Summary
El objetivo de este protocolo es obtener alta viabilidad y alto rendimiento de hepatocitos y células endoteliales sinusoidales del hígado. Esto se logra por perfundiendo el hígado con una solución de colagenasa tipo IV a través de la vena porta, seguida de centrifugación diferencial para obtener hepatocitos y células endoteliales sinusoidales.
Abstract
Este protocolo muestra un método para la obtención de altos rendimientos y viabilidad para ratón hepatocitos y células endoteliales sinusoidales (seg) aptos para cultivo o para la obtención de lysates de la célula. En el presente Protocolo, la vena porta se utiliza como el sitio de cateterización, en lugar de la vena cava, como esto limita la contaminación de otros tipos de células posibles en la preparación final del hígado. Ninguna instrumentación especial se requiere durante todo el procedimiento. Un baño de agua se utiliza como una fuente de calor para mantener la temperatura de las soluciones y buffers. Una bomba peristáltica estándar se utiliza para conducir el fluido, y una centrífuga refrigerada de mesa se requiere para los procedimientos de centrifugación. La única limitación de esta técnica es la colocación del catéter en la vena porta, que es un reto en algunos de los ratones en el rango de tamaño de 18-25 g. Una ventaja de esta técnica es que sólo una vena es utilizada para la perfusión y el acceso a la vena es rápido, que reduce la isquemia y la reperfusión del hígado que reduce la viabilidad de las células hepáticas. Otra ventaja de este protocolo es que es fácil distinguir vivo hepatocitos muertos por vista debido a la diferencia en la densidad celular durante los pasos de centrifugación. Las células de este protocolo pueden ser utilizadas en cultivo celular para cualquier uso aguas abajo así como procesadas cualquier evaluación bioquímica.
Introduction
Colagenasa perfusión del hígado para obtener hepatocitos se ha realizado desde principios de los años 1950 y se ha mejorado continuamente a1,2,3,4. Una muy buena revisión de muchas de las metodologías, técnicas y reactivos utilizados en la purificación de la célula del hígado ha sido compilada en Meyer et al5. Obtener un rendimiento satisfactorio de hepatocitos altamente viables y segundos es un desafío técnico. Las fuerzas mecánicas que separan las células incluyendo la calidad de la colagenasa son algunas de las variables que son difíciles de controlar. Debido a la sensibilidad del hepatocito a fuerzas mecánicas, su viabilidad se reduce marcadamente en condiciones óptimas, lo que provocó la necesidad de un protocolo que describe las condiciones óptimas para el aislamiento. Segundos no parecen ser tan sensibles al cizallamiento mecánico. Perfusión in situ con la digestión de la colagenasa es por mucho el mejor método para interrumpir las ensambladuras de la célula para obtener preparaciones de células individuales de hígado y otros órganos tales como intestino y bazo6. Este protocolo muestra un método simple para la introducción de búfer de perfusión en la vena portal mediante el uso de un catéter plástico retráctil en vez de una incisión que podría causar la vena porta a colapsar, como se describe en Smedsrød et al7.
El objetivo de este manuscrito es demostrar los pasos más críticos para el éxito en el procedimiento de la profusión de hígado. Estos pasos incluyen la colocación del catéter, flujo de líquidos de perfusión y manejo de los tejidos después de la digestión. Las tasas de flujo son ajustadas por encima de la tasa de flujo de sangre natural, pero suficientemente baja como para mantener intacta la cápsula de Glisson. Una vez que el hígado se digiere correctamente y las células se separan en solución, purificación celular es relativamente sencillo si se realiza por centrifugación diferencial, adherencia de la placa, o por purificación grano magnético. Energizados hepatocitos tienen una mayor densidad y son fácilmente purificadas a partir de las células de nonparenchymal (NPCs) y hepatocitos muertos con centrifugación de baja velocidad. Para la mayoría de las aplicaciones, adherencia de la placa para la separación de Kupffer células (KCs) y segundos es un método común8, aunque hay informes que no produce la mejor pureza de segundos9. KCs tienen tendencia a adherirse a las superficies sólidas rígidas rápidamente y platos de Petri (poliestireno estándar) son el material más utilizado para este procedimiento. Purificación de SEC o KC con el uso de bolas magnéticas conjugado de anticuerpo es sin duda el mejor método para la purificación considerable de estas células, aunque el procedimiento agrega otro 3-4 h en este protocolo y el rendimiento general es disminuido9. Este informe muestra en detalle el proceso para una óptima perfusión hepática que normalmente produce un alto número de células viables.
Protocol
Animales todos los procedimientos descritos en este protocolo han sido aprobados por el institucional cuidado Animal y el Comité uso (IACUC) en la Universidad de Lincoln - Nebraska bajo protocolo #1435.
1. preparación
- Preparación de soluciones y medios de cultivo
- Preparar todos los medios de cultivo y buffer de acuerdo con la Tabla de materiales.
