Summary
Le but du présent protocole est d’obtenir la grande viabilité et à haut rendement des hépatocytes et des cellules endothéliales sinusoïdales du foie. Ceci est accompli en perfusant le foie avec une solution de collagènase de type IV via la veine porte, suivie d’une centrifugation différentielle afin d’obtenir des hépatocytes et des cellules endothéliales sinusoïdales.
Abstract
Ce protocole présente une méthode permettant d’obtenir un rendement élevé et la viabilité des hépatocytes de souris et les cellules endothéliales sinusoïdales (SECs) appropriés pour la culture ou pour l’obtention de lysats cellulaires. Dans ce protocole, la veine porte est utilisée comme le site de cathétérisme, plutôt que de la veine cave, car cela limite la contamination des autres types de cellules possible dans la préparation finale du foie. Aucune instrumentation spéciale n’est requise pendant toute la procédure. Un bain d’eau est utilisé comme une source de chaleur pour maintenir la température de tous les tampons et solutions. Une pompe péristaltique standard est utilisée pour exciter le fluide, et une centrifugeuse plateau de table est nécessaire pour les procédures de centrifugation. La seule limitation de cette technique est la mise en place du cathéter dans la veine porte, qui est difficile sur certaines des souris dans la gamme de taille de 18 à 25 g. Un avantage de cette technique est que qu’une veine est utilisée pour la perfusion et l’accès à la veine est rapide, ce qui minimise l’ischémie et reperfusion du foie qui réduit la viabilité des cellules hépatiques. Un autre avantage de ce protocole est qu’il est facile de distinguer direct des hépatocytes morts en vue en raison de la différence de densité cellulaire au cours des étapes de centrifugation. Les cellules de ce protocole peuvent être utilisés en culture cellulaire pour n’importe quelle application en aval ainsi que transformées pour toute évaluation biochimique.
Introduction
La perfusion du foie pour obtenir des hépatocytes collagénase a été effectuée depuis le début des années 1950 et a été continuellement améliorée1,2,3,4. Une très belle revue d’un grand nombre des méthodes, techniques et des réactifs utilisés dans la purification de cellules hépatiques a été compilée en Meyer et al.5. Il est techniquement difficile d’obtenir un rendement satisfaisant des hépatocytes très viables et SECs. Les forces mécaniques séparent les cellules dont la qualité de la collagénase sont certaines des variables qui sont difficiles à contrôler. En raison de la sensibilité d’hépatocytes aux forces mécaniques, leur viabilité est considérablement réduite dans des conditions sous-optimales, incitant la nécessité d’un protocole décrivant les conditions optimales pour l’isolation. SECs ne semblent ne pas être aussi sensibles au cisaillement mécanique. La perfusion in situ à la digestion de collagénase est de loin la meilleure méthode pour perturber les jonctions des cellules afin d’obtenir des préparations unicellulaire de foie et autres organes tels que l’intestin et la rate6. Ce protocole illustre une méthode simple pour introduire le tampon de perfusion dans la veine porte en utilisant un cathéter en plastique rétractable, plutôt qu’une incision qui pourrait causer la veine s’effondrer, comme décrit dans Smedsrød et al.7.
L’objectif de ce manuscrit est pour montrer les étapes plus critiques nécessaires pour réussir dans la procédure de la profusion du foie. Ces mesures comprennent la placement de cathéter, écoulement des liquides de perfusion et traitement du tissu après la digestion. Les débits sont ajustées au-dessus du taux naturel de la circulation sanguine, mais suffisamment faible pour préserver la capsule de la Glisson. Une fois que le foie est correctement digéré et les cellules sont séparées en solution, purification de cellules est relativement simple si elle est réalisée par centrifugation différentielle, adhérence de la plaque, ou purification de billes magnétiques. Hépatocytes vivants ont une densité plus élevée et sont facilement purifiés des cellules parenchymateuses (PNJ) et des hépatocytes morts avec centrifugation à vitesse lente. Pour la plupart des applications, adhérence de la plaque de séparation Kupffer cellules (KCs) et SECs est une commune de la méthode8, mais on signale qu’il ne produit pas la meilleure pureté des SECs9. KCs ont tendance à adhérer à des surfaces solides rigides rapidement et boîtes de Pétri (standard polystyrène) sont le matériau le plus couramment utilisé pour cette procédure. SEC ou KC purification avec l’utilisation de billes magnétiques anticorps conjugué est sans aucun doute la meilleure méthode pour la purification significative de ces cellules, bien que la procédure ajoute un autre 3-4 h sur ce protocole et le rendement global est une diminution de9. Ce rapport montre en détail le processus pour une perfusion hépatique optimale qui entraîne généralement un grand nombre de cellules viables.
