalen ven.
Obs: Blödning från djuret bör vara minimal. djuret bör fortfarande andades och under djup anestesi. - Placera den stängda böjda pincetten under portalen ven mellan levern och överlägsen pancreaticoduodenal ven (figur 3 pil).
- Öppna tången medan under portalen ven. Förstå tråden och dra den försiktigt så att den är centrerad under portalen ven. Knyt en överhandsknop runt portalen ven utan cinching det ner.
- Placera böjda pincetten under portalen ven och försiktigt dra den mot stjärten på musen för att räta ut ven (figur 4A).
- Med katetern i andra handen, placera en avfasning av nålen uppåtvänt och parallellt med den nedre delen av portalen ven nära tången (figur 4B).
- Försiktigt punktera venen med nålen (figur 4C). Säkerställa en avfasning av nålen i lumen av venen. Dra den fjäderbelastade nålen och fortsätta att driva polymer katetern genom venen tills avfasningen är nära området venös Grenade. Detta är inom levern. Om katetern placeras korrekt, visas en tillbaka-flödet av blod. (Figur 4D).
- Dra åt överhandsknop och dra på katetern för att stabilisera den. Omedelbart skruva ner pumpen priset från 20 mL/min till 4 mL/min och skär en annan större blodkärl för dränering. Skär den aorta abdominalis för optimalt resultat.
- Placera den manliga slutet av slangen till honkontakten på katetern (figur 5A). Se till att det inte finns några luftbubblor i raden. Var noga med att katetern inte är antingen skjuts in i levern eller ur venen. Placering av tråden är inte nödvändigt, men det hjälper till att förhindra rygg-flöde ur venen och hjälper till att hålla katetern i rätt position (figur 5B, C).
- Använd maskeringstejp för att immobilisera slangen på underpad. Använd raka pincetten för att pressa det spillvatten blodkärlen för att blåsa levern några gånger att säkerställa alla blodet runnit ut (figur 5D).
Obs: Standard laboratorium tejp fungerar inte; maskeringstejp kommer dock fast att underpad, även under våta förhållanden.
3. levern Perfusion
- Medan levern är spolning med PBS, mäta ut ca 24 mg kollagenas typ IV och placera den i kolven innehållande 45 mL buffert 2 i vattenbadet. Glöm inte att snurra vätskan i kolven så att kollagenas är helt upplöst och Placera kolven tillbaka i klämman så att den flytande innehållande delen av kolven är helt nedsänkt i vattnet.
- Observera ändringen i färg av levern som det spolas med PBS. Ändra utflöde slangen från 1 L kolven till den 125 mL-kolven. Tillåt inte luftbubblor att flöda in i levern.
- När perfusion bufferten når levern, kort klämma tätt spillvatten blodkärl för att bygga upp lite tryck i kärlet och tillåta denna vätska att fylla alla loberna i levern. Glöm inte att skära av dränering för lång tid, som kan brista i tunn bindväv som omger levern (Glissons kapsel) och förstöra den perfusion eller flödet av vätska inom kapillär sängen av levern.
- Tillåta buffert 2 med kollagenas att BEGJUTA genom levern tills alla 45 mL har flödat genom vävnaden.
Obs: Om det lyckas, de Glissons kapsel bör separeras från parenkymet eller levern vävnad och levern bör själv visas amorft. - Tillsätt ca 10 mL buffert 1 till andra crystallizing skålen och placera den intill musen.
- Ta bort katetern och stänga av pumpen.
- Med raka pincett och sax, skär levern från musen. Om kollagenas matsmältningen var mycket effektiv, kan det vara nödvändigt att ha en ren och steril sked å att ösa levern från musen och placera den i buffert 1.
4. hepatocyte rening
Obs: Manipulation av celler utförs i en steril vävnadsodling huva att begränsa kontaminering om cellerna ska vara odlade i alla efterföljande steg.
- Med steril teknik, greppa levern med pincett och skaka försiktigt cellerna från levern. Riva sönder eller dra tillbaka den Glissons kapsel: bufferten blir ogenomskinlig celler skakas från levern.
