Summary
इस प्रोटोकॉल का लक्ष्य उच्च व्यवहार्यता और जिगर से हेपैटोसाइट्स और sinusoidal endothelial कोशिकाओं की उच्च उपज प्राप्त करने के लिए है । इस पोर्टल नस के माध्यम से एक प्रकार चतुर्थ collagenase समाधान के साथ जिगर perfusing द्वारा पूरा किया है, अंतर के बाद हेपैटोसाइट्स और sinusoidal endothelial कोशिकाओं को प्राप्त करने के लिए केंद्रापसारक ।
Abstract
इस प्रोटोकॉल माउस हेपैटोसाइट्स और sinusoidal endothelial कोशिकाओं (सेकेंड) संवर्धन के लिए उपयुक्त या सेल lysates प्राप्त करने के लिए के लिए उच्च उपज और व्यवहार्यता प्राप्त करने के लिए एक विधि प्रदर्शित करता है । इस प्रोटोकॉल में, पोर्टल नस कैथीटेराइजेशन के लिए साइट के रूप में प्रयोग किया जाता है, बजाय वेना कावा, यह अंतिम जिगर की तैयारी में अंय संभव कोशिका प्रकार के संदूषण सीमा के रूप में । प्रक्रिया के दौरान कोई विशेष उपकरण की आवश्यकता है । एक जल स्नान गर्मी के एक स्रोत के रूप में सभी बफ़र्स और समाधान के तापमान को बनाए रखने के लिए प्रयोग किया जाता है । एक मानक सिकुड़नेवाला पंप के लिए तरल पदार्थ ड्राइव किया जाता है, और एक प्रशीतित तालिका टॉप केंद्रापसारक केंद्रापसारक प्रक्रियाओं के लिए आवश्यक है । इस तकनीक की ही सीमा है, जो 18-25 जी आकार रेंज में चूहों में से कुछ पर चुनौती दे रहा है पोर्टल नस के भीतर कैथेटर की नियुक्ति । इस तकनीक का एक लाभ यह है कि केवल एक नस छिड़काव के लिए उपयोग किया जाता है और नस के लिए उपयोग जल्दी है, जो ischemia और जिगर है कि यकृत कोशिका व्यवहार्यता को कम कर देता है की reperfusion को कम करता है । इस प्रोटोकॉल के लिए एक और लाभ यह है कि यह आसान है मृत हेपैटोसाइट्स से रहने के लिए सेलुलर घनत्व में अंतर के कारण दृष्टि से जीना अंतर केंद्रापसारक कदम के दौरान । इस प्रोटोकॉल से कोशिकाओं को किसी भी बहाव आवेदन के लिए सेल संस्कृति में इस्तेमाल किया जा सकता है और साथ ही किसी भी जैव रासायनिक आकलन के लिए कार्रवाई की ।
Introduction
जिगर की Collagenase छिड़काव हेपैटोसाइट्स प्राप्त करने के लिए 1950 के दशक के बाद से किया गया है और लगातार1,2,3,4पर सुधार किया गया है । के तरीकों में से कई की एक बहुत अच्छी समीक्षा, तकनीक, और जिगर सेल शुद्धि में इस्तेमाल किया एजेंट मेयेर एट अल5में संकलित किया गया है । अत्यधिक व्यवहार्य हेपैटोसाइट्स और सेकेंड की एक संतोषजनक उपज प्राप्त करना तकनीकी रूप से चुनौतीपूर्ण है । यांत्रिक बलों है कि collagenase की गुणवत्ता सहित कोशिकाओं को अलग चर कि नियंत्रण मुश्किल कर रहे है में से कुछ हैं । यांत्रिक बलों के लिए संवेदनशीलता hepatocyte के कारण, उनके व्यवहार्यता स्पष्ट रूप से उप इष्टतम स्थितियों में कम है, अलगाव के लिए इष्टतम स्थितियों का वर्णन एक प्रोटोकॉल के लिए की आवश्यकता को उत्साह । सेकेंड यांत्रिक कतरनी के प्रति संवेदनशील होने के लिए नहीं दिखाई देते हैं । collagenase पाचन के साथ सीटू छिड़काव में अब तक का सबसे अच्छा तरीका है कोशिका सेल जंक्शनों जिगर और आंत और तिल्ली6जैसे अन्य अंगों से एकल सेल तैयारियों को प्राप्त करने के लिए बाधित करने के लिए. इस प्रोटोकॉल पोर्टल नस में एक बाधक प्लास्टिक कैथेटर का उपयोग करने के बजाय एक चीरा है कि पोर्टल नस पतन के लिए कारण सकता है, के रूप में Smedsrød एट अल7में वर्णित छिड़काव बफर शुरू करने के लिए एक सरल तरीका प्रदर्शित करता है ।
इस पांडुलिपि के लक्ष्य के लिए सबसे महत्वपूर्ण जिगर फले प्रक्रिया में सफलता के लिए आवश्यक कदम का प्रदर्शन है । इन चरणों कैथेटर प्लेसमेंट, छिड़काव तरल पदार्थ का प्रवाह, और पाचन के बाद ऊतक की हैंडलिंग शामिल हैं । प्रवाह दर रक्त प्रवाह की प्राकृतिक दर से ऊपर समायोजित कर रहे हैं, लेकिन Glisson के कैप्सूल बरकरार रखने के लिए काफी कम है । एक बार जिगर ठीक से पचता है और कोशिकाओं को समाधान में अलग कर रहे हैं, कोशिका शुद्धि अपेक्षाकृत सरल है कि क्या यह अंतर केंद्रापसारक द्वारा किया जाता है, प्लेट आसंजन, या चुंबकीय मनका शुद्धि द्वारा. लाइव हेपैटोसाइट्स एक उच्च घनत्व है और आसानी से nonparenchymal कोशिकाओं से शुद्ध कर रहे हैं (NPCs) और मृत हेपैटोसाइट्स धीमी गति के साथ केंद्रापसारक. अधिकांश अनुप्रयोगों के लिए, Kupffer कोशिकाओं को अलग करने के लिए प्लेट आसंजन (केसीएस) और सेकेंड एक आम विधि है8, हालांकि वहां रिपोर्ट है कि यह सेकेंड9का सबसे अच्छा शुद्धता का उत्पादन नहीं करता है । केसीएस के लिए ठोस कठोर सतहों का पालन करने की प्रवृत्ति है जल्दी और पेट्री व्यंजन (मानक polystyrene) इस प्रक्रिया के लिए सबसे अधिक इस्तेमाल किया सामग्री हैं । एसईसी या एंटीबॉडी के प्रयोग के साथ केसी शुद्धि-संयुग्मित चुंबकीय मोती निस्संदेह इन कोशिकाओं की महत्वपूर्ण शुद्धि के लिए सबसे अच्छा तरीका है, हालांकि इस प्रक्रिया को इस प्रोटोकॉल पर एक और 3-4 एच कहते है और कुल मिलाकरउपज9 कम है । इस रिपोर्ट में विस्तार से एक इष्टतम जिगर छिड़काव कि आम तौर पर व्यवहार्य कोशिकाओं की एक उच्च संख्या पैदावार के लिए प्रक्रिया को दर्शाता है ।