Protocol
Toutes les procédures animaux décrits dans le présent protocole ont été approuvés par l’animalier institutionnel et utilisation Comité (IACUC) à l’Université de Lincoln - Nebraska sous protocole #1435.
1. préparation
- Préparation de solutions et de milieux de culture
- Préparer tous les milieux de culture et tampon selon la Table des matières.
- Préparation des instruments
- Mettre en place un bain d’eau (> 10 L) à 42 ° C, une pompe péristaltique avec vitesse variable et pinces pour tenir les fioles. Préparer la courbe ciseaux et pinces (Figure 1).
- Sur ou à proximité de l’eau du bain, mettre en place une plaque de cuisson (environ 38 x 26 cm) avec un tampon de mousse de polystyrène (support conique de 50 mL), recouverte d’une alèse absorbante découper un morceau de 20 x 20 cm (Figure 1).
- Placez un morceau de ruban adhésif (5-8 cm) à proximité. Place un fil à coudre polyester 20 cm à proximité qui est coupé et prêt à utiliser. Obtenir un cathéter en plastique avec une aiguille rétractable (7 mm x 19 mm, Figure 1).
- Préparation de la verrerie
- À l’aide de colliers de serrage, placez et immobiliser une fiole de 1 L dans l’eau du bain contenant 200 mL de solution de 1 PBS x avec un bouchon qui a deux pipettes de 1 mL, entrer dans la solution. Le bouchon en caoutchouc est cranté pour permettre la recirculation de fluide dans un circuit fermé.
- Avec une autre pince, placer un flacon de 125 mL contenant 45 mL de tampon de 2 avec un bouchon qui a deux pipettes de 1 mL, un dont est dans le liquide vers le bas de la fiole et l’autre qui reste au-dessus du liquide et souffle d’oxygène dans le flacon.
NOTE : Chaque pipette dans les bouchons auront un rapide débrancher l’adaptateur attaché à l’extrémité pour la commutation facile du tube. L’oxygène va être courante dans les deux fioles via la pipette dans le bouchon qui n’est pas immergé dans le liquide. - Mettre de côté deux plats de cristallisation stériles.
2. animal procédure
- Réchauffer les solutions PBS et tampon de 2 à 42 ° C dans un bain-marie et faire circuler de PBS pendant au moins 20 mL/min dans la tuyauterie en circuit fermé pour garder les lignes de liquides chaud. Plongez tout excès tube dans le bain d’eau de rester aussi près que possible à 42 ° C. Égoutter l’extrémité mâle du tube dans le PBS contenant de flacon de 1 L.
- Placer une boule de coton sur l’alèse absorbante et ajouter environ 2 mL de 30 % isoflurane (composé en polyéthylène glycol 200, ce qui diminue le taux d’évaporation d’isoflurane) sur la boule de coton à l’aide d’une pipette de transfert.
- Soulevez la souris par la queue, placez-le dans le plat de cristallisation et puis rapidement renverser le plat sur la boule de coton pour que la souris a un petit espace dans lequel d’inhaler de l’anesthésie. Respecter le rythme de la respiration de la souris, puis assurez-vous que la souris est effectivement sous anesthésie.
Remarque : Le rythme de la respiration doit être plus lente et plus profonde, la queue flasque et les pattes qui ne répondent plus pour le test du pincement sous anesthésie ; Voir lignes directrices IACUC pour plus de détails. - Alors que la souris se passe sous anesthésie (cela prend 1-2 min), préparer le Canon d’une seringue de 10 mL en tirant sur le piston et en insérant un petit tampon d’ouate. Ajouter 1 à 2 mL d’isoflurane 30 % avec une pipette de transfert à la boule de coton à l’intérieur du canon et placer le Canon plate vers le bas sur une table pendant que vous attendez d’une attitude inconsciente de la souris.
- Rapidement enlever le plat cristallisant, retourner la souris sur le dos et placez la seringue sur son nez. Revérifiez le rythme de la respiration, pincement de l’orteil et la queue flasque. Toutes les réponses pour le pincement de l’orteil et la queue flasque indique que la souris n’est pas complètement sous anesthésie. Conserver la seringue sur le museau pour maintenir la perte de conscience.
- Place des punaises dans les pattes de la souris, avec les membres tendus en décubitus dorsal. Mouillez l’abdomen et la cage thoracique avec alcool isopropylique 70 % ou l’éthanol.