- Häll av cell lösningen till en 50 mL konisk med 100 µm filter placeras över toppen.
- Lägga till mer buffert 1 lever resterna och fortsätter att skaka ur celler. Fortsätta tills levern visas saknar celler eller när de osmälta delarna av levern ger inte längre celler.
- Häll cellulära vätskan i en annan 50 mL koniska som innehåller ett 40 µm filter.
- Centrifugera det koniska i en svängande hink rotor vid 100 x g i 3 min.
Obs: Använd inte maximal bromsen eftersom detta kan rubba cellpelleten. Använda bromsen på 80% vilket är tillräckligt för alla återstående centrifugering stegen vid 4 ° C - Häll bort supernatanten (som innehåller NPC och döda hepatocyter) i en ren konisk och placera den på is. Säkerställa detta görs i en enda rörelse att iaktta pellet följsamhet.
- Återsuspendera pelleten i 40 mL buffert 1. Upprepa steg 4.5 och 4.6. Återsuspendera pelleten i 40 mL buffert 3. Upprepa steg 4.5 och 4.6 två gånger.
- Återsuspendera de renade hepatocyterna i varma DMEM + 10% FBS + 2 x Penicillin-Streptomycin (penna/Strep).
- Om cellerna odlas på kollagen belagda plåtar, tillåta dem att följa för 1 h och ersätt media minst en gång eftersom detta kommer att förhindra eventuella begynnande bakteriella föroreningar.
- Gör kollagen belagda plattorna genom inkubering med 0,05% kollagen i 0.001% ättiksyra för minst 1 h vid 37 ° C, och sedan tvätta med 1 x PBS.
- Om hepatocyte livskraft är låg och det finns en önskan att få renat hög livskraftiga hepatocyter sedan använda följande protokoll anpassad från Kreamer et al10.
- Mix 9 volymer av PVP lösning (Percoll, en 23% w/w lösning av vatten och 15-30 nm kolloidal kiseldioxid partiklar belagd i polyvinylpyrrolidon för densitet centrifugering) och 1 volym 10 x HBSS att göra en isoosmotisk PVP-lösning (SIP).
- Tillsätt 24 mL SIP till en steril 50 mL koniska som kan lagras i dessa villkor för upp till 2 månader vid 4 ° C.
- Justera hepatocyte koncentration till 5-10 × 106 celler/mL odlingsmedium som den antecknade i steg 4,8.
- Tillsätt 25 mL cellsuspension till varje 24 mL SIP innehållande konisk och blanda genom varsam inversion. Tätheten av denna lösning är 1,06 g/mL.
- Centrifugera det koniska vid 50 x g under 10 minuter vid 4 ° C.
- Aspirera den SIP- och flockningsmedel och resuspendera cellerna i HBSS.
- Tvätta cellerna genom centrifugering vid 50 x g under 10 minuter vid 4 ° C.
- Upprepa steg 4.10.6 en gång till och sedan Omsuspendera cellerna i odlingsmedium.
5. SEK rening
- Pellet cellerna i supernatanterna från steg 4,6 genom att snurra rören vid 163 x g i 10 min. Kassera supernatanterna från rören och resuspendera alla cell pellets i 5 mL RPMI utan serum och sammanföra dem i en tub.
- När alla pellets slagits samman, lägga till slutvolymen av 35 mL RPMI.
- Centrifugera de sammanslagna konisk på 25 x g för 3 min. Aspirera försiktigt den topp 25 mL RPMI med 25 mL pipett och plats detta media som innehåller NPCs i en ren 50 mL konisk på is.
- Tillsätt 25 mL färsk RPMI tillbaka till röret och återsuspendera pelleten.
- Upprepa steg 5.3 för en andra tvätt och pool supernatanten. Kassera de återstående 10 mL av media och pellet (pelleten består mest av döda hepatocyter). Centrifugera poolade supernatanten vid 163 x g i 10 min.
- Under centrifugeringen, förbereda de PVP lösning lutningarna i en 50 mL konisk.