- Preparación de instrumentos
- Configurar un baño de agua (> 10 L) a 42 ° C, una bomba peristáltica con velocidad variable y las abrazaderas para sostener matraces. Preparar la curva tijeras y pinzas (figura 1).
- En o adyacente al baño de agua, instale una placa para horno (de 38 x 26 cm) con una almohadilla de espuma de poliestireno (rack cónico de 50 mL), con un Empapador absorbente cortar una pieza de 20 x 20 cm (figura 1).
- Coloque un pedazo de cinta adhesiva (5-8 cm) cerca. Colocar un hilo de coser de poliéster de 20 cm es cortado y listo para usar. Obtener un catéter plástico con una aguja retráctil (7 mm x 19 mm, figura 1).
- Preparación de la cristalería
- Con pinzas, colocar e inmovilizar un matraz de 1 L en el baño de agua con 200 mL de 1 x PBS con un tapón que tiene dos pipetas de 1 mL en la solución. El tapón de goma es dentado para permitir la recirculación del líquido en circuito cerrado.
- Con la otra abrazadera, coloque un frasco de 125 mL que contiene 45 mL de tampón 2 junto con un tapón que tiene dos pipetas de 1 mL, una de ellas es en el líquido cerca de la parte inferior de la cubeta y la otra que queda sobre el líquido y oxígeno se funde en el matraz.
Nota: Cada pipeta en los topes tendrán una rápida desconecte el adaptador conectado al extremo para cambio fácil de la tubería. Oxígeno será fluir suavemente en ambos matraces a través de la pipeta en el tope que no se encuentra inmerso en el líquido. - Dejar de lado dos placas estériles de cristalización.
2. animal procedimiento
- Calentar las soluciones de PBS y tampón de 2 a 42 ° C en el baño de agua y circular PBS para por lo menos 20 mL/min en la tubería en circuito cerrado para mantener las líneas de líquido caliente. Sumergir cualquier exceso de tubo en el baño de agua permanezca lo más cerca posible a 42 ° C. El extremo macho del tubo en PBS que contenga 1 L frasco de drenaje.
- Coloque una bola de algodón en el Empapador absorbente y añadir unos 2 mL de 30% de isoflurano (compuesto de polietilenglicol 200 que disminuye la tasa de evaporación de isoflurano) en la bola de algodón con una pipeta de transferencia.
- Recoger el ratón por la cola, colocar en uno de los platos la cristalización y luego rápidamente volcar el plato sobre la bola de algodón para que el ratón tiene un pequeño espacio en el que se inhala la anestesia. Observar el ritmo respiratorio del ratón y asegúrese que el ratón está efectivamente bajo anestesia.
Nota: El ritmo respiratorio debe ser más lento y más profundo, la cola flácida y las patas no responden a la prueba del pellizco bajo anestesia; Consulte las pautas IACUC para detalles adicionales. - Mientras que el ratón va con anestesia (esto tarda 1-2 min), preparar el barril de la jeringa de 10 mL saque el émbolo e insertando una bola de algodón. Añadir 1-2 mL de 30% isoflurano con una pipeta a la bola de algodón dentro del barril y coloque el cañón boca abajo sobre una mesa mientras espera para que el ratón quede inconsciente.
- Rápidamente quitar el plato de la cristalización, voltear el ratón en su parte posterior y coloque el cuerpo de la jeringuilla sobre su nariz. Comprobar el ritmo respiratorio, pellizco del dedo del pie y cola fláccida. Las respuestas a la pizca del dedo del pie y la cola flácida indica que el ratón no está completamente bajo anestesia. Mantener el cuerpo de la jeringuilla sobre el hocico para mantener la inconsciencia.
- Chinchetas de lugar a través de las patas del ratón, con las extremidades extendidas en posición supina. Moje el abdomen y caja torácica con 70% isopropanol o etanol.
- Con el fórceps recto en una mano, levantar la piel cerca de la base del abdomen. Con las tijeras en la otra mano, corte el entoldado de la piel y el peritoneo. La incisión debe ser horizontal o en toda la base de la piel tiendas de campaña. Asegúrese de cortar a través de todas las capas de la piel y el peritoneo para acceder a la tripa. Cortar lateralmente alrededor del abdomen hasta las costillas en ambos lados sin mellar a cualquiera de los órganos.
- Cortar el colgajo de piel por corte a través de la caja torácica inferior. Mover los intestinos hacia la derecha con la parte posterior de las pinzas para exponer la vena porta.
Nota: La sangría del animal debe ser mínima; el animal todavía debe respirar y bajo anestesia profunda. - Coloque las pinzas curvas cerradas debajo de la vena porta entre el hígado y vena pancreaticoduodenal superior (flecha de lafigura 3 ).
- Abrir la pinza por debajo de la vena porta. Sujete el hilo y tire cuidadosamente a través de modo que quede centrado debajo de la vena porta. Ate un nudo alrededor de la vena porta sin con cincha lo abajo.