- Avec la pince droite dans une main, soulevez la peau près de la base de l’abdomen. Avec des ciseaux dans l’autre main, couper la peau tente et le péritoine. L’incision doit être horizontale ou sur la base de la peau de tente. N’oubliez pas de couper à travers toutes les couches de la peau et le péritoine pour accéder à l’intestin. Coupez latéralement autour de l’abdomen jusqu'à la cage thoracique des deux côtés sans entaille tout organe.
- Couper le lambeau de peau en coupant à travers la cage thoracique inférieure. Déplacer les intestins vers la droite avec le dos de la pince pour exposer la veine porte.
NOTE : Saignement de l’animal devrait être minime ; l’animal doit toujours être respirant et sous anesthésie profonde. - Placer la pince courbe fermée sous la veine porte entre le foie et la veine pancréatico-duodénale supérieure (flèche de laFigure 3 ).
- Ouvrez la pince tout en dessous de la veine porte. Saisissez le fil et tirez soigneusement à travers afin qu’elle soit centrée au-dessous de la veine porte. Attacher un noeud autour de la veine porte sans moulants il vers le bas.
- Placer la pince courbée sous la veine porte et tirer doucement vers la queue de la souris pour redresser la veine (Figure 4A).
- Une fois le cathéter dans l’autre main, placez le biseau de l’aiguille face vers le haut et parallèle à la partie inférieure de la veine porte près de la pince (Figure 4B).
- Percer délicatement la veine avec l’aiguille (Figure 4C). Assurez-vous que le biseau de l’aiguille est dans la lumière de la veine. Rétracter l’aiguille à ressort et continuer à pousser le cathéter de polymère dans la veine, jusqu'à ce que le biseau est proche du quartier ramifié veineux. C’est dans le foie. Si le cathéter est placé correctement, un reflux de sang seront visible. (Figure 4D).
- Serrer le noeud et tirez-le vers le bas sur le cathéter pour aider à stabiliser. Immédiatement, baissez la vitesse de la pompe de 20 mL/min à 4 mL/min et couper un autre vaisseau sanguin majeur pour le drainage. Couper l’abdominalis aorte pour des résultats optimaux.
- Placez l’extrémité mâle du tube à l’extrémité femelle du cathéter (Figure 5A). S’assurer qu’il n’y a pas de bulles d’air dans la ligne. Veillez à ce que le cathéter n’est pas non plus poussé au niveau du foie ou de la veine. Placement du fil n’est pas essentiel, mais il aide à prévenir le reflux de la veine et permet de maintenir le cathéter dans la bonne position (Figure 5B, C).
- Utilisez du ruban pour immobiliser le tuyau sur l’alèse. Utiliser la pince droite à serrer l’effluent vaisseau sanguin pour gonfler le foie plusieurs fois pour s’assurer que tout le sang est drainé (Figure 5D).
NOTE : Bande de laboratoire Standard peut-être ne pas fonctionner ; Cependant, du ruban reste coincé à l’alèse, même dans des conditions humides.
3. foie Perfusion
- Alors que le foie est rinçage à PBS, mesurer environ 24 mg de collagénase de Type IV et l’introduire dans la fiole contenant 45 mL de tampon de 2 dans le bain d’eau. N’oubliez pas d’agiter le liquide dans le vase afin que la collagénase est entièrement dissous et placer le ballon dans la pince afin que la fraction liquide contenant du ballon est complètement submergée dans l’eau.
- Observez le changement de couleur du foie il est rincé avec du PBS. Changer le tuyau de sortie du flacon de 1 L pour le flacon de 125 mL. Ne pas laisser de bulles d’air à s’écouler dans le foie.
- Une fois que le tampon de perfusion atteint le foie, brièvement squeeze serré le vaisseau sanguin effluent développer une pression à l’intérieur du navire et de laisser ce liquide remplir tous les lobes du foie. Être sûr de ne pas couper de drainage trop longtemps, car qui pourrait éclater le mince tissu conjonctif qui entoure le foie (capsule de Glisson) et détruire la perfusion ou du débit de liquide dans le lit capillaire du foie.
- Laisser 2 tampon avec la collagénase à perfuse par le foie jusqu'à ce que tous les 45 mL ont coulé à travers le tissu.
Remarque : En cas de succès, capsule de la Glisson doit être séparé par le parenchyme ou le tissu hépatique et le foie lui-même devrait apparaître amorphe. - Ajouter environ 10 mL de tampon de 1 à la cristallisation autre plat et placez-le à côté de la souris.
- Retirer le cathéter et arrêtez la pompe.
- Avec la droite pinces et ciseaux, couper le foie de la souris. Si la digestion de collagénase était très efficace, il peut être nécessaire d’avoir une cuillère propre et stérile sur la main pour ramasser le foie de la souris et le placer dans le tampon de 1.