Protocol
इस प्रोटोकॉल में उल्लिखित सभी पशु प्रक्रियाओं को प्रोटोकॉल #1435 के अंतर्गत लिंकन-नेब्रास्का विश्वविद्यालय में संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति (IACUC) द्वारा अनुमोदित किया गया है ।
1. तैयारी
- समाधान और संस्कृति मीडिया की तैयारी
- सभी संस्कृति मीडिया और बफर सामग्री की तालिकाके अनुसार तैयार करें ।
- उपकरणों की तैयारी
- ४२ ° c, चर गति के साथ एक सिकुड़नेवाला पंप पर एक पानी स्नान (> 10 एल) सेट, और कुप्पी धारण करने के लिए clamps । घुमावदार कैंची और संदंश (चित्र 1) तैयार करें ।
- पर या पानी स्नान से सटे, एक स्टायरोफोम पैड (५० एमएल शंकु रैक) के साथ एक बेकिंग शीट (के बारे में ३८ x 26 सेमी) की स्थापना की, एक शोषक underpad एक 20 x 20 सेमी टुकड़ा (चित्रा 1) में कटौती के साथ मढ़ा ।
- आसपास मास्किंग टेप (5-8 सेमी) का एक टुकड़ा रखें । एक 20 सेमी पॉलिएस्टर सिलाई धागा पास प्लेस कि कट और उपयोग करने के लिए तैयार है । एक मुकर सुई (7 मिमी x 19 मिमी, चित्रा 1) के साथ एक प्लास्टिक कैथेटर प्राप्त करें ।
- कांच के बाहर की तैयारी
- clamps का उपयोग करना, जगह और पानी स्नान में एक 1 एल कुप्पी के साथ एक डाट कि दो 1 मिलीलीटर पिपेट समाधान में जा रहा है साथ 1x पंजाबियों की २०० मिलीलीटर समाविष्ट । रबर कॉर्क एक बंद सर्किट में तरल पदार्थ के संचलन की अनुमति के लिए पायदान पर है ।
- एक और क्लैंप के साथ, एक १२५ मिलीलीटर कुप्पी जिसमें एक डाट के साथ 2 बफर की ४५ मिलीलीटर है कि दो 1 मिलीलीटर पिपेट है, जिसमें से एक कुप्पी के नीचे के पास तरल में है और दूसरे जो तरल के ऊपर रहता है और कुप्पी में ऑक्सीजन उड़ रहा है जगह है ।
नोट: डाट में प्रत्येक पिपेट टयूबिंग के आसान स्विचन के लिए अंत करने के लिए संलग्न एक त्वरित डिस्कनेक्ट अनुकूलक होगा । ऑक्सीजन धीरे डाट में पिपेट है कि तरल में डूबे नहीं है के माध्यम से दोनों कुप्पी में बह जाएगा । - अलग सेट दो बाँझ सघन बर्तन ।
2. पशु प्रक्रिया
- पानी के स्नान में ४२ ° c के लिए पंजाबियों और बफर 2 समाधान को गर्म और एक बंद सर्किट में टयूबिंग में कम से कम 20 मिलीलीटर/मिनट के लिए पंजाब परिचालित तरल लाइनों को गर्म रखने के लिए । ४२ डिग्री सेल्सियस के लिए संभव के रूप में बंद रहने के लिए पानी के स्नान में किसी भी अतिरिक्त टयूबिंग विसर्जित कर दिया । 1 एल पंजाबियों से युक्त कुप्पी में टयूबिंग के पुरुष अंत नाली ।
- शोषक underpad पर एक कपास की गेंद प्लेस और 30% isoflurane के बारे में 2 मिलीलीटर जोड़ें (पॉलीथीन ग्लाइकोल २०० जो isoflurane के वाष्पीकरण दर कम हो जाती है में बना) एक स्थानांतरण पिपेट का उपयोग कपास की गेंद पर ।
- पूंछ द्वारा माउस उठाओ, यह सघन व्यंजन में से एक में जगह है, और फिर जल्दी से कपास की गेंद पर पकवान उलट ताकि माउस एक छोटा सा स्थान है जिसमें संज्ञाहरण श्वास के लिए है । माउस की साँस लेने की दर का निरीक्षण और सुनिश्चित करें कि माउस को प्रभावी ढंग से संज्ञाहरण के तहत है ।
नोट: श्वास दर धीमी और गहरी, पूंछ झूलता हुआ, और संज्ञाहरण के तहत चुटकी परीक्षण के लिए उत्तरदायी पंजे होना चाहिए; अतिरिक्त विवरणों के लिए IACUC दिशानिर्देश देखें. - जबकि माउस संज्ञाहरण के तहत जा रहा है (यह 1-2 मिनट लेता है), गोताख़ोर बाहर खींच और एक छोटे से कपास की गेंद डालने के द्वारा एक 10 मिलीलीटर सिरिंज के बैरल तैयार करते हैं । 1 जोड़ें-बैरल के अंदर कपास की गेंद को एक स्थानांतरण पिपेट के साथ 30% isoflurane के 2 मिलीलीटर और जगह प्रति बैरल खुले एक मेज पर नीचे अंत जबकि माउस के लिए इंतज़ार कर बेहोश हो जाते हैं ।
- जल्दी से सघन पकवान ले, अपनी पीठ पर माउस फ्लिप और इसकी नाक पर सिरिंज बैरल जगह है । डबल श्वास दर, पैर की अंगुली चुटकी, और झूलता हुआ पूंछ की जांच करें । पैर की अंगुली चुटकी और झूलता हुआ पूंछ के लिए कोई जवाब इंगित करता है कि माउस पूरी तरह से संज्ञाहरण के तहत नहीं है । थूथन पर सिरिंज बैरल रखो बेहोश बनाए रखने के लिए ।
- माउस के पंजे के माध्यम से अंगूठे हमलों प्लेस, लापरवाह स्थिति में फैलाया अंगों के साथ । ७०% isopropanol या इथेनॉल के साथ पेट और रिब पिंजरे गीला ।
- एक हाथ में सीधे संदंश के साथ, पेट के आधार के पास त्वचा को ऊपर उठा । दूसरे हाथ में कैंची के साथ, टेंट त्वचा और योनि में कटौती । चीरा क्षैतिज या टेंट त्वचा के आधार के पार होना चाहिए । त्वचा और योनि के सभी परतों के माध्यम से कटौती करने के लिए आंत तक पहुंच प्राप्त करने के लिए सुनिश्चित करें । पेट के आसपास के अंगों के किसी भी निक बिना दोनों पक्षों पर रिब पिंजरे तक के बाद में कटौती ।
- कम रिब पिंजरे में कटौती से त्वचा के प्रालंब कट । संदंश के पीछे के साथ आंतों को सही करने के लिए पोर्टल नस बेनकाब करने के लिए ले जाएँ ।
नोट: पशु से खून बह रहा कम होना चाहिए; पशु अभी भी श्वास और गहरी संज्ञाहरण के तहत होना चाहिए । - जिगर और बेहतर pancreaticoduodenal नस (चित्रा 3 तीर) के बीच पोर्टल नस के नीचे बंद घुमावदार संदंश रखें.