- Coloque las pinzas curvas debajo de la vena porta y tire suavemente hacia la cola del ratón para enderezar la vena (figura 4A).
- Con el catéter en la otra mano, colocar el bisel de la aguja hacia arriba y paralela a la parte inferior de la vena porta junto a las pinzas (figura 4B).
- Pinchar ligeramente la vena con la aguja (figura 4C). Asegúrese de que el bisel de la aguja está en el lumen de la vena. Retraer la aguja accionada por resorte y seguir empujando el catéter del polímero a través de la vena hasta que el bisel es cerca de la zona de ramas venosa. Esto es dentro del hígado. Si el catéter está colocado correctamente, será visible un reflujo de sangre. (Figura 4D).
- Apriete el nudo y tire hacia abajo del catéter para ayudar a estabilizarlo. Inmediatamente bajar la velocidad de la bomba de 20 mL/min a 4 mL/min y corte otro vaso sanguíneo principales de drenaje. Cortar la aorta abdominalis para obtener resultados óptimos.
- Coloque el extremo macho del tubo hasta el final femenino del catéter (figura 5A). Asegúrese de que no hay ninguna burbuja de aire en la línea. Tenga cuidado de que el catéter no está tampoco empujó en el hígado o fuera de la vena. Colocación de la rosca no es esencial, pero ayuda a prevenir el reflujo de la vena y ayuda a mantener el catéter en la posición correcta (figura 5B, C).
- Utilice cinta adhesiva para inmovilizar la tubería en el Empapador. Utilizar el fórceps recto para apretar el vaso sanguíneo efluentes para hinchar el hígado un par de veces para asegurar que toda la sangre se drena(figura 5).
Nota: Cinta de laboratorio estándar no funcionen; sin embargo, cinta de enmascarar permanecerá pegada al Empapador, incluso en condiciones húmedas.
3. hígada perfusión
- Mientras que el hígado es lavado con PBS, mida alrededor de 24 mg de colagenasa tipo IV y coloque en el matraz que contiene 45 mL de tampón 2 en el baño de agua. Asegúrese de agitar el líquido en el matraz para que la colagenasa se haya disuelto completamente y volver a colocar el frasco en la abrazadera para que la porción que contiene líquida del matraz esté completamente sumergida en el agua.
- Observe el cambio de color del hígado mientras que se lava con PBS. Cambiar el tubo de salida del frasco de 1 L en el matraz de 125 mL. No permita que las burbujas de aire en el hígado.
- Una vez que el buffer de perfusión alcanza el hígado, brevemente apriete firmemente el vaso sanguíneo efluentes para acumular presión en el recipiente y permita que este líquido llenar todos los lóbulos del hígado. Asegúrese de no cortar el drenaje demasiado, ya puede reventar el fina del tejido conectivo que rodea el hígado (cápsula de Glisson) y destruir la perfusión o el flujo del líquido dentro del lecho capilar del hígado.
- Permite 2 Buffer con colagenasa para perfusión a través del hígado, hasta 45 mL todos han fluido a través del tejido.
Nota: Si tiene éxito, la cápsula de Glisson debe ser separada de la parenquimia o el tejido del hígado y el hígado se debe aparecer amorfo. - Añadir aproximadamente 10 mL de tampón 1 a otro plato la cristalización y colóquelo junto al ratón.
- Retirar el catéter y apagar la bomba.
- Con la recta pinzas y tijeras, cortar el hígado de ratón. Si la digestión de colagenasa era muy eficiente, puede ser necesario contar con una cuchara limpia y estéril en la mano para sacar el hígado de ratón y colocar en el búfer de 1.
4. hepatocitos purificación
Nota: Manipulación de las células se realiza en una campana de cultivo estériles para tejidos para limitar la contaminación si las células son cultivadas en todas las etapas posteriores.
- Utilizando una técnica estéril, agarrar el hígado con pinzas y agítelo suavemente las células del hígado. Destrozar o tire hacia atrás la cápsula de Glisson: el buffer se volverá opaco como se agitan las células del hígado.
- Retirar la solución de la célula en un cónico de 50 mL con 100 μm filtro colocado sobre la parte superior.
- Añadir más 1 Buffer a los restos de hígado y continúan sacudiendo las células. Continúe hasta que el hígado aparece desprovisto de células o cuando las porciones no digeridas del hígado no producen más células.
- Vierta el líquido celular en otro 50 mL cónico que contiene un filtro μm 40.
- De centrífuga cónico en un rotor de cubo que hace pivotar a 100 x g durante 3 minutos.
Nota: No use el freno máximo como esto puede desalojar el precipitado de células. Utilice el freno en el 80% que es suficiente para todos los restantes pasos de centrifugación a 4 ° C - Retirar el sobrenadante (que contiene NPCs y hepatocitos muertos) en un limpio cónico y coloque en hielo. Asegúrese de que esto se hace en un solo movimiento para observar cumplimiento de pellets.