- Tillsätt 15 mL 50% PVP lösningen till en 50 mL konisk följt av 20 mL 25% Percoll överdrog med vi rekommenderar att en inställd på långsammaste utmatning hastigheten. Var noga med att iaktta en refraktion linje vid 15 mL märket som avgränsas av två lager, eftersom det är där de SECs och KCs kommer aggregera efter centrifugeringen.
- Omsuspendera cellerna tidigare pelleterat i steg 5.5 av 10 mL kall RPMI och overlay dem på PVP lösning övertoningen. Var noga med att upprätthålla en tydlig avgränsning mellan de två lagrarna. Centrifugera övertoningen på 805 x g i 20 min med broms till 50%.
- Sug ut uppifrån och ned riktning till 20 mL-markeringen på röret och ignorera detta material. Samla in SECs och KCs som är belägna på 25/50% gränssnittet med pipett 5 mL överföring. Kassera alla bruna klumpar av celler som dessa är döda hepatocyter.
- Placera cellerna i en 50 mL konisk och lägga till RPMI upp till 50 mL märket att späda ut PVP lösningen. Centrifugera vid 200 x g i 10 min, med 80% broms.
- Aspirera och kasta bort supernatanten och återsuspendera pelleten medan tvätta bort konen av den koniska i 12 mL varm RPMI.
- Separera SECs från KCs genom att placera supernatanten i en polystyren petriskål och inkubera i en fuktad vävnadsodling inkubator i 8 min i rumstemperatur.
- Aspirera media med 25 mL pipett och skölj plattan med samma media, med den vi rekommenderar inställd på den lägsta hastigheten att samla in de återstående sekunder medan KCs följa plattan.
- Centrifugera i SEK vid 200 x g i 10 min och återsuspendera i RPMI + 5% FBS + penna/Strep. Sedan titer cellerna, och plats i kollagen-belagd kultur rätter.
Representative Results
En demonstrational, raffinerad metod för levern perfusion och rening/anrikning av hepatocyter och SECs presenteras här som ger detaljerade tips för optimal cell rening/anrikning liknar andra tryckta rapporter som sammanställts i denna hänvisas till granska 5. De kritiska steg som avgör framgång för cellulära rening förekommer i rutten och tekniska detaljer av förfarandet kollagenas perfusion och beskrivs i detta protokoll. Set-up för apparatur är ganska enkel och kostnadseffektivt med vanlig laboratorieutrustning, i motsats till andra system som har varit publicerade11 (figur 1). I denna uppsättning sitter facket håller musen på vattenbadet med några av överskjutande slangen i vattenbad att hålla temperaturen av vätskor startas inom levern. Apparaten som visas här kan användas för såväl möss som råttor, med en något annorlunda geometri för råtta lever perfusion12 (figur 2).
I den här proceduren är levern perfusion via portalen ven istället för vena cava (vilket är en annan populär perfusion väg) på grund av dess lättillgänglighet i buken och att venen feeds direkt i levern. Betraktaren bör vara medveten om att portalen ven har flera små grenar som kan kortsluta perfusatet och katetern bör placeras förbi dessa grenar för optimal framgång13 (figur 3). När portalen ven identifieras, används böjd pincett för att rita en kirurgiska suturer eller polyester tråd under portalen ven mellan levern och överlägsen bukspottskörteln-duodenal venen. Tången används också för att räta ut portalen ven som är under positiva blodtryck (figur 4A). Nålen inom katetern bör placeras parallellt och bredvid ven (figur 4B) och avfasningen bör införas försiktigt i lumen av ven (figur 4C). Lämplig placering indikeras med blod förekommer längs katetern. När nålen är tillbakadragen katetern bör stabiliseras med en tråd bunden vid det och blodtrycket kommer att tvinga blodet upp genom katetern. Det rekommenderas att katetern kopplas till pumpen slangen innan blod spiller ut (figur 4D). När pumpen slangen är ansluten, omedelbart skär ett större blodkärl såsom vena cava eller aorta abdominalis för blod/vätska dränering (figur 5A). Är det oftast nödvändigt att skära på sidan av den buk-väggen musklick för tillräcklig dränering, eftersom en ansamling av blod i buken gör det svårt att visualisera perfusion processen, och blodet kan föra över till cell rening (figur 5 B). När PBS börjar att BEGJUTA levern levern kommer att blekna med avsaknad av blod (bild 5C). Om endast några av loberna blanch, sedan är den sannolika orsaken att katetern har placerats alltför långt i levern och behöver backas långsamt. Placering av katetern bekräftas, använda vattenfast maskeringstejp för att skydda slangen på plats. Allmän laboratorium band är oftast inte tillräckligt. För att bekräfta korrekt placering av katetern, krama den avskurna blodkärlen att upphöra dränering och observera ökar trycket inuti levern. Detta kommer att hjälpa spola blod ur levern (figur 5D). Detta bör också göras när kollagenas lösningen initialt går in i levern för att säkerställa att alla lober utsätts för kollagenas. Efter kollagenas körs lösning ut, en bra kollagenas matsmältning är vägledande genom separation av de Glissons kapsel från parenkymet.