- पोर्टल नस के नीचे संदंश को खोलें । धागा समझ और ध्यान से यह इतना है कि यह पोर्टल नस के नीचे केंद्रित है के माध्यम से खींच । यह नीचे चिंच बिना पोर्टल नस के आसपास एक हाथ गांठ टाई ।
- पोर्टल नस के तहत घुमावदार संदंश प्लेस और धीरे से यह माउस की पूंछ की ओर खींचने के लिए बाहर नस (चित्रा 4ए) सीधा ।
- दूसरे हाथ में कैथेटर के साथ, संदंश (चित्रा 4) के पास पोर्टल नस के निचले हिस्से के साथ सुई चेहरे अप और समानांतर के बेवल जगह.
- धीरे से सुई (चित्रा 4सी) के साथ नस पंचर । सुई के बेवल नस के लुमेन में है सुनिश्चित करें । वसंत भरी हुई सुई वापस लेना और जब तक बेवल शिरापरक शाखा क्षेत्र के पास है नस के माध्यम से बहुलक कैथेटर पुश करने के लिए जारी है । इस जिगर के भीतर है । यदि कैथेटर सही ढंग से रखा गया है, रक्त की एक वापस प्रवाह दिखाई देगा । (चित्रा 4डी) ।
- अधिक हाथ गांठ कस और इसे नीचे खींच कैथेटर पर यह स्थिर मदद करने के लिए । तुरंत 20 मिलीलीटर/मिनट से पंप की दर को नीचे बारी करने के लिए और जल निकासी के लिए एक और प्रमुख रक्त वाहिनियों में कटौती । महाधमनी abdominalis को इष्टतम परिणामों के लिए काटें ।
- कैथेटर की महिला अंत करने के लिए टयूबिंग के पुरुष अंत प्लेस (चित्रा 5ए) । सुनिश्चित करें कि लाइन में कोई हवा के बुलबुले हैं । कैथेटर या तो जिगर में धक्का दिया या नस से बाहर नहीं है कि सावधान रहें । धागा की नियुक्ति आवश्यक नहीं है, हालांकि यह मदद करता है वापस-नस के प्रवाह को रोकने और सही स्थिति में कैथेटर रखने में मदद करता है (चित्रा 5बी, सी) ।
- underpad पर टयूबिंग स्थिर करने के लिए मास्किंग टेप का प्रयोग करें । सीधे संदंश का उपयोग करने के लिए प्रवाह रक्त वाहिका निचोड़ करने के लिए जिगर फुलाना कई बार यह सुनिश्चित करने के लिए सभी रक्त बाहर सूखा (चित्रा 5डी) है ।
नोट: मानक प्रयोगशाला टेप काम नहीं कर सकते हैं; हालांकि, मास्किंग टेप भी गीले परिस्थितियों में, underpad के लिए अटक रह जाएगा ।
3. लिवर छिड़काव
- जबकि जिगर पंजाबियों के साथ फ्लशिंग है, के बारे में उपाय Collagenase प्रकार चतुर्थ के 24 मिलीग्राम और यह पानी में स्नान 2 बफर के ४५ मिलीलीटर युक्त कुप्पी में जगह है । इस कुप्पी में तरल को घूमता हुआ ज़रूर रखें ताकि collagenase पूरी तरह घुल जाए और कुप्पी को वापस क्लैंप में जगह दी जाए ताकि कुप्पी के हिस्से वाले तरल युक्त भाग पानी में पूरी तरह जलमग्न हो जाए.
- के रूप में यह पंजाबियों के साथ फ्लश है जिगर के रंग में परिवर्तन का निरीक्षण करें । 1 एल कुप्पी से १२५ मिलीलीटर कुप्पी तक बहिर्वाह टयूबिंग बदलें । हवा के बुलबुले जिगर में प्रवाह करने की अनुमति नहीं है ।
- एक बार छिड़काव बफर जिगर तक पहुँच जाता है, संक्षेप में पोत के भीतर कुछ दबाव बनाने के लिए तंग प्रवाह रक्त वाहिका निचोड़ और इस तरल जिगर के सभी पालियों को भरने के लिए अनुमति देते हैं । के रूप में है कि जिगर (Glisson के कैप्सूल) आसपास के पतले संयोजी ऊतक फट सकता है और जिगर की केशिका बिस्तर के भीतर तरल के प्रवाह को नष्ट कर बहुत लंबे समय से जल निकासी में कटौती करने के लिए नहीं, सुनिश्चित करें ।
- जब तक सभी ४५ मिलीलीटर ऊतक के माध्यम से प्रवाहित किया है जिगर के माध्यम से perfuse के लिए collagenase के साथ बफर 2 की अनुमति दें ।
नोट: यदि सफल, Glisson के कैप्सूल पैरेन्काइमा या जिगर ऊतक से अलग किया जाना चाहिए और जिगर खुद को अमली प्रकट करना चाहिए । - अन्य सघन पकवान के लिए 1 बफर के बारे में 10 मिलीलीटर जोड़ें और यह माउस के बगल में जगह है ।
- कैथेटर निकालें और पंप बंद ।
- साथ ही सीधे संदंश और कैंची से लिवर को माउस से काट लें । यदि collagenase पाचन बहुत कुशल था, यह हाथ पर एक साफ, बाँझ चंमच के लिए माउस से जिगर स्कूप और यह 1 बफर में जगह आवश्यक हो सकता है ।
4. Hepatocyte शुद्धिकरण
नोट: कोशिकाओं के हेरफेर एक बाँझ ऊतक संस्कृति हुड में प्रदर्शन करने के लिए प्रदूषित सीमा अगर कोशिकाओं को सभी बाद के चरणों में संस्कृति हो रहे हैं ।
- बाँझ तकनीक का प्रयोग, संदंश के साथ जिगर हड़पने के लिए और धीरे जिगर से कोशिकाओं को हिला. आंसू के अलावा या वापस खींच Glisson के कैप्सूल: बफर अपारदर्शी हो जाएगा के रूप में कोशिकाओं जिगर से हिल रहे हैं ।
- एक १०० µm शीर्ष पर रखा फिल्टर के साथ एक ५० मिलीलीटर शंकु में बंद सेल समाधान डालो ।
- जिगर अवशेष करने के लिए और अधिक बफर 1 जोड़ें और बाहर कोशिकाओं को मिलाने के लिए जारी है । जारी रखें जब तक जिगर कोशिकाओं से रहित प्रकट होता है या जब जिगर के अपच भागों अब और कोशिकाओं उपज नहीं है ।
- एक ४० µm फिल्टर युक्त एक और ५० मिलीलीटर शंकु में सेलुलर तरल डालो ।
- 3 मिनट के लिए १०० x g पर एक झूलते बाल्टी रोटर में शंकु केंद्रापसारक ।