4. Purification de l’hépatocyte
NOTE : La Manipulation des cellules sont effectuées sous une hotte de vitroplants stérile pour limiter la contamination si les cellules sont cultivées dans toutes les étapes subséquentes.
- Utilisant une technique stérile, saisir le foie avec une pince et secouez doucement les cellules du foie. Déchirer ou reculer la capsule de la Glisson : le tampon deviendra opaque que les cellules sont secouées par le foie.
- Décanter la solution de cellule dans une conique de 50 mL avec 100 µm filtre placé sur le dessus.
- Ajouter plus de mémoire tampon 1 aux restes du foie et continuer à secouer les cellules. Continuez jusqu'à ce que le foie apparaît dépourvu de cellules ou lorsque les parties non digérées du foie ne donnent pas plus les cellules.
- Verser le liquide cellulaire dans une autre de 50 mL conique contenant un filtre à 40 µm.
- Centrifuger conique dans un rotor oscillant de seau à 100 x g pendant 3 min.
Remarque : N’utilisez pas le frein maximum comme cela peut déloger le culot cellulaire. Utilisez le frein à 80 %, ce qui suffit pour toutes les autres étapes de centrifugation à 4 ° C - Décanter le liquide surnageant (qui contient des PNJ et des hépatocytes morts) dans une propre conique et placez-le sur la glace. S’assurer que cela se fait en un seul mouvement pour observer le respect des granulés.
- Resuspendre le culot dans 40 mL de tampon de 1. Répétez les étapes 4.5 et 4.6. Resuspendre le culot dans 40 mL de tampon de 3. Répétez les étapes 4.5 et 4.6 deux fois.
- Remettre en suspension les hépatocytes purifiées à chaud DMEM + 10 % BF + 2 x la pénicilline-streptomycine (Pen/Strep).
- Si les cellules sont cultivées sur des plaques de collagène enduit, permettez-leur de respecter pendant 1 h et remplacer les médias au moins une fois car cela empêchera toute naissantes contaminants bactériens.
- Rendre les plaques de collagène recouvert en incubant eux avec le collagène de 0,05 % à 0,001 % d’acide acétique pendant au moins 1 h à 37 ° C et laver ensuite avec du PBS 1 x.
- Si la viabilité de l’hépatocyte est faible et il y a un désir d’obtenir des hépatocytes viables haute purifiés puis utilisez le protocole suivant, adapté de Kreamer et al.10.
- Mélanger 9 volumes de la solution PVP (Percoll, une solution de p/p de 23 % de l’eau et de particules de silice colloïdale 15 à 30 nm recouvert de polyvinylpyrrolidone pour la centrifugation de densité) et 1 volume de 10 x HBSS pour faire une solution iso-osmotique de PVP (SIP).
- Ajouter 24 mL de SIP dans un stérile 50 mL conique qui peut être stocké dans ces conditions pendant 2 mois à 4 ° C.
- Ajuster la concentration d’hépatocytes à 5-10 × 106 cellules/mL avec milieu de culture tel que celui noté à l’étape 4,8.
- Ajouter 25 mL de suspension cellulaire à chaque 24 mL SIP contenant conique et mélanger doucement par retournements. La densité de cette solution est de 1,06 g/mL.
- Centrifuger conique à 50 x g pendant 10 min à 4 ° C.
- Aspirer le SIP et le floculant et remettre en suspension les cellules HBSS.
- Laver les cellules par centrifugation à 50 x g pendant 10 min à 4 ° C.
- Répétez l’étape 4.10.6 une fois de plus et puis remettre en suspension les cellules dans un milieu de croissance.
5. SEC Purification
- Les cellules dans les surnageants de l’étape de 4,6 à pellets en faisant tourner les tubes à 163 x g pendant 10 min. Jetez les surnageants des tubes et tous les granulés de la cellule de resuspendre dans 5 mL de RPMI sans sérum et les regrouper dans un seul tube.
- Une fois toutes les boulettes ont été mis en commun, ajoute RPMI pour un volume final de 35 mL.
- Centrifuger le pool conique à 25 g pour 3 min. aspirer soigneusement le haut de la page 25 mL de RPMI avec une pipette 25 mL et place ce média contenant des PNJs dans une propre 50 mL conique sur la glace.
- Ajouter 25 mL de RPMI frais vers le tube et Resuspendre le culot.
- Répétez l’étape 5.3 pour un second lavage et piscine le surnageant. Jeter le reste 10 mL de médias et pellet (le culot se compose principalement d’hépatocytes morts). Centrifuger le surnageant regroupé à 163 x g pendant 10 min.
- Au cours de la centrifugation, préparer les gradients de solution PVP dans un 50 mL conique.