Det allmänna förfarandet för cellulära rening beskrivs i figur 6 och figur 7 där skördas hepatocyter tidigt i förfarandet under den låga hastigheten snurrar och är mycket ren efter 4 tvättar i BSA-innehållande buffertar (figur 8 ). SEK är samtidig renas med KCs på en PVP lutning (figur 9A) och sedan separeras av selektiv vidhäftning på en kollagen-belagd polystyren petriskål. Renhet i sekunder med hjälp av denna metod är 83-90% ren och till stor del beror på den totala effektiviteten i kollagenas matsmältningen (figur 9B). Kvantitativa mätningar med Ljus microscopy (som både hepatocyter och SECs har utmärkande dragen från andra celler) visar att en representativ förberedelse, hepatocyter är nästan 100% ren och SECs är drygt 89% ren (tabell 1). Alternativt erhållas en högre anrikning av SECs genom magnetiska kolumn separation efter PVP övertoningen, även om det är utanför ramen för detta protokoll. Mer information om magnetisk separering av SECs och KCs kan hittas i Meyer et al. 9 och Liu et al. 14 man bör komma ihåg att livskraften i hepatocyter minskar snabbt i en otillräckligt smält lever, men detta är inte nödvändigt sant för NPCs. otillräckligt smält lever också producera mer cellulära skräp, som inte är helt elimineras i centrifugering steg.
Figur 1 : Schematisk representation av perfusion suite. Kolvar hålls på plats av klämmor (visas inte); slangen som innehåller vätska swappas från 1L kolven till 125 mL kolven under förfarandet representeras av den röda prickade linjen. Observera, att syret foder inte bubbla direkt till lösningarna i behållarna. Korkar bör också vara spårat för att en intern vätskeflöde med slangen in i skåran. Detta är avgörande under uppvärmning av slangen och för utmatning av all luft i slangen. Air utfallet består av T-kontakten som ansluts till Tygon slangar och nypa klämmor för snabb öppen och stängning av systemet. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2 : Perfusion sviten under mus lever perfusion. Facket med musen placeras i hörnet av vattenbadet. Syre är frånkopplad från kollagenas lösningen som som var redan syresatt under uppvärmningen. Objekten i är A) syre linjer, B) 1 L mätkolv som innehåller PBS, C) 125 mL mätkolv som innehåller buffert 2 med kollagenas, D) pump, E) pump kontroller, F) bubbelfälla G) flytande linje från kolven, genom pumpen och till musen. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3 : Bilden av vaskulatur av mus buken. Införande av katetern bör vara strax under magsäcken och bukspottskörteln ven korsningar kommer bort portalen ven (grön punkt) och spetsen bör placeras nära vänster och höger nedsatt portal venerna (gula pricken) som bildar en gaffel i de huvudsakliga loberna i levern. När korrekt placering uppnås, bör katetern stabiliseras med tråd med hjälp av en enkel överhandsknop. K = njure, L = levern, SI = tunntarmen. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4 : Katetern placering i portalen ven. (A) tången används för att säkerställa att blod mjölkstockning av portalen ven och räta ut ven för katetern placering. (B) katetern är uppradade parallellt med portalen ven med den fasade kanten. (C), fasning av nålen inom katetern sätts in i venen, inte genom venen. (D), nålen av katetern är tillbakadragen och blod kommer återflödet genom katetern som indikeras av spetsen på tången. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5 : Korrekt levern perfusion. (A) efter kateterns placering, Luer honkontakten på katetern ansluter till manlig Luer ände (klippt från en 1 mL spruta) pump slangen. (B) när styckning en av stora fallande blodkärl, blod och PBS är tömd från buken genom skärning på sidan av musen med en sax. (C) levern bör blanchera medan blodet töms och (D) kommer att svälla under press av klämma stänga den avskurna blodkärlen med pincett. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 6 : Schematisk disposition av hepatocyte rening och NPC isolering. De flesta av centrifugering stegen syftar till att ta bort levande och döda hepatocyter från icke-parenkymal celler. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 7 : Schematisk disposition av SEC anrikning och rening. NPC skiljs åt av PVP övertoningen följt av SEC separation av kort vidhäftning till en vanlig polystyren plattan. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 8 : Renat hepatocyter. Hepatocyter var klädd på kollagen belagda vävnadsodling tallrikar med DMEM + 8% FBS + penna/Strep och inkuberas i 6 h följt av bildsamling av Mikroskop vid 400 X. Bar motsvarar 20 µm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Figur 9 : SEC rening. (A) SEK och KCs samlades från 25/50% PVP gränssnittet (gula pilar) och tvättas med serumfritt medium. (B) The SECs var separerade från KCs genom selektiv vidhäftning på standard petriskålar, tvättas och pläterade på kollagen-belagd vävnadsodling rätter i RPMI + 5% FBS. Bilder togs av ett EVOS inverterade Mikroskop vid 400 X. Bar motsvarar 20 µm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Figur 10 : Svepelektronmikroskopi mus lever anatomi. En mus lever var perfusion med PBS följt av fixativ (100 mM natrium cacodylate, 12 mL 25% glutaraldehyd, 15,6 mL 16% paraformaldehyd, 2.65 mM kalciumklorid, 180.2 mM sackaros, blandas i 100 mL lösning) med en hastighet av 1 mL/min för 4 min. vävnader var skivad och förberedd för svepelektronmikroskopi. Bilder samlades på en fältet utsläpp SEM på 10 000 X. Gula pilar indikerar Mikrovilli mellan hepatocyterna. Baren är lika med 5 µm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Figur 11 : Visualisering av döda kontra live hepatocyter. Efter 2 tvättar med buffert 1, får pelleterat hepatocyter bedömas för live/dead ratio av ögat. En lättare pellet (vänster) anger att minst hälften av hepatocyter är döda. Den mörka pelleten till höger är mer bestämt pelleterat till botten av röret och är mer än 90% lever. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Tabell 1: Cell rening | ||
| Celltyp | % målceller | % andra celler |
| Hepatocyter | 99 | 1 |
| Sinsusoidal endothelial celler | 89,1 | 10,9 |
Tabell 1: Bedömning av cell renhet av ljusmikroskop.
Discussion
Detta protokoll belyser de verktyg som finns och som kommer att ge användaren en hög grad av framgång i detta förfarande. En framgångsrik perfusion är grundläggande för alla efterföljande program när du arbetar med primära celler.
Det finns några kritiska steg i förfarandet som avgör framgång. Först, placering av kateterspetsen inom portalen ven måste vara korrekt. Om placerade för långt inuti levern, kommer endast mindre loberna vara perfusion. Spetsen bör vara strax under höger och vänster grenarna i portalen ven. Fördelen med att använda en polymer-komposit kateter över en nål är att barb nålspetsen är mer sannolikt att riva venen under perfusionen än en kateter. För det andra, kollagenas kvalitet och kvantitet bestämmer matsmältningen effektiviteten i levern. I den här proceduren pre-kvalificerad kollagenas typ 4 användes och det är resuspended 0,5 mg/ml i buffert 2 om aktiviteten kollagenas att analyseras är större än 900 IE.