नोट: इस सेल गोली बेदखल कर सकते है के रूप में अधिकतम ब्रेक का उपयोग न करें । 4 डिग्री सेल्सियस पर सभी शेष केंद्रापसारक कदम के लिए पर्याप्त है जो ८०% पर ब्रेक का प्रयोग करें - supernatant (जो NPCs और मृत हेपैटोसाइट्स शामिल है) एक स्वच्छ शंकु में डालो और यह बर्फ पर जगह है । सुनिश्चित करें कि यह एक प्रस्ताव में किया जाता है गोली पालन निरीक्षण ।
- 1 बफर के ४० मिलीलीटर में गोली reसस्पेंड । चरण ४.५ और ४.६ दोहराएँ । 3 बफर के ४० मिलीलीटर में गोली reसस्पेंड । दोहराएं चरण ४.५ और ४.६ दो बार ।
- गर्म DMEM में शुद्ध हेपैटोसाइट्स reसस्पेंड + 10% FBS + 2x पेनिसिलिन-Streptomycin (कलम/Strep) ।
- यदि कोशिकाओं कोलेजन लेपित प्लेटों पर संस्कृति रहे हैं, उंहें 1 ज के लिए पालन करने के लिए और मीडिया की जगह के रूप में यह किसी भी नवजात जीवाणु पदार्थों को रोकने के लिए कम एक बार की अनुमति होगी ।
- उंहें ०.००१% एसिटिक एसिड में ०.०५% कोलेजन के साथ के लिए ३७ डिग्री सेल्सियस कम से कम 1 ज, और फिर 1x पंजाबियों के साथ धोने से कोलेजन लेपित प्लेटें बनाओ ।
- यदि hepatocyte व्यवहार्यता कम है और वहां एक को शुद्ध उच्च व्यवहार्य हेपैटोसाइट्स तो निंनलिखित Kreamer एट अल10से अनुकूलित प्रोटोकॉल का उपयोग प्राप्त करने की इच्छा है ।
- एक आईएसओ-आसमाटिक pvp समाधान (घूंट) बनाने के लिए PVP समाधान (Percoll, एक 23% w/पानी और 15-30 एनएम कोलाइडयन सिलिका कण घनत्व के लिए polyvinylpyrrolidone में लेपित) के 9 संस्करणों मिश्रण और 10x HBSS की 1 मात्रा ।
- एक बाँझ ५० मिलीलीटर शंकु के लिए घूंट के 24 मिलीलीटर जोड़ें जो इन स्थितियों में 4 डिग्री सेल्सियस पर 2 महीने के लिए संग्रहीत किया जा सकता है ।
- 5-10 ×10 6 कोशिकाओं के लिए hepatocyte एकाग्रता समायोजित करें इस तरह के रूप में एक ४.८ कदम में नोट संस्कृति माध्यम के साथ/
- प्रत्येक 24 मिलीलीटर के लिए सेल निलंबन के 25 मिलीलीटर जोड़ें शंकु और कोमल उलटा द्वारा मिश्रण युक्त घूंट । इस समाधान का घनत्व १.०६ ग्राम/
- 10 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर ५० एक्स जी में शंकु केंद्रापसारक ।
- महाप्राण को पीएं और flocculant, और HBSS में कोशिकाओं को फिर से सस्पेंड करें ।
- 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए ५० x g पर केंद्रापसारक द्वारा कोशिकाओं को धो लें ।
- दोहराएं चरण 4.10.6 एक बार और फिर वृद्धि मध्यम में कोशिकाओं reसस्पेंड ।
5. एसईसी शुद्धि
- 10 मिनट के लिए १६३ x g पर ट्यूबों कताई द्वारा कदम ४.६ से supernatants में कोशिकाओं गोली । ट्यूबों से supernatants त्याग और सीरम के बिना RPMI के 5 मिलीलीटर में सेल छर्रों के सभी reसस्पैंड और उंहें एक साथ एक ट्यूब में पूल ।
- एक बार सभी छर्रों परित किया गया है, ३५ मिलीलीटर की अंतिम मात्रा में RPMI जोड़ें ।
- 3 मिनट के लिए 25 x g पर pooled शंकु केंद्रापसारक । ध्यान से एक 25 मिलीलीटर पिपेट के साथ RPMI के शीर्ष 25 मिलीलीटर महाप्राण और बर्फ पर एक साफ ५० मिलीलीटर शंकु में NPCs युक्त इस मीडिया जगह है ।
- ताजा RPMI के 25 मिलीलीटर ट्यूब वापस जोड़ें और गोली reसस्पेंड ।
- एक दूसरे धोने और पूल supernatant के लिए चरण ५.३ दोहराएँ । छोड़ शेष 10 मीडिया और गोली की मिलीलीटर (गोली मृत हेपैटोसाइट्स के ज्यादातर होते हैं) । 10 मिनट के लिए १६३ x g पर परित supernatant केंद्रापसारक ।
- केंद्रापसारक के दौरान, एक ५० मिलीलीटर शंकु में PVP समाधान ढाल तैयार करते हैं ।
- ५०% PVP समाधान के 15 मिलीलीटर जोड़ें ५० मिलीलीटर शंकु 25% Percoll के 20 मिलीलीटर के बाद एक pipettor धीमी इंजेक्शन गति के लिए सेट के साथ मढ़ा । हो 15 मिलीलीटर निशान पर एक अपवर्तन रेखा का निरीक्षण यकीन है कि दो परतों demarcates, के रूप में यह वह स्थान है जहां सेकेंड और केसीएस के बाद कुल होगा केंद्रापसारक ।
- पहले कदम ५.५ में ठंड RPMI के 10 मिलीलीटर में छर्रों और उंहें PVP समाधान ढाल पर ओवरले कोशिकाओं reसस्पेंड । दो परतों के बीच एक स्पष्ट सीमांकन बनाए रखने के लिए सुनिश्चित करें । ५०% पर एक ब्रेक सेट के साथ 20 मिनट के लिए ८०५ x g पर ढाल केंद्रापसारक ।
- महाप्राण ऊपर नीचे दिशा से 20 मिलीलीटर मार्क ट्यूब पर और इस सामग्री को त्यागें । एक 5 मिलीलीटर हस्तांतरण पिपेट के साथ, सेकेंड और केसीएस कि 25/50% अंतरफलक पर स्थित है इकट्ठा । कोशिकाओं के किसी भी भूरे रंग के झुरमुट को त्यागें क्योंकि ये मृत हेपैटोसाइट्स हैं ।
- एक ५० मिलीलीटर शंकु में कोशिकाओं प्लेस और ५० एमएल के लिए RPMI जोड़ने के लिए बाहर PVP समाधान पतला निशान । 10 मिनट के लिए २०० x जी पर केंद्रापसारक, ८०% ब्रेक के साथ ।
- महाप्राण और supernatant को त्यागें और गोली को फिर से स्थगित करते हुए शंकु के शंकु से धो लें जबकि गर्म RPMI के 12 मिलीलीटर में ।
- एक polystyrene पेट्री पकवान में supernatant रखकर केसीएस से सेकेंड अलग और कमरे के तापमान पर 8 मिनट के लिए एक humidified ऊतक संस्कृति मशीन में मशीन ।