- Resuspender el pellet en 40 mL de Buffer 1. Repita los pasos del 4.5 y 4.6. Resuspender el pellet en 40 mL de tampón de 3. Repita los pasos del 4.5 y 4.6 dos veces.
- Resuspender los hepatocitos purificados en caliente DMEM + 10% FBS + 2 x penicilina-estreptomicina (Pen/Strep).
- Si las células se cultivan en placas de colágeno recubierta, que puedan adherirse por 1 h y reemplazar los medios de comunicación por lo menos una vez ya que esto evitará que cualquier contaminante bacteriano naciente.
- Hacer las placas de colágeno recubierta por incubación con colágeno de 0,05% en ácido acético al 0.001% durante al menos 1 h a 37 ° C y luego lavado con PBS 1 x.
- Si la viabilidad del hepatocito es baja y existe un deseo de obtener hepatocitos viables alta purificados a continuación, utilizar el siguiente protocolo adaptado de Kreamer et al10.
- Mix 9 volúmenes de solución PVP (Percoll, una 23% w/w solución de agua y partículas de sílice coloidal 15-30 nm recubiertas de polivinilpirrolidona para la centrifugación de densidad) y el 1 volumen de 10 x HBSS para hacer una solución iso-osmótica de PVP (SIP).
- Añadir 24 mL de SIP a una estéril 50 mL cónico que pueden almacenarse en estas condiciones hasta por 2 meses a 4 ° C.
- Ajustar la concentración del hepatocito a 5-10 × 106 células/mL con medio de cultivo como el mencionado en el paso 4.8.
- Añadir 25 mL de la suspensión celular a cada mL 24 SIP con cónico y mezclar por inversión suave. La densidad de esta solución es de 1,06 g/mL.
- De centrífuga cónico 50 x g por 10 min a 4 ° C.
- Aspire el SIP y el floculante y resuspender las células en HBSS.
- Lavar las células por centrifugación a 50 x g por 10 min a 4 ° C.
- Repita el paso 4.10.6 una vez más y luego resuspender las células en un medio.
5. SEC purificación
- Sedimenten las células en los sobrenadantes de paso 4.6 girando los tubos a 163 x g durante 10 min, descartar el sobrenadante de los tubos y todos los pellets de células resuspender en 5 mL de RPMI sin suero y los piscina juntos en un tubo.
- Una vez que se agruparon todos pellets añadir RPMI a volumen final de 35 mL.
- El agrupado de centrífuga cónico a 25 x g por 3 minutos cuidadosamente aspirar el superior 25 mL de RPMI con una pipeta de 25 mL y lugar este medio con NPCs en un limpio 50 mL cónico en el hielo.
- Añadir 25 mL de RPMI fresco hacia el tubo y resuspender el precipitado.
- Repita el paso 5.3 para un segundo lavado y piscina el sobrenadante. Deseche los 10 mL restantes de pellet (el sedimento consiste principalmente en hepatocitos muertos) y los medios de comunicación. Centrifugar el sobrenadante agrupado a 163 x g por 10 min.
- Durante la centrifugación, preparar los gradientes de la solución PVP en un cónico de 50 mL.
- Añadir 15 mL de solución PVP de 50% a los 50 mL cónico seguido por 20 mL de Percoll overlaid con una pipeta a la velocidad de eyección más lenta el 25%. Asegúrese de observar una línea de refracción en la marca de 15 mL que delimita las dos capas, ya que es donde los segundos y KCs se agregan después de la centrifugación.
- Resuspender las células previamente peleteadas en paso 5.5 en 10 mL de RPMI frío y superposición en el gradiente de solución PVP. Asegúrese de mantener una clara demarcación entre las dos capas. Centrifugue el gradiente a 805 x g por 20 min con un freno de 50%.
- Aspirar de arriba hacia abajo dirección a la marca de 20 mL en el tubo y desechar este material. Con una pipeta de 5 mL, recoge las SECs y KCs que se encuentran en la interfaz de 25/50%. Deseche cualquier marrón grupos de células que son hepatocitos muertos.
- Colocar las células en un 50 mL cónico y añadir RPMI hasta la marca de 50 mL para diluir la solución de PVP. Centrifugue a 200 x g durante 10 min, con freno de 80%.
- Aspirar y descartar el sobrenadante y resuspender el precipitado mientras se lava apagado el cono del cónico de 12 mL de RPMI caliente.
- Separar los segundos KCs por colocar el sobrenadante en una caja de Petri de poliestireno e incubar en una incubadora de cultivo de tejido humedecido durante 8 min a temperatura ambiente.
- Aspire los medios con una pipeta de 25 mL y enjuagar el plato con los mismos medios, con la pipeta ajustada en la velocidad más baja para recoger los restantes segundos mientras las KCs se adhieren a la placa.
- Centrifugue la seg a 200 x g durante 10 min y resuspender en RPMI + 5% FBS + pluma/Strep. Título de entonces las células y el lugar en platos de cultura recubiertas de colágeno.