- Ajouter 15 mL de solution PVP de 50 % pour les 50 mL conique puis 20 mL de 25 % Percoll superposé avec une pipette à régler à la vitesse la plus lente d’éjection. Veillez à respecter une ligne de réfraction à la marque de 15 mL qui délimite les deux couches, car c’est où le SECs et KCs regroupera après la centrifugation.
- Remettre en suspension les cellules précédemment granulées dans étape 5.5 dans 10 mL de RPMI froid et tu les couvriras sur le gradient de solution PVP. Veillez à maintenir une ligne de démarcation claire entre les deux couches. Centrifuger le gradient à 805 x g pendant 20 min avec un frein réglé à 50 %.
- Aspirer de haut en bas la direction de la marque sur le tube de 20 mL et de jeter ce matériel. Avec une pipette de 5 mL, recueillir les SECs et KCs qui sont situés à l’interface de 25/50 %. Jeter tout amas bruns des cellules car ce sont les hépatocytes morts.
- Mettre les cellules dans un 50 mL conique et RPMI jusqu’au repère de 50 mL à diluer la solution de PVP. Centrifuger à 200 x g pendant 10 min, avec frein à 80 %.
- Aspirer et éliminer le surnageant et Resuspendre le culot en lavant hors du cône de la conique dans 12 mL de RPMI chaud.
- Séparer les SECs de KCs en plaçant le surnageant dans un polystyrène boîte de Pétri et incuber dans un incubateur de culture de tissu humidifié pendant 8 min à température ambiante.
- Aspirer les médias avec une pipette 25 mL et rincer la plaque avec le même média, avec la pipette fixé à la vitesse la plus basse pour recueillir les restants SECs tout en les KCs adhère à la plaque.
- Centrifuger les SECs à 200 x g pendant 10 min et resuspendre dans RPMI + 5 % BF + stylo/Strep. Puis le titre les cellules et place dans Pétri recouvertes de collagène.
Representative Results
Démonstration et raffinée pour perfusion hépatique et purification/enrichissement des hépatocytes et SECs est présente ici une méthode qui fournit des conseils détaillés pour cellule optimale purification/enrichissement semblable à d’autres rapports imprimés compilées dans ce référencé révision 5. Les étapes critiques qui déterminent le succès pour la purification cellulaire se produisent dans l’itinéraire et les détails techniques de la procédure de perfusion de collagénase et sont décrites dans le présent protocole. L’installation de l’appareil est assez simple et rentable avec le matériel de laboratoire standard, contrairement aux autres systèmes qui ont été publiées11 (Figure 1). Dans cette configuration, le plateau maintenant la souris est assis sur le bain-marie avec certains de la tubulure excédentaire dans le bain d’eau pour maintenir la température des liquides perfusant dans le foie. L’appareil comme indiqué ici peut servir de souris ainsi que des rats, avec une géométrie légèrement différente pour perfusion hépatique de rat12 (Figure 2).
Dans cette procédure, le foie est perfusé par la veine au lieu de la veine cave (qui est une autre voie de perfusion populaire) en raison de sa facilité d’accès à l’intérieur de l’abdomen et que la veine se nourrit directement dans le foie. Le spectateur doit être conscient que la veine a plusieurs petites branches qui peuvent court-circuiter le perfusat, et le cathéter doit être placé devant ces branches pour des résultats optimaux13 (Figure 3). Une fois identifiée, la veine porte pinces courbées sont utilisées pour dessiner une suture chirurgicale ou un fil de polyester sous la veine porte entre le foie et la veine pancréatique-duodénale supérieure. Les pinces sont également utilisés pour redresser la veine porte qui se trouve sous la pression de sang positive (Figure 4A). L’aiguille dans le cathéter doit être placé parallèlement et à côté de la veine (Figure 4B) et le biseau doit être inséré doucement à la lumière de la veine (Figure 4C). Un placement correct s’accompagnera de sang apparaissent le long de la sonde. Une fois que l’aiguille est retirée, le cathéter doit être stabilisé avec un fil attaché à elle et la tension artérielle forcera le sang vers le haut à travers le cathéter. Il est recommandé que le cathéter raccorder au tuyau de la pompe avant que les déversements de sang (Figure 4D). Une fois que le tuyau de la pompe est connecté, provoquer la coupure immédiate un vaisseau sanguin majeur comme la cave ou l’aorte abdominalis pour drainage de sang/liquide (Figure 5A). Il est généralement nécessaire de couper le côté de la paroi abdominale de la souris pour un drainage suffisant, car une accumulation de sang dans l’abdomen, il est difficile de visualiser le processus de la perfusion, et sang peut reporter dans la purification de cellules (Figure 5 B). une fois que le PBS commence à perfuse le foie, le foie va blanchir avec l’absence de sang (Figure 5C). Si seulement quelques uns des lobes blanch, la cause probable est que le cathéter a été placé trop loin à l’intérieur du foie et devront être régularisées lentement. Une fois mise en place du cathéter est confirmée, utiliser le ruban résistant à l’eau pour fixer le tube en place. Bande de généraux en laboratoire n’est généralement pas suffisant. Pour confirmer le bon positionnement du cathéter, comprimer le vaisseaux sanguins coupé pour cesser de drainage et d’observer l’augmentation de la pression dans le foie. Cela facilite le rinçage sang hors du foie (Figure 5D). Cela devrait également être fait lorsque la solution de collagénase est initialement placé dans le foie pour s’assurer que tous les lobes sont exposés à la collagénase. Après la collagénase solution s’écoule, une digestion de collagénase bon est indicative par séparation de la capsule de la Glisson le parenchyme.