- महाप्राण के साथ मीडिया को 25 मिलीलीटर पिपेट और कुल्ला प्लेट के साथ एक ही मीडिया, pipettor सेट करने के लिए सबसे कम गति पर इकट्ठा करने के लिए शेष सेक जबकि केसीएस प्लेट का पालन करें ।
- २०० एक्स जी में 10 मिनट के लिए सेक और RPMI में reसस्पैंड + 5% FBS + कलम/Strep । फिर कोशिकाओं titer, और कोलेजन में जगह-लेपित संस्कृति व्यंजन ।
Representative Results
एक प्रदर्शन, जिगर छिड़काव और हेपैटोसाइट्स और सेकेंड के शोधन/संवर्धन के लिए परिष्कृत विधि यहां प्रस्तुत किया है कि इष्टतम सेल शोधन/संवर्धन इस संदर्भ में संकलित अंय मुद्रित रिपोर्टों के समान के लिए विस्तृत सुझाव प्रदान करता है 5की समीक्षा करें । महत्वपूर्ण कदम है जो सेलुलर शुद्धिकरण के लिए सफलता का निर्धारण मार्ग में होते है और collagenase छिड़काव प्रक्रिया के तकनीकी विवरण और इस प्रोटोकॉल में उल्लिखित हैं । तंत्र के लिए सेट अप काफी सरल है और मानक प्रयोगशाला उपकरण के साथ प्रभावी लागत, अंय प्रणालियों कि प्रकाशित किया गया है के विपरीत में11 (चित्रा 1) । इस सेट अप में, माउस पकड़ ट्रे पानी स्नान में अतिरिक्त टयूबिंग में से कुछ के साथ पानी के स्नान पर बैठे है जिगर के भीतर perfusing तरल पदार्थ के तापमान को बनाए रखने । उपकरण के रूप में यहां दिखाया चूहों के रूप में अच्छी तरह से चूहों के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, चूहे जिगर छिड़काव के लिए एक अलग ज्यामिति के साथ12 (चित्रा 2) ।
इस प्रक्रिया में, जिगर वेना कावा के बजाय पोर्टल नस के माध्यम से perfused है (जो एक और लोकप्रिय छिड़काव मार्ग है) पेट के भीतर उपयोग की आसानी के कारण और है कि नस सीधे जिगर में खिलाती है । दर्शक पता होना चाहिए कि पोर्टल नस कई छोटी शाखाओं जो कम सर्किट perfusate हो सकता है, और कैथेटर इष्टतम सफलता13 (चित्रा 3) के लिए इन शाखाओं पिछले रखा जाना चाहिए । एक बार पोर्टल नस की पहचान की है, घुमावदार संदंश के लिए एक शल्य सीवन या जिगर और बेहतर अग्नाशय ग्रहणी नस के बीच पोर्टल नस के नीचे पॉलिएस्टर धागा आकर्षित किया जाता है । संदंश भी पोर्टल नस जो सकारात्मक रक्तचाप (चित्रा 4ए) के तहत है सीधा करने के लिए इस्तेमाल कर रहे हैं । कैथेटर के भीतर सुई समानांतर रखा जाना चाहिए और नस के बगल में (चित्रा 4बी) और बेवल धीरे नस के लुमेन (चित्रा 4सी) में डाला जाना चाहिए. उचित स्थान कैथेटर के साथ रक्त प्रदर्शित होने से संकेत दिया जाएगा । एक बार सुई कैथेटर से मुकर जाता है एक धागे पर नीचे बंधे के साथ स्थिर किया जाना चाहिए और रक्त दबाव कैथेटर के माध्यम से खून को मजबूर होगा । यह कैथेटर रक्त फैल से पहले पंप टयूबिंग से जुड़े होने की सिफारिश की है (चित्रा 4डी). एक बार पंप टयूबिंग जुड़ा हुआ है, तुरंत ऐसे वेना कावा या महाधमनी abdominalis के रूप में रक्त/द्रव जल निकासी के लिए एक प्रमुख रक्त वाहिनियों में कटौती (चित्रा 5) । यह आमतौर पर पर्याप्त जल निकासी के लिए माउस की पेट की दीवार के पक्ष में कटौती करने के लिए आवश्यक है, पेट में रक्त की एक buildup के रूप में यह मुश्किल छिड़काव प्रक्रिया कल्पना करने के लिए बनाता है, और रक्त कोशिका शुद्धि में ले सकता है (चित्रा 5 ख). एक बार पंजाबियों को लिवर perfuse शुरू हो जाता है, जिगर रक्त (चित्रा 5सी) के अभाव से सफेद होगा । यदि केवल पालियों के कुछ सफेद, तो संभावित कारण यह है कि कैथेटर जिगर के अंदर बहुत दूर रखा गया है और धीरे से बाहर का समर्थन करने की आवश्यकता होगी । कैथेटर की नियुक्ति की पुष्टि की है, जगह में टयूबिंग सुरक्षित करने के लिए पानी प्रतिरोधी मास्किंग टेप का उपयोग करें । सामान्य प्रयोगशाला टेप आमतौर पर पर्याप्त नहीं है । कैथेटर की उचित स्थान की पुष्टि करने के लिए, कट रक्त पोत जल निकासी संघर्ष और जिगर के भीतर वृद्धि के दबाव का पालन करने के लिए निचोड़ । ऐसा करने से लिवर के बाहर खून निकलवाने में सहायता मिलेगी (चित्रा 5डी) । यह भी किया जाना चाहिए जब collagenase समाधान शुरू में जिगर में चला जाता है सुनिश्चित करने के लिए कि सभी पालियों collagenase को उजागर कर रहे हैं । collagenase समाधान बाहर चलाता है के बाद, एक अच्छा collagenase पाचन पैरेन्काइमा से Glisson के कैप्सूल की जुदाई से संकेत मिलता है ।