I slutet av kollagenas perfusionen, bör levern behålla en något mörk solbränna till brun färg. Om det är en ljus brun färg, då är de flesta av hepatocyterna döda. Levern bör vara faller isär när man skär från musen. Under de bästa förhållandena, kan levern vara öste ur kroppen hålighet i musen med en liten sked. Lever i detta tillstånd ger alltid mycket hög cellernas viabilitet. Om det tar mycket ansträngning att skaka cellerna isär, om levern är fortfarande fast under extraktion, eller om det finns en hel del kraft som krävs för att flytta hepatocyterna genom filtren, kommer att sedan hepatocyterna ha en lägre lönsamhet. Hepatocyter är täckta med Mikrovilli, som tillåter dem att ha en mycket hög yta (figur 10). Ofullständig matsmältning behåller cell cell korsningar mellan hepatocyter och mekanisk klippning kommer slita plasmamembranet isär. In situ perfusion med kollagenas är den bästa metoden att sönder cellerna och upprätthålla hög lönsamhet. I figur 11jämfördes två hepatocyte preparat görs i som cellen pellets efter några tvättar i buffert 1. Pelleten till vänster är lättare och innehåller en cellviabilitet på ca 50%. Pelleten till höger är mörkare och har en bärkraft på 92%. Likaså när vätskan hälls från 50 mL koniska, är mörkare pelleten stationära inom röret, i motsats till den lätta pelleten, som kommer att glida i röret som vätskan hälls bort. Lägre cellviabilitet eller ineffektiva perfusioner kan uppstå när levern har höga nivåer av skleros.
Eftersom levande hepatocyter har en högre densitet än döda hepatocyter, kommer att centrifugering förfarandena resultera i ett preparat som är mycket ren i livskraftiga hepatocyter15. Om det finns en betydande mängd döda hepatocyter (vilket ofta sker när förhållandena är suboptimal), levande kan celler vara ytterligare berikad och separerade från döda celler använder PVP övertoningar. Dessutom, eftersom levande hepatocyter pellet snabbare än döda hepatocyter, ökar aspiration av top 3rd av pelleten också förhållandet av levande döda celler i pelleten. Dessa förfaranden är snabba och enkla metoder för att separera live från döda hepatocyter och cell skräp när det behövs10,16. Detta är särskilt användbart om provet är dyrbar, och endast några miljoner celler krävs för experimentet.
Sammanfattningsvis är detta en enkel och effektiv metod för skörd hepatocyter och SECs från levern. I löpande priser är kostnaden för att utföra proceduren inklusive alla reagenser och engångsartiklar under 75 USD per förberedelse. Om flera möss önskas, är det bäst att gå vidare med hepatocyte rening och hålla det NPC bråket på is tills alla möss har bearbetats. NPC är generellt stabil på is för minst 5 h, men längre tider inte har testats i detta laboratorium.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Finansieras delvis av NIH från grant R01HL130864.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 L Erlenmeyer flask | Fisher Scientific | S63274 | |
| 250 mL Erlenmeyer flask | Fisher Scientific | S63271 | |
| silicone tubing | Cole-Parmer | 96400-14 | This tubing runs from the flasks through the pump to the T connector and then to the 1.0 mL syringe that is connected to the catheter. |
| Tygon tubing | Fisher Scientific | R3603 | Used as an adaptor between 96400-14 and pipettes and T connector. This may also be used for the oxygen tubing. |
| T-connectors | Cole-Parmer | EW-06294-82 | |
| Quick dissconnects | Fisher Scientific | 6150-0010 | |
| Pinch Clamps | Fisher Scientific | 6165-0002 | |