La procédure générale pour la purification cellulaire est décrite à la Figure 6 et Figure 7 dans lequel les hépatocytes sont récoltées dès le début dans la procédure au cours de la basse vitesse tourne et sont très pur après que 4 lavages dans des tampons contenant du BSA (Figure 8 ). SECs sont co purifiés avec KCs sur un gradient PVP (Figure 9A) et puis séparés par adhérence sélective sur un polystyrène enduit de collagène boîte de Pétri. La pureté de la sec à l’aide de cette méthode est de 83 à 90 % pur et dépend largement de l’efficacité globale de la digestion de collagénase (Figure 9B). Des mesures quantitatives, en utilisant la lumière microscopie (comme les hépatocytes et SECs ont des caractéristiques distinctives d’autres cellules) montrent que dans une préparation représentative, les hépatocytes sont près de 100 % pure et SECs sont un peu plus de 89 % pur (tableau 1). Alternativement, un enrichissement supérieur de SECs peut-être être obtenu par séparation magnétique colonne après le gradient PVP, mais ce n’est pas dans le cadre du présent protocole. On trouvera plus d’informations sur la séparation magnétique de SECs et KCs dans Meyer et al. 9 et Liu et al. 14 il convient de rappeler que la viabilité des hépatocytes diminue rapidement dans un foie mal digéré, mais ce n’est pas vrai nécessaire pour les PNJs. foies insuffisamment digérés produisent également des débris plus cellulaires, ce qui ne sont pas entièrement éliminés lors des étapes de centrifugation.
Figure 1 : Représentation schématique de la suite de la perfusion. Les flacons sont maintenus en place par des colliers (non représentés) ; les tubes contenant le liquide est échangé du flacon de 1L pour le flacon de 125 mL au cours de la procédure sont représenté par la ligne pointillée rouge. Notez que le flux d’oxygène ne pas bulle directement dans les solutions dans les fioles. Les bouchons devraient également être crantés pour permettre un écoulement de fluide de circuit fermé avec le tube inséré dans l’entaille. Ceci est crucial au cours de l’échauffement du tube et d’éjection de l’air dans le tube. La purge d’air se compose du connecteur en T qui est connecté au tuyau Tygon et pinces pour open rapide et fermeture du système. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : La suite de perfusion durant la perfusion du foie de souris. Le plateau avec la souris est placé sur le coin de l’eau du bain. L’oxygène est déconnecté de la solution de collagènase comme qui a été déjà oxygénée pendant l’échauffement. Emplacement des éléments sont l’oxygène A) lignes, fiole B) 1 litre contenant du PBS, flacon C) 125 mL contenant un tampon 2 avec pompe D), contrôles E) pompe, F) barboteur, collagénase, ligne G) fluide de la fiole, par l’intermédiaire de la pompe et à la souris. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : Image du système vasculaire de l’abdomen de la souris. Insertion du cathéter doit être juste en dessous de la jonction de la veine gastrique et pancréatique se détacher de la veine porte (point vert) et la pointe devrait être placée près les veines de portail hépatiques droite et gauche (points jaunes) qui forme une fourche dans le lobe principal du foie. Une fois le placement correct est atteint, le cathéter devrait être stabilisé avec thread à l’aide d’un nœud simple. K = rein, L = foie, TR = intestin grêle. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 4 : Placement de cathéter dans la veine porte. (A) le forceps sont utilisé pour assurer l’engorgement de sang de la veine porte et redresser la veine pour le placement de cathéter. (B) le cathéter est aligné parallèlement à la veine porte avec le biseau vers le haut. (C), le biseau de l’aiguille dans le cathéter est inséré dans la veine, pas par l’intermédiaire de la veine. (D), l’aiguille du cathéter est rétracté et sang sera reflux par le cathéter, comme indiqué par la pointe de la pince. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 5 : Bonne perfusion hépatique. (A) après que le placement de cathéter, l’extrémité femelle du raccord Luer du cathéter se connecte à l’extrémité de Luer mâle (coupe d’une seringue de 1 mL) de la tubulure de la pompe. (B) après une coupe des grands vaisseaux décroissant, sang et PBS sont drainés de l’abdomen par tranchage du côté des souris avec des ciseaux. (C) le foie doit blanchir alors que le sang est débusqué et (D) vont gonfler sous pression de fermeture comprimant le vaisseaux sanguins coupé avec une pince. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 6 : Ébauche de plan de purification de l’hépatocyte et isolement NPC. La plupart des étapes de centrifugation vise à supprimer les hépatocytes vivants et morts des cellules non parenchymateuses. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 7 : Ébauche de plan d’enrichissement de SEC et de purification. PNJs sont séparés par le gradient PVP suivi par séparation SEC court adhérence à une plaque de polystyrène standard. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 8 : Purifié hépatocytes. Hépatocytes ont été plaqués sur des plaques de culture de tissu collagène enduit avec DMEM + 8 % BF + stylo/Strep et incubées durant 6 h, suivie de la collection d’images par un microscope à 400 X. Bar équivaut à 20 µm. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 9 : Purification de s. (A) SECs et KCs ont été capturés dans l’interface PVP de 25/50 % (flèches jaunes) et lavé avec un milieu sans sérum. (B) The SECs ont été séparés des KCs par adhérence sélective sur des plats de Pétri standard, lavés et plaqués sur la culture de tissu enduit de collagène vaisselle RPMI + 5 % FBS. Des images ont été prises par un microscope inversé de EVOS à 400 X. Bar équivaut à 20 µm. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 10 : Microscopie électronique de l’anatomie du foie de souris. Un foie de souris a été perfusé avec du PBS suivie de fixateur (cacodylate de sodium 100 mM, glutaraldéhyde 25 % 12 mL, 15,6 mL de paraformaldéhyde à 16 %, chlorure de calcium de 2,65 mM, mM 180,2 sucrose, mélangés dans 100 mL de solution) à raison de 1 mL/min pendant 4 min. tissus ont été tranchés et préparé pour la microscopie électronique à balayage. Des images ont été prélevés sur une émission de champ SEM à 10, 000 X. Flèches jaunes indiquent les microvillosités entre les hépatocytes. Bar équivaut à 5 µm. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 11 : Visualisation des morts-vivants hépatocytes. Après que 2 lavages avec 1 tampon, hépatocytes granulés peuvent être évalués pour vivre/morts ratio par oeil. Un projectile plus léger (à gauche) indique qu’au moins la moitié les hépatocytes sont morts. Le culot plus sombre sur la droite est granulée plus fermement vers le bas du tube, et est plus de 90 % vivent. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
| Tableau 1 : Purification de cellules | ||
| Type de cellule | cellules cibles % | % autres cellules |
| Hépatocytes | 99 | 1 |
| Sinsusoidal cellules endothéliales | 89,1 | 10,9 |
Tableau 1 : Évaluation de la pureté de la cellule au microscope photonique.
Discussion
Ce protocole met en évidence les outils qui sont disponibles et qu’elle fournira à l’utilisateur un taux élevé de succès dans cette procédure. Une perfusion réussie est fondamentale pour n’importe quelle application en aval lorsque vous travaillez avec les cellules primaires.
Il y a quelques étapes critiques de la procédure qui déterminent le succès. Tout d’abord, le placement de l’extrémité du cathéter dans la veine doit être correcte. S’il est placé trop loin à l’intérieur du foie, seulement les lobes mineurs vont être perfusés. La pointe doit être juste en dessous des branches droite et gauche de la veine porte. L’avantage d’utiliser un cathéter de polymère composite sur une aiguille, c’est que l’ardillon de l’aiguille est plus susceptible de se déchirer la veine durant la perfusion à un cathéter. En second lieu, la qualité de la collagénase et la quantité déterminent l’efficacité de la digestion du foie. Dans cette procédure, préqualifié collagénase de Type 4 a été utilisé et il est resuspendu à 0,5 mg/mL dans le tampon de 2 si l’activité de la collagénase à doser est supérieure à 900 UI.