सेलुलर शुद्धिकरण के लिए सामान्य प्रक्रिया चित्रा 6 और चित्रा 7 जिसमें हेपैटोसाइट्स कम गति के दौरान प्रक्रिया में जल्दी पर काटा जाता है में उल्लिखित है spins और BSA-युक्त बफ़र्स में 4 बहाकर के बाद बहुत शुद्ध कर रहे हैं (चित्रा 8 ). सेकेंड सह एक PVP ढाल पर केसीएस के साथ शुद्ध कर रहे है (चित्रा 9ए) और फिर एक कोलेजन पर चयनात्मक आसंजन से अलग-लेपित polystyrene पेट्री पकवान । इस विधि का उपयोग कर सेकेंड की पवित्रता ८३-९०% शुद्ध है और काफी हद तक collagenase पाचन की समग्र प्रभावशीलता पर निर्भर करता है (चित्रा 9बी). मात्रात्मक माप प्रकाश माइक्रोस्कोपी का उपयोग (के रूप में दोनों हेपैटोसाइट्स और सेकेंड अंय कोशिकाओं से अलग सुविधाओं है) बताते है कि एक प्रतिनिधि तैयारी में, हेपैटोसाइट्स लगभग १००% शुद्ध कर रहे है और सेकेंड सिर्फ ८९% से अधिक शुद्ध है (तालिका 1) । वैकल्पिक रूप से, सेकेंड के एक उच्च संवर्धन PVP ढाल के बाद चुंबकीय कॉलम जुदाई द्वारा प्राप्त किया जा सकता है, हालांकि है कि इस प्रोटोकॉल के दायरे से बाहर है । सेकेंड और केसीएस के चुंबकीय जुदाई के बारे में अधिक जानकारी मेयेर एट अल में पाया जा सकता है । 9 और लियू एट अल । 14 यह याद किया जाना चाहिए कि हेपैटोसाइट्स की व्यवहार्यता तेजी से एक अपर्याप्त पचा जिगर में कम हो जाती है, लेकिन यह NPCs के लिए आवश्यक सच नहीं है । अपर्याप्त पचा जिगर भी अधिक सेलुलर मलबे, जो पूरी तरह से नहीं है उत्पादन केंद्रापसारक कदम में सफाया ।
चित्र 1 : छिड़काव सुइट का योजनाबद्ध प्रस्तुतिकरण । बोतल clamps द्वारा जगह में आयोजित कर रहे है (नहीं दिखाया गया है); तरल पदार्थ युक्त टयूबिंग 1L कुप्पी से १२५ मिलीलीटर कुप्पी के लिए प्रक्रिया के दौरान बदली है लाल बिंदीदार रेखा द्वारा प्रतिनिधित्व किया है । ध्यान दें, कि ऑक्सीजन फ़ीड कुप्पी में समाधान में सीधे बुलबुला नहीं है । काग भी पायदान के भीतर डाला टयूबिंग के साथ एक बंद सर्किट द्रव प्रवाह की अनुमति के लिए पायदान पर होना चाहिए । इस टयूबिंग के गर्म अप के दौरान और टयूबिंग के भीतर सभी हवा के इंजेक्शन के लिए महत्वपूर्ण है । हवा खून टी कनेक्टर जो Tygon टयूबिंग और त्वरित खुला और प्रणाली के बंद करने के लिए चुटकी clamps से जुड़ा है से बना है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
चित्र 2 : माउस के दौरान छिड़काव सुइट जिगर छिड़काव. माउस के साथ ट्रे पानी स्नान के कोने पर रखा गया है । ऑक्सीजन collagenase समाधान है कि पहले से ही गर्म अप के दौरान oxygenated था के रूप में से काट दिया है । मदों की स्थिति एक है) ऑक्सीजन लाइनों, ख) 1 एल ' पंजाबियों युक्त कुप्पी, ग) १२५ मिलीलीटर कुप्पी युक्त collagenase के साथ बफर 2, डी) पंप, ई) पंप नियंत्रण, एफ) बुलबुला जाल, जी) द्रव लाइन कुप्पी से चल रहा है, पंप के माध्यम से और माउस के लिए. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
चित्र 3 : माउस पेट के vasculature की छवि । कैथेटर का सम्मिलन बस गैस्ट्रिक और अग्नाशय नस बंद पोर्टल नस (हरे डॉट) आ रहा जंक्शनों के नीचे होना चाहिए और टिप बाएँ और दाएँ यकृत पोर्टल नसों (पीले डॉट) के पास रखा जाना चाहिए जो जिगर के मुख्य पालियों में एक कांटा रूपों. एक बार सही प्लेसमेंट हासिल की है, कैथेटर एक साधारण हाथ गांठ का उपयोग धागे के साथ स्थिर किया जाना चाहिए । K = गुर्दे, एल = जिगर, SI = छोटी आंत. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
चित्र 4 : पोर्टल नस में कैथेटर प्लेसमेंट. (क) संदंश पोर्टल नस के रक्त engorgement सुनिश्चित करने के लिए और बाहर कैथेटर प्लेसमेंट के लिए नस को सीधा करने के लिए उपयोग किया जाता है । (B) कैथेटर ऊपर बेवल के साथ पोर्टल नस के साथ समानांतर में लाइन में खड़ा है । (ग) कैथेटर के भीतर सुई का बेवल नस में डाला जाता है, न कि नस के माध्यम से । (D) कैथेटर की सुई को वापस कर दिया जाता है और रक्त कैथेटर के माध्यम से backflow जाएगा जैसा कि संदंश की नोक द्वारा दर्शाया गया है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
चित्र 5 : उचित जिगर छिड़काव । (ए) कैथेटर प्लेसमेंट के बाद, कैथेटर की महिला Luer अंत पुरुष Luer अंत करने के लिए कनेक्ट कर रहा है (एक 1 एमएल सिरिंज से कटौती) पंप टयूबिंग की. (ख) प्रमुख उतरते रक्त वाहिकाओं में से एक को काटने के बाद, रक्त और पंजाबियों माउस की ओर कैंची के साथ टुकड़ा करने की क्रिया द्वारा पेट से सूखा रहे हैं । (ग) जिगर सफेद चाहिए, जबकि रक्त बाहर निकाल लिया है और (घ) जब दबाव में संदंश के साथ काट रक्त वाहिनियों बंद फैलाएंगे द्वारा प्रफुल्लित करना होगा । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
चित्र 6 : hepatocyte शुद्धि और एनपीसी अलगाव की योजनाबद्ध रूपरेखा । केंद्रापसारक कदम के अधिकांश के लिए गैर parenchymal कोशिकाओं से रहते है और मृत हेपैटोसाइट्स को दूर करने का लक्ष्य है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
चित्र 7 : योजनाबद्ध एसईसी संवर्धन और शुद्धिकरण की रूपरेखा । NPCs PVP एक मानक polystyrene प्लेट को लघु आसंजन द्वारा एसईसी जुदाई द्वारा पीछा ढाल द्वारा अलग कर रहे हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
चित्र 8 : शुद्ध हेपैटोसाइट्स. हेपैटोसाइट्स कोलेजन लेपित ऊतक DMEM के साथ संस्कृति प्लेटों पर चढ़ाया गया + 8% FBS + कलम/Strep और 6 के लिए मशीन द्वारा 400X पर एक खुर्दबीन द्वारा छवि संग्रह के बाद एच । बार के बराबर 20 µm. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.