| Masterflex L/S Variable speed Pump, model 7553-70 | Cole-Parmer | EW-07559-00 | Periplastic pump with variable speed |
| Pump head, model 7014-20 | Cole-Parmer | EW-07014-20 | |
| glass graduated 1.0 mL pipettes | Fisher Scientific | 13-678 | |
| curved non-serrated scissors | Fine Science Tools | 14069-12 | |
| Dumont forceps | Fine Science Tools | 11252-20 | |
| Curved forceps | Fine Science Tools | 13009-12 | |
| 10 mL syringe | Fisher Scientific | 03-377-23 | Only barrel of syringe will be needed |
| sterlized spoon | Home supply store | ||
| Cotton ball(s) | Home supply store | ||
| Polyester sewing thread | Home supply store | ||
| Masking tape | Home supply store | ||
| thumb tacks | Home supply store | ||
| styrofoam pad | 50 mL conical rack | ||
| cookie/baking sheet | Home supply store | ||
| Absorbant underpads | Fisher Scientific | 14-206-64 | |
| 19 L water bath | Fisher Scientific | TSCOL19 | |
| BD Insyte Autogaurd Shielded IV Catheter 24 guage | Becton Dickinson | 381412 | Plastic cathetar with retractable needle |
| Crystallizing dishes 100x50 | VWR | 89000-290 | |
| Polystyrene petri dishes | Sigma Aldrich | P5481-500EA | |
| 50 mL conical tubes | Fisher Scientific | 12-565-270 | |
| graduated pipettes (5 mL) | Fisher Scientific | 170355 | |
| graduated pipettes (25 mL) | Fisher Scientific | 170357 | |
| EasyStrainer 100 μM | Greiner bio-one | 542000 | 100 μm filter |
| EasyStrainer 40 μM | Greiner bio-one | 542040 | 40μm filter |
| Sterile transfer pipettes | Fisher Scientific | 13-711-20 | |
| Refrigerated swinging bucket centrifuge | Sorvall Legend XTR | 75-217-406 | Centrifuge with swinging bucket rotar |
| Galaxy 170R tissue culture incubator | Eppendorf | CO170R-120-0000 | Humidified tissue culture incubator |
| Reagents | |||
| Name | Compound | Grams (g/L) | Millimolar (mM) |
| Buffer 1, pH 7.4 | NaCl | 8.3 | 142 |
| KCl | 0.5 | 6.7 | |
| HEPES | 2.4 | 10 | |
| BSA | 15 | 0.226 | |
| Buffer 2, pH 7.4 | NaCl | 3.9 | 66.74 |
| KCl | 0.5 | 6.71 | |
| CaCl2 | 0.7 | 6.31 | |
| HEPES | 24 | 100 | |
| BSA | 15 | 0.226 | |
| Phenol Red | 0.01 | 0.03 | |
| Buffer 3, pH 7.4 | NaCl | 8 | 137 |
| KCl | 0.35 | 4.7 | |
| MgSO4 | 0.08 | 0.66 | |
| CaCl2 | 0.18 | 1.62 | |
| HEPES | 2.4 | 10 | |
| BSA | 15 | 0.226 | |
| PBS, pH 7.4 | NaCl | 8 | 137 |
| KCl | 0.2 | 2.7 | |
| Na2HPO4-7H2O | 1.15 | 4.3 | |
| KH2PO4 | 0.2 | 1.4 | |
| Other reagents | |||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Percoll (PVP solution) | GE Healthcare | 288555 | |
| Collagenase Type IV | Sigma Aldrich | C5138 | |
| Isoflurane | Abcam | ab144581 | |
| Hepatocyte Growth Medium | |||
| DMEM | Gibco | 11965118 | |
| 10% by volume fetal bovine serum | Gibco | 10437010 | |
| Pen/Strep (2x) | Gibco | 15140148 | |
| Long-term Hepatocyte Growth Medium | |||
| DMEM | |||
| 10% by volume fetal bovine serum | Gibco | 10437010 | |
| Pen/Strep (2x) | Gibco | 15140148 | |
| Glucagon | Sigma | G3157-2mg | 14 ng/mL |
| Insulin | Sigma | I9278-5mL | 0.5 U/mL |
| Hydrocortisone | Sigma | H0888-1g | 7.5 mg/mL |
| Epidermal Growth Factor | BD Biosciences | 354001-100ug | 20 ng/mL |
| LSEC medium | |||
| RPMI | Gibco | 11875119 | |
| 10% by volume fetal bovine serum | Gibco | 10437010 | |
| Pen/Strep (2x) | Gibco | 15140148 |
References
- Berry, M. N., Friend, D. S. High-yield preparation of isolated rat liver parenchymal cells: a biochemical and fine structural study. J Cell Biol. 43 (3), 506-520 (1969).