Representative Results
Un método refinado, demostraciones para perfusión hepática y depuración/enriquecimiento de hepatocitos y segundos se presenta aquí que proporciona consejos detallados para celular óptimo, purificación, enriquecimiento similar a otros informes impresos compilados en esta referencia revisión 5. Los pasos críticos que determinan el éxito de purificación celular ocurren en la ruta y detalles técnicos del procedimiento de perfusión de colagenasa y están señalados en el presente Protocolo. La puesta a punto para el aparato es bastante sencilla y rentable con equipo normal de laboratorio, a diferencia de otros sistemas que se han publicado11 (figura 1). En esta configuración, la bandeja manteniendo el ratón está sentado en el baño de agua con algunos de lo exceso de tubo en el baño de agua para mantener la temperatura de los líquidos inunda dentro del hígado. El aparato como se muestra aquí puede utilizarse para ratones y ratas, con una geometría ligeramente diferente para perfusión hepática de rata12 (figura 2).
En este procedimiento, es perfunde el hígado vía la vena porta en lugar de la vena cava (que es otra vía de perfusión popular) debido a su facilidad de acceso dentro del abdomen y que la vena se alimenta directamente en el hígado. El espectador debe ser consciente de que la vena porta tiene varias pequeñas ramas que pueden la solución, y el catéter debe colocarse más allá de estas ramas para éxito13 (figura 3). Una vez que se identifica la vena porta, pinzas curvadas se utilizan para dibujar una sutura quirúrgica o hilo de poliéster debajo de la vena porta entre el hígado y la vena pancreática duodenal superior. Las pinzas también se utilizan para alisar hacia fuera de la vena porta que está bajo presión positiva (figura 4A). La aguja dentro del catéter debe colocarse en paralelo y junto a la vena (figura 4B) y el bisel se debe introducir suavemente en el lumen de la vena (figura 4C). Se indicará la colocación correcta de sangre que aparecen a lo largo del catéter. Una vez que la aguja se retrae el catéter debe ser estabilizado con un hilo atado en él y la presión obligará a sangre para arriba a través del catéter. Se recomienda conectar el catéter a la tubería de la bomba antes de que los derrames de sangre hacia fuera (figura 4D). Una vez conectado el tubo de la bomba, inmediatamente cortar un vaso sanguíneo importante como el de la vena cava o aorta abdominalis para el drenaje de sangre y fluidos (figura 5A). Es generalmente necesario cortar el lado de la pared abdominal del ratón para el drenaje suficiente, como una acumulación de sangre en el abdomen dificulta visualizar el proceso de perfusión, y la sangre puede llevar en la purificación de la célula (figura 5 B). una vez que la PBS comienza a inundar el hígado, el hígado se blanch con la ausencia de sangre (figura 5C). Si sólo algunos de los lóbulos blanch, la causa probable es que el catéter ha sido colocado demasiado lejos dentro del hígado y tendrá que ser respaldada a cabo lentamente. Una vez que se confirme la colocación del catéter, utilice cinta adhesiva resistente al agua para fijar el tubo en su lugar. Cinta de laboratorio no suele ser suficiente. Para confirmar la colocación correcta del catéter, apretar el vaso sanguíneo cortado para dejar drenaje y observar el aumento de la presión dentro del hígado. Hacer esto ayudará a limpiar la sangre fuera del hígado(figura 5). Esto también se debe hacer cuando la solución de colagenasa entra inicialmente en el hígado para asegurarse de que todos los lóbulos están expuestos a la colagenasa. Después de la colagenasa solución funciona hacia fuera, una digestión buena colagenasa es indicativa por la separación de la cápsula de Glisson de la parenquimia.
El procedimiento general para la purificación celular está delineado en la figura 6 y figura 7 en la que hepatocitos se cosechan desde el principio en el procedimiento durante la baja velocidad gira y son muy puros después de 4 lavados en búferes que contiene BSA (figura 8 ). Segundos son co purificados con KCs en un gradiente PVP (figura 9A) y luego separados por adherencia selectiva en un poliestireno recubiertas de colágeno plato de Petri. La pureza de los segundos con este método es 83-90% puro y depende en gran medida de la eficacia global de la digestión de la colagenasa (figura 9B). Mediciones cuantitativas usando luz microscopia (como los hepatocitos y segundos tienen características distintivas de otras células) muestran que en una preparación representante, hepatocitos son casi 100% puro y SECs más puro de 89% (tabla 1). Por otra parte, un enriquecimiento mayor de segundos puede obtenerse por separación magnética de la columna después de que el gradiente PVP, aunque esto es más allá del alcance del presente Protocolo. Puede encontrar más información sobre separación magnética de segundos y KCs en Meyer et al. 9 y Liu et al. 14 debe recordarse que viabilidad de hepatocitos disminuye rápidamente en un hígado insuficientemente digerido, pero esto no es cierto es necesario para los PNJs. hígados insuficientemente digeridos también producen desechos más celular, que no es totalmente eliminado en los pasos de centrifugación.