चित्र 9 : एसईसी शुद्धि । (A) सेकेंड और केसीएस 25/50% PVP अंतरफलक (पीले तीर) से एकत्र किए गए और सीरम मुक्त माध्यम से धोया । (ख) सेकेंड मानक पेट्री व्यंजन पर चयनात्मक आसंजन द्वारा केसीएस से अलग किया गया, धोया, और RPMI में कोलेजन-लेपित ऊतक संस्कृति व्यंजन पर चढ़ाया + 5% FBS । छवियां एक EVOS 400X पर औंधा माइक्रोस्कोप द्वारा उठाए गए थे । बार के बराबर 20 µm. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.
चित्र 10 : माउस जिगर शरीर रचना विज्ञान की स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी. एक माउस जिगर निर्धारण के बाद पंजाबियों के साथ perfused था (१०० mm सोडियम cacodylate, 12 मिलीलीटर 25% glutaraldehyde, १५.६ मिलीलीटर 16% paraformaldehyde, २.६५ मिमी कैल्शियम क्लोराइड, १८०.२ मिमी सुक्रोज, १०० मिलीलीटर समाधान में मिश्रित) 1 मिलीलीटर/ऊतकों के लिए 4 मिनट की दर से और कटा हुआ था इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी स्कैनिंग के लिए तैयार. छवियां एक क्षेत्र उत्सर्जन SEM पर 10, 000X पर एकत्र किए गए । पीले तीर हेपैटोसाइट्स के बीच microvilli का संकेत देते हैं । बार के बराबर 5 µm. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.
चित्र 11 : मृत बनाम लाइव हेपैटोसाइट्स का दृश्य. 1 बफर के साथ 2 धोने के बाद, गोली हेपैटोसाइट्स आंख से जीना/मृत अनुपात के लिए मूल्यांकन किया जा सकता है । एक हल्का गोली (बाएं) इंगित करता है कि कम से हेपैटोसाइट्स आधा मर चुके हैं । सही पर गहरा गोली और अधिक दृढ़ता से ट्यूब के नीचे करने के लिए गोली है और अधिक से अधिक ९०% रहते है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
| तालिका 1: कक्ष शुद्धि | ||
| कक्ष प्रकार | % लक्ष्य कक्ष | % अंय कक्ष |
| हेपैटोसाइट्स | ९९ | 1 |
| Sinsusoidal endothelial कक्ष | ८९.१ | १०.९ |
तालिका 1: प्रकाश माइक्रोस्कोपी द्वारा कोशिका शुद्धता का आकलन.
Discussion
इस प्रोटोकॉल उपकरण है कि उपलब्ध है और है कि उपयोगकर्ता इस प्रक्रिया में सफलता की एक उच्च दर वहन करेगा पर प्रकाश डाला गया । एक सफल छिड़काव प्राथमिक कोशिकाओं के साथ काम करते समय किसी भी बहाव आवेदन के लिए मौलिक है ।
वहां प्रक्रिया के कुछ महत्वपूर्ण कदम है कि सफलता का निर्धारण कर रहे हैं । पहले, पोर्टल नस के भीतर कैथेटर टिप के स्थान सही होना चाहिए । यदि जिगर के अंदर बहुत दूर रखा है, केवल मामूली पालियों perfused किया जाएगा । टिप बस पोर्टल नस की दाईं और बाईं शाखाओं के नीचे होना चाहिए । एक सुई पर एक बहुलक मिश्रित कैथेटर का उपयोग करने का लाभ यह है कि सुई का कंटिया अधिक एक कैथेटर से छिड़काव के दौरान नस आंसू की संभावना है । दूसरा, collagenase गुणवत्ता और मात्रा जिगर के पाचन क्षमता निर्धारित करते हैं । इस प्रक्रिया में, पूर्व-योग्य collagenase प्रकार 4 का उपयोग किया गया था और यह ०.५ मिलीग्राम/एमएल पर बफ़र 2 में reसस्पैंड है यदि collagenase गतिविधि को परख किया जा करने के लिए ९०० IU से अधिक है ।
collagenase छिड़काव के अंत में, जिगर भूरे रंग के लिए एक कुछ अंधेरे तन को बनाए रखने चाहिए । अगर यह हल् के स् तन का रंग है, तो सबसे ज् यादा हेपैटोसाइट्स हैं । जिगर के अलावा गिरने होना चाहिए जब माउस से काट । सबसे अच्छी स्थिति में, जिगर एक छोटी चंमच के साथ माउस के शरीर गुहा के बाहर स्कूप किया जा सकता है । इस हालत में जिगर हमेशा बहुत उच्च कोशिका व्यवहार्यता दे । यदि यह बहुत प्रयास करने के लिए कोशिकाओं को मिलाने के अलावा, अगर जिगर निष्कर्षण के दौरान अभी भी फर्म है, या अगर वहां बल का एक बहुत फिल्टर के माध्यम से हेपैटोसाइट्स कदम की आवश्यकता है, तो हेपैटोसाइट्स एक कम व्यवहार्यता होगा लेता है । हेपैटोसाइट्स microvilli के साथ कवर कर रहे हैं, जो उंहें एक बहुत ही उच्च सतह क्षेत्र (चित्र 10) के लिए अनुमति देता है । अपूर्ण पाचन हेपैटोसाइट्स के बीच सेल सेल जंक्शनों को बरकरार रखती है, और यांत्रिक बाल काटना प्लाज्मा झिल्ली के अलावा आंसू होगा । collagenase के साथ छिड़काव में सीटू के लिए अलग कोशिकाओं को तोड़ने और उच्च व्यवहार्यता बनाए रखने के लिए सबसे अच्छा तरीका है । चित्रा 11में, दो hepatocyte तैयारी की है जिसमें सेल छर्रों की तुलना में कुछ धुल के बाद किया गया है 1 बफर । बाईं तरफ गोली हल्का है और के बारे में ५०% की एक कोशिका व्यवहार्यता शामिल है । सही पर गोली गहरा है और ९२% की व्यवहार्यता है । इसी तरह, जब तरल ५० मिलीलीटर शंकु से डाला जाता है, गहरा गोली ट्यूब के भीतर स्थिर है, लाइटर गोली है, जो ट्यूब में के रूप में तरल बंद डाला जाता है के लिए होगा के विपरीत । लोअर सेल व्यवहार्यता या अक्षम perfusions हो सकता है जब जिगर स्केलेरोसिस के उच्च स्तर है ।
के बाद से जीना हेपैटोसाइट्स मृत हेपैटोसाइट्स की तुलना में एक उच्च घनत्व है, केंद्रापसारक प्रक्रियाओं एक तैयारी है कि व्यवहार्य हेपैटोसाइट्स15में अत्यधिक शुद्ध है में परिणाम होगा । यदि मृत हेपैटोसाइट्स की एक महत्वपूर्ण राशि है (जो अक्सर होता है जब स्थितियां इष्टतम हैं), जीवित कोशिकाओं को और समृद्ध और PVP ढाल का उपयोग मृत कोशिकाओं से अलग हो सकता है । इसके अतिरिक्त, के बाद से जीना हेपैटोसाइट्स गोली मरे हेपैटोसाइट्स, गोली के ऊपर 3rd की आकांक्षा से तेजी से भी गोली में मृत कोशिकाओं को जीने के अनुपात में वृद्धि होगी । इन प्रक्रियाओं को त्वरित और आसान तरीके है मृत हेपैटोसाइट्स और सेल मलबे से जीना अलग जब10,16की जरूरत है । यह विशेष रूप से उपयोगी है अगर नमूना कीमती है, और केवल कुछ लाख कोशिकाओं के प्रयोग के लिए आवश्यक हैं ।