À la fin de la perfusion de collagénase, le foie devrait conserver un bronzage un peu sombre de couleur brune. Si c’est une couleur beige clair, la plupart des hépatocytes est morte. Le foie doit être tomber en morceaux découpés de la souris. Dans les meilleures conditions, le foie peut être creusé hors de la cavité du corps de la souris avec une petite cuillère. Les foies dans cet État donnent toujours la viabilité cellulaire très élevé. Si il faut beaucoup d’efforts pour secouer les cellules, si le foie est encore ferme pendant l’essorage, ou s’il y a beaucoup de force nécessaire pour déplacer les hépatocytes à travers les filtres, puis les hépatocytes aura une plus faible viabilité. Les hépatocytes sont recouverts de microvillosités, qui leur permet d’avoir une surface très importante (Figure 10). Une digestion incomplète conserve jonctions cellule-cellule entre hépatocytes et cisaillement mécanique va déchirer la membrane plasmique. In situ une perfusion de collagénase est la meilleure méthode pour séparer les cellules et maintenir la viabilité élevée. Dans la Figure 11, deux hépatocytes préparatifs dans lequel la cellule pastilles ont été comparés après quelques lavages en 1 tampon. Le culot sur la gauche est plus léger et contient une viabilité cellulaire d’environ 50 %. Le culot sur le droit est plus foncé et a une viabilité de 92 %. De même, lorsque le liquide est versé de la conique de 50 mL, le culot plus sombre est à l’arrêt dans le tube, par contraste avec le culot plus léger, qui coulisse dans le tube car le liquide est coulé au large. La viabilité cellulaire inférieure ou perfusions inefficaces peuvent survenir lorsque le foie a des niveaux élevés de la sclérose en plaques.
Hépatocytes direct ayant une densité plus élevée que les hépatocytes morts, les procédures de centrifugation seront traduira par une préparation qui est très pure dans les hépatocytes viables15. S’il y a une quantité importante d’hépatocytes morts (ce qui se produit souvent lorsque les conditions sont sous-optimaux), direct des cellules peuvent être enrichis et séparés des cellules mortes l’utilisation de gradients PVP. En outre, étant donné que les hépatocytes direct pellet plus vite que les hépatocytes morts, aspiration supérieure 3rd de la pastille permettra également d’augmenter le rapport direct aux cellules mortes dans le culot. Ces procédures sont rapides et des méthodes faciles à séparer en direct d’hépatocytes morts et débris lorsque nécessaire de cellules10,16. Ceci est particulièrement utile si l’échantillon est précieux, et seulement quelques million de cellules est nécessaire pour l’expérience.
En conclusion, il s’agit d’une méthode simple et efficace pour la récolte des hépatocytes et SECs du foie. Aux prix actuels, le coût de l’exécution de cette procédure, y compris tous les réactifs et consommables est moins de 75 USD par préparation. Si vous désirez plusieurs souris, il est préférable de procéder à la purification de l’hépatocyte et garder la fraction NPC sur la glace jusqu'à ce que toutes les souris ont été traitées. PNJs sont généralement stables sur la glace pendant au moins 5 h, mais plus longs n’ont pas été testés dans notre laboratoire.
Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Financement est assuré en partie par le NIH de grant R01HL130864.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 L Erlenmeyer flask | Fisher Scientific | S63274 | |
| 250 mL Erlenmeyer flask | Fisher Scientific | S63271 | |
| silicone tubing | Cole-Parmer | 96400-14 | This tubing runs from the flasks through the pump to the T connector and then to the 1.0 mL syringe that is connected to the catheter. |
| Tygon tubing | Fisher Scientific | R3603 | Used as an adaptor between 96400-14 and pipettes and T connector. This may also be used for the oxygen tubing. |
| T-connectors | Cole-Parmer | EW-06294-82 | |
| Quick dissconnects | Fisher Scientific | 6150-0010 | |
| Pinch Clamps | Fisher Scientific | 6165-0002 | |
| Masterflex L/S Variable speed Pump, model 7553-70 | Cole-Parmer | EW-07559-00 | Periplastic pump with variable speed |
| Pump head, model 7014-20 | Cole-Parmer | EW-07014-20 | |
| glass graduated 1.0 mL pipettes | Fisher Scientific | 13-678 | |
| curved non-serrated scissors | Fine Science Tools | 14069-12 | |
| Dumont forceps | Fine Science Tools | 11252-20 | |
| Curved forceps | Fine Science Tools | 13009-12 | |
| 10 mL syringe | Fisher Scientific | 03-377-23 | Only barrel of syringe will be needed |
| sterlized spoon | Home supply store | ||
| Cotton ball(s) | Home supply store | ||
| Polyester sewing thread | Home supply store | ||
| Masking tape | Home supply store | ||
| thumb tacks | Home supply store | ||