Figura 1 : Representación esquemática de la suite de perfusión. Los frascos se llevan a cabo en lugar por las abrazaderas (no mostradas); la tubería que contenga líquido se intercambia del frasco de 1L en el matraz de 125 mL durante el procedimiento es representada por la línea punteada roja. Tenga en cuenta, que el oxígeno de la alimentación de la burbuja no directamente en las soluciones en los frascos. Los corchos también deben ser con muescas para permitir un flujo líquido de circuito cerrado con el tubo insertado en la ranura. Esto es fundamental durante el calentamiento del tubo y expulsión de aire en la tubería. La purga de aire está compuesto por el conector en T que está conectado a la tubería de Tygon y clamps de pellizco para rápida apertura y cierre del sistema. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2 : La suite de perfusión durante la perfusión de hígado de ratón. Se coloca la bandeja con el ratón en la esquina de la bañera de agua. El oxígeno está desconectado de la solución de la colagenasa como ya fue oxigenada durante el calentamiento. Ubicación de elementos son A) oxígeno líneas, L B) 1 frasco que contiene PBS, matraz C) 125 mL que contiene tampón 2 con colagenasa, D) bomba, controles E) bomba, F) botella lavagases, línea G) líquido del frasco, a través de la bomba y el ratón. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3 : Imagen de la vascularización del abdomen ratón. Inserción del catéter debe estar justo debajo de las uniones de vena gástricas y pancreáticas viene de la vena porta (punto verde) y la punta debe colocarse cerca del hepáticas derecho e izquierdas venas porta (punto amarillo) que forma un tenedor en los lóbulos principales del hígado. Una vez lograda la correcta colocación, el catéter debe ser estabilizado con hilo con un nudo simple. K = riñón, L = hígado, SI = intestino delgado. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4 : Colocación de un catéter en la vena porta. (A) los fórceps se utilizan para la congestión sanguínea de la vena porta y a enderezar la vena para la colocación del catéter. (B) el catéter está alineado paralelamente a la vena porta con el bisel hacia arriba. (C) el bisel de la aguja dentro del catéter se inserta en la vena, no a través de la vena. (D) la aguja del catéter está retraído y sangre a contracorriente a través del catéter según lo indicado por la punta de las pinzas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5 : Perfusión hepática adecuada. (A) después de la colocación del catéter, el extremo hembra del Luer del catéter se conecta con el extremo Luer macho (corte de una jeringa de 1 mL) de la tubería de la bomba. (B) después de que corte uno de los principales vasos sanguíneos descendentes, sangre y PBS se drena del abdomen por el lado del ratón de corte con tijeras. (C) el hígado debe blanquear es limpiar la sangre y (D) se hinchará cuando bajo presión por cierre exprime los vasos sanguíneos cortados con pinzas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 6 : Esbozo esquemático de hepatocitos purificación y aislamiento de NPC. La mayoría de los pasos de centrifugación pretende quitar hepatocitos vivos y muertos de las células no parenquimatosas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 7 : Esquema esquema de purificación y enriquecimiento seg. NPCs están separados por el gradiente PVP, seguido por la separación de la SEC poca adherencia a una placa de poliestireno estándar. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 8 : Purificada hepatocitos. Hepatocitos se revestidos en placas de cultivo de tejidos de colágeno cubierto con DMEM + 8% FBS + pluma/Strep y se incubaron durante 6 h seguido de la colección de imágenes por un microscopio a 400 X. Bar es igual a 20 μm. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 9 : Purificación seg. Segundos (A) y KCs se recolectaron de la interfaz de JcJ de 25/50% (flechas amarillas) y lavados con medio libre de suero. (B) los segundos separadas de las KCs por adherencia selectiva en platos de Petri estándar, lavadas y plateados en platos de cultivo de tejidos de colágeno recubiertas en RPMI + 5% FBS. Imágenes fueron tomadas por un microscopio invertido de EVOS a 400 X. Bar es igual a 20 μm. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 10 : Microscopía electrónica de barrido de la anatomía del hígado del ratón. Un hígado de ratón fue inundado con PBS seguido de fijador (cacodilato de sodio 100 mM, 12 mL 25% glutaraldehído al 16% paraformaldehido de 15,6 mL, 2,65 mM cloruro de calcio, sacarosa 180,2 mM, mezclada en 100 mL de solución) a una velocidad de 1 mL/min durante 4 minutos los tejidos fueron cortados y preparada para microscopía electrónica de barrido. Imágenes se recogieron en una emisión de campo SEM 10, 000 X. Flechas amarillas indican las microvellosidades entre los hepatocitos. Bar es igual a 5 μm. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 11 : Visualización de muertos versus hepatocitos vivo. Después de 2 lavados con tampón 1, hepatocitos peletizados pueden evaluarse para relación vivo/muerto ojo. Un balín ligero (izquierda) indica que al menos la mitad de los hepatocitos están muertos. El sedimento más oscuro a la derecha es peleteado más firmemente a la parte inferior del tubo y más del 90% en vivo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Tabla 1: Purificación de la célula | ||
| Tipo de la célula | células de destino % | % otras células |
| Hepatocitos | 99 | 1 |
| Células endoteliales Sinsusoidal | 89.1 | 10.9 |
Tabla 1: Evaluación de la pureza de la célula por microscopia ligera.