अंत में, इस जिगर से कटाई हेपैटोसाइट्स और सेकेंड के लिए एक आसान और कारगर तरीका है । वर्तमान कीमतों पर, सभी रिएजेंट और प्रयोज्यता सहित इस प्रक्रिया के प्रदर्शन की लागत ७५ USD प्रति तैयारी के तहत है । यदि एकाधिक चूहों वांछित हैं, यह सबसे अच्छा है hepatocyte शुद्धि के साथ आगे बढ़ना और बर्फ पर एनपीसी अंश रखने जब तक सभी चूहों को संसाधित किया गया है । NPCs आम तौर पर बर्फ पर स्थिर है कम से 5 घंटे के लिए, लेकिन लंबे समय तक इस प्रयोगशाला में परीक्षण नहीं किया गया है ।
Disclosures
लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।
Acknowledgments
अनुदान R01HL130864 से NIH द्वारा भाग में अनुदान प्रदान किया जाता है ।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 L Erlenmeyer flask | Fisher Scientific | S63274 | |
| 250 mL Erlenmeyer flask | Fisher Scientific | S63271 | |
| silicone tubing | Cole-Parmer | 96400-14 | This tubing runs from the flasks through the pump to the T connector and then to the 1.0 mL syringe that is connected to the catheter. |
| Tygon tubing | Fisher Scientific | R3603 | Used as an adaptor between 96400-14 and pipettes and T connector. This may also be used for the oxygen tubing. |
| T-connectors | Cole-Parmer | EW-06294-82 | |
| Quick dissconnects | Fisher Scientific | 6150-0010 | |
| Pinch Clamps | Fisher Scientific | 6165-0002 | |
| Masterflex L/S Variable speed Pump, model 7553-70 | Cole-Parmer | EW-07559-00 | Periplastic pump with variable speed |
| Pump head, model 7014-20 | Cole-Parmer | EW-07014-20 | |
| glass graduated 1.0 mL pipettes | Fisher Scientific | 13-678 | |
| curved non-serrated scissors | Fine Science Tools | 14069-12 | |
| Dumont forceps | Fine Science Tools | 11252-20 | |
| Curved forceps | Fine Science Tools | 13009-12 | |
| 10 mL syringe | Fisher Scientific | 03-377-23 | Only barrel of syringe will be needed |
| sterlized spoon | Home supply store | ||
| Cotton ball(s) | Home supply store | ||
| Polyester sewing thread | Home supply store | ||
| Masking tape | Home supply store | ||
| thumb tacks | Home supply store | ||
| styrofoam pad | 50 mL conical rack | ||
| cookie/baking sheet | Home supply store | ||
| Absorbant underpads | Fisher Scientific | 14-206-64 | |
| 19 L water bath | Fisher Scientific | TSCOL19 | |
| BD Insyte Autogaurd Shielded IV Catheter 24 guage | Becton Dickinson | 381412 | Plastic cathetar with retractable needle |
| Crystallizing dishes 100x50 | VWR | 89000-290 | |
| Polystyrene petri dishes | Sigma Aldrich | P5481-500EA | |
| 50 mL conical tubes | Fisher Scientific | 12-565-270 | |
| graduated pipettes (5 mL) | Fisher Scientific | 170355 | |
| graduated pipettes (25 mL) | Fisher Scientific | 170357 | |
| EasyStrainer 100 μM | Greiner bio-one | 542000 | 100 μm filter |
| EasyStrainer 40 μM | Greiner bio-one | 542040 | 40μm filter |
| Sterile transfer pipettes | Fisher Scientific | 13-711-20 | |
| Refrigerated swinging bucket centrifuge | Sorvall Legend XTR | 75-217-406 | Centrifuge with swinging bucket rotar |
| Galaxy 170R tissue culture incubator | Eppendorf | CO170R-120-0000 | Humidified tissue culture incubator |
| Reagents | |||
| Name | Compound | Grams (g/L) | Millimolar (mM) |
| Buffer 1, pH 7.4 | NaCl | 8.3 | 142 |
| KCl | 0.5 | 6.7 | |
| HEPES | 2.4 | 10 | |
| BSA | 15 | 0.226 | |
| Buffer 2, pH 7.4 | NaCl | 3.9 | 66.74 |
| KCl | 0.5 | 6.71 | |
| CaCl2 | 0.7 | 6.31 | |
| HEPES | 24 | 100 | |
| BSA | 15 | 0.226 | |
| Phenol Red | 0.01 | 0.03 | |
| Buffer 3, pH 7.4 | NaCl | 8 | 137 |
| KCl | 0.35 | 4.7 | |
| MgSO4 | 0.08 | 0.66 | |
| CaCl2 | 0.18 | 1.62 | |
| HEPES | 2.4 | 10 | |
| BSA | 15 | 0.226 | |
| PBS, pH 7.4 | NaCl | 8 | 137 |
| KCl | 0.2 | 2.7 | |
| Na2HPO4-7H2O | 1.15 | 4.3 | |
| KH2PO4 | 0.2 | 1.4 | |
| Other reagents | |||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Percoll (PVP solution) | GE Healthcare | 288555 | |
| Collagenase Type IV | Sigma Aldrich | C5138 | |
| Isoflurane | Abcam | ab144581 | |
| Hepatocyte Growth Medium | |||
| DMEM | Gibco | 11965118 | |
| 10% by volume fetal bovine serum | Gibco | 10437010 | |
| Pen/Strep (2x) | Gibco | 15140148 | |
| Long-term Hepatocyte Growth Medium | |||
| DMEM | |||
| 10% by volume fetal bovine serum | Gibco | 10437010 | |
| Pen/Strep (2x) | Gibco | 15140148 | |
| Glucagon | Sigma | G3157-2mg | 14 ng/mL |
| Insulin | Sigma | I9278-5mL | 0.5 U/mL |
| Hydrocortisone | Sigma | H0888-1g | 7.5 mg/mL |
| Epidermal Growth Factor | BD Biosciences | 354001-100ug | 20 ng/mL |
| LSEC medium | |||
| RPMI | Gibco | 11875119 | |
| 10% by volume fetal bovine serum | Gibco | 10437010 | |
| Pen/Strep (2x) | Gibco | 15140148 |
References
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