- Seglen, P. O. Preparation of isolated rat liver cells. Methods Cell Biol. 13, 29-83 (1976).
- Miller, L. L., Bly, C. G., Watson, M. L., Bale, W. F. The dominant role of the liver in plasma protein synthesis; a direct study of the isolated perfused rat liver with the aid of lysine-epsilon-C14. J Exp Med. 94 (5), 431-453 (1951).
- Edstrom, S., Ekman, L., Ternell, M., Lundholm, K. Isolation of mouse liver cells: perfusion technique and metabolic evaluation. Eur Surg Res. 15 (2), 97-102 (1983).
- Meyer, J., Gonelle-Gispert, C., Morel, P., Buhler, L. Methods for Isolation and Purification of Murine Liver Sinusoidal Endothelial Cells: A Systematic Review. PLoS One. 11 (3), 0151945 (2016).
- Sies, H. The use of perfusion of liver and other organs for the study of microsomal electron-transport and cytochrome P-450 systems. Methods Enzymol. 52, 48-59 (1978).
- Smedsrod, B. Protocol for preparation of mouse liver Kupffer cells and liver sinusoidal endothelial cells. Munin open research archive. , University of Tromsø. 1-10 (2012).
- Smedsrod, B., Pertoft, H., Eggertsen, G., Sundstrom, C. Functional and morphological characterization of cultures of Kupffer cells and liver endothelial cells prepared by means of density separation in Percoll, and selective substrate adherence. Cell Tissue Res. 241 (3), 639-649 (1985).
- Meyer, J., Lacotte, S., Morel, P., Gonelle-Gispert, C., Buhler, L. An optimized method for mouse liver sinusoidal endothelial cell isolation. Exp Cell Res. 349 (2), 291-301 (2016).
- Kreamer, B. L., et al. Use of a low-speed, iso-density percoll centrifugation method to increase the viability of isolated rat hepatocyte preparations. In Vitro Cell Dev Biol. 22 (4), 201-211 (1986).
- Meijer, D. K., Keulemans, K., Mulder, G. J. Isolated perfused rat liver technique. Methods Enzymol. 77, 81-94 (1981).
- Gopalakrishnan, S., Harris, E. N. In vivo liver endocytosis followed by purification of liver cells by liver perfusion. J Vis Exp. (57), e3138 (2011).
- Cook, M. J. The Anatomy of the Laboratory Mouse. , Academic Press. 2008 edn (1965).
- Liu, J., et al. Advanced Method for Isolation of Mouse Hepatocytes Liver Sinusoidal Endothelial Cells, and Kupffer Cells. Methods Mol Biol. 1540, 249-258 (2017).
- Knobeloch, D. E., Ehnert, S., Schyschka, L., Buchler, P., Schoenberg, M., Kleeff, J., Thasler, W. E., Nussler, N. C., Godoy, P., Hengstler, J., Nussler, A. K. Human Hepatocytes: Isolation, Culture, and Quality Procedures. Methods in Molecular Biology. 806, 99-120 (2012).
- Clarke, B. L., Weigel, P. H. Recycling of the asialoglycoprotein receptor in isolated rat hepatocytes. ATP depletion blocks receptor recycling but not a single round of endocytosis. J Biol Chem. 260 (1), 128-133 (1985).