Discussion
Este protocolo destaca las herramientas que están disponibles y que brindará al usuario una alta tasa de éxito en este procedimiento. Una perfusión exitosa es fundamental para cualquier aplicación aguas abajo cuando se trabaja con células primarias.
Hay algunos pasos críticos del procedimiento que determinan el éxito. En primer lugar, la colocación de la punta del catéter en la vena porta debe ser la correcta. Si se coloca demasiado lejos dentro del hígado, solamente los lóbulos menores se perfunde. La punta debe estar justo debajo de las ramas derecha e izquierdas de la vena porta. La ventaja de utilizar un polímero compuesto catéter sobre una aguja es que la púa de la aguja es más probable durante la perfusión de un catéter a la vena. En segundo lugar, la cantidad y calidad de colagenasa determinan la eficiencia de la digestión del hígado. En este procedimiento, previamente calificado colagenasa tipo 4 fue utilizada y se resuspendió en 0,5 mg/mL en tampón 2 Si la actividad de la colagenasa a ensayarse es mayor a 900 UI.
Al final de la perfusión de la colagenasa, el hígado debe conservar un bronceado algo oscuro al color marrón. Si es un color tan claro, la mayoría de los hepatocitos está muerta. El hígado debe estar cayendo a pedazos cuando el corte del ratón. En las mejores condiciones el hígado puede ser sacado con pala fuera de la cavidad del cuerpo del ratón con una cuchara pequeña. Hígado en esta condición siempre da viabilidad celular muy alta. Si se necesita mucho esfuerzo para sacudir las células, si el hígado está aún firme durante la extracción, o si hay mucho de la fuerza necesaria para mover los hepatocitos a través de los filtros, los hepatocitos tendrá una baja viabilidad. Hepatocitos están cubiertos por microvellosidades, que les permite tener un área superficial muy alto (figura 10). Digestión incompleta conserva a las ensambladuras de la célula-célula entre hepatocitos y esquila mecánica a desgarrar la membrana del plasma. In situ la perfusión con colagenasa es el mejor método que rompen las células y mantener alta viabilidad. En la figura 11, dos hepatocitos preparativos en que la célula de las pelotillas fueron comparados después de algunos lavados en tampón 1. La pelotilla de la izquierda es más ligera y contiene una viabilidad de las células de alrededor del 50%. La pelotilla de la derecha es más oscura y tiene una viabilidad de 92%. Del mismo modo, cuando el líquido se vierte desde los 50 mL cónico, la pelotilla más oscuro es estacionaria dentro del tubo, en contraste con la pelotilla más ligero, que se deslizará en el tubo, el líquido se vierte apagado. Menor viabilidad de las células o perfusiones ineficientes pueden ocurrir cuando el hígado tiene altos niveles de esclerosis.
Puesto que en hepatocitos tienen una densidad más alta que los hepatocitos muertos, los procedimientos de centrifugación se traducirá en una preparación que es muy pura en hepatocitos viables15. Si hay una gran cantidad de hepatocitos muertos (que a menudo se produce cuando las condiciones son subóptimas), vivo células pueden ser más enriquecidas y separadas de las células muertas utilizando gradientes PVP. Además, puesto que en hepatocitos de pellets más hepatocitos muertos, aspiración de la parte superior 3rd de la pelotilla también aumentará la relación de directo a las células muertas de la pelotilla. Estos procedimientos son rápidos y fáciles métodos para separar viven de hepatocitos muertos y desechos cuando sea necesario de la célula10,16. Esto es particularmente útil si la muestra es preciosa, y sólo algunas millones células se necesitan para el experimento.
En conclusión, este es un método fácil y eficiente para la recolección de hepatocitos y segundos desde el hígado. A precios corrientes, el costo de realizar este procedimiento incluyendo todos los reactivos y materiales desechables es menores de 75 USD por preparación. Si se desean varios ratones, es mejor proceder a la purificación de hepatocito y mantenga la fracción NPC en el hielo hasta los ratones han sido procesados. NPCs son generalmente estables en hielo durante al menos 5 h, pero tiempos más largos no han sido probados en este laboratorio.
Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Financiamiento proviene en parte del NIH de grant R01HL130864.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 L Erlenmeyer flask | Fisher Scientific | S63274 | |
| 250 mL Erlenmeyer flask | Fisher Scientific | S63271 | |
| silicone tubing | Cole-Parmer | 96400-14 | This tubing runs from the flasks through the pump to the T connector and then to the 1.0 mL syringe that is connected to the catheter. |
| Tygon tubing | Fisher Scientific | R3603 | Used as an adaptor between 96400-14 and pipettes and T connector. This may also be used for the oxygen tubing. |
| T-connectors | Cole-Parmer | EW-06294-82 | |
| Quick dissconnects | Fisher Scientific | 6150-0010 | |
| Pinch Clamps | Fisher Scientific | 6165-0002 | |
| Masterflex L/S Variable speed Pump, model 7553-70 | Cole-Parmer | EW-07559-00 | Periplastic pump with variable speed |
| Pump head, model 7014-20 | Cole-Parmer | EW-07014-20 | |
| glass graduated 1.0 mL pipettes | Fisher Scientific | 13-678 | |
| curved non-serrated scissors | Fine Science Tools | 14069-12 | |
| Dumont forceps | Fine Science Tools | 11252-20 | |
| Curved forceps | Fine Science Tools | 13009-12 | |
| 10 mL syringe | Fisher Scientific | 03-377-23 | Only barrel of syringe will be needed |
| sterlized spoon | Home supply store | ||
| Cotton ball(s) | Home supply store | ||
| Polyester sewing thread | Home supply store | ||
| Masking tape | Home supply store | ||
| thumb tacks | Home supply store | ||
| styrofoam pad | 50 mL conical rack | ||
| cookie/baking sheet | Home supply store | ||
| Absorbant underpads | Fisher Scientific | 14-206-64 | |
| 19 L water bath | Fisher Scientific | TSCOL19 | |
| BD Insyte Autogaurd Shielded IV Catheter 24 guage | Becton Dickinson | 381412 | Plastic cathetar with retractable needle |
| Crystallizing dishes 100x50 | VWR | 89000-290 | |
| Polystyrene petri dishes | Sigma Aldrich | P5481-500EA | |
| 50 mL conical tubes | Fisher Scientific | 12-565-270 | |
| graduated pipettes (5 mL) | Fisher Scientific | 170355 | |
| graduated pipettes (25 mL) | Fisher Scientific | 170357 | |
| EasyStrainer 100 μM | Greiner bio-one | 542000 | 100 μm filter |
| EasyStrainer 40 μM | Greiner bio-one | 542040 | 40μm filter |
| Sterile transfer pipettes | Fisher Scientific | 13-711-20 | |
| Refrigerated swinging bucket centrifuge | Sorvall Legend XTR | 75-217-406 | Centrifuge with swinging bucket rotar |
| Galaxy 170R tissue culture incubator | Eppendorf | CO170R-120-0000 | Humidified tissue culture incubator |
| Reagents | |||
| Name | Compound | Grams (g/L) | Millimolar (mM) |
| Buffer 1, pH 7.4 | NaCl | 8.3 | 142 |
| KCl | 0.5 | 6.7 | |
| HEPES | 2.4 | 10 | |
| BSA | 15 | 0.226 | |
| Buffer 2, pH 7.4 | NaCl | 3.9 | 66.74 |
| KCl | 0.5 | 6.71 | |
| CaCl2 | 0.7 | 6.31 | |
| HEPES | 24 | 100 | |
| BSA | 15 | 0.226 | |
| Phenol Red | 0.01 | 0.03 | |
| Buffer 3, pH 7.4 | NaCl | 8 | 137 |
| KCl | 0.35 | 4.7 | |
| MgSO4 | 0.08 | 0.66 | |
| CaCl2 | 0.18 | 1.62 | |
| HEPES | 2.4 | 10 | |
| BSA | 15 | 0.226 | |
| PBS, pH 7.4 | NaCl | 8 | 137 |
| KCl | 0.2 | 2.7 | |
| Na2HPO4-7H2O | 1.15 | 4.3 | |
| KH2PO4 | 0.2 | 1.4 | |
| Other reagents | |||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Percoll (PVP solution) | GE Healthcare | 288555 | |
| Collagenase Type IV | Sigma Aldrich | C5138 | |
| Isoflurane | Abcam | ab144581 | |
| Hepatocyte Growth Medium | |||
| DMEM | Gibco | 11965118 | |
| 10% by volume fetal bovine serum | Gibco | 10437010 | |
| Pen/Strep (2x) | Gibco | 15140148 | |
| Long-term Hepatocyte Growth Medium | |||
| DMEM | |||
| 10% by volume fetal bovine serum | Gibco | 10437010 | |
| Pen/Strep (2x) | Gibco | 15140148 | |
| Glucagon | Sigma | G3157-2mg | 14 ng/mL |
| Insulin | Sigma | I9278-5mL | 0.5 U/mL |
| Hydrocortisone | Sigma | H0888-1g | 7.5 mg/mL |
| Epidermal Growth Factor | BD Biosciences | 354001-100ug | 20 ng/mL |
| LSEC medium | |||
| RPMI | Gibco | 11875119 | |
| 10% by volume fetal bovine serum | Gibco | 10437010 | |
| Pen/Strep (2x) | Gibco | 15140148 |
References
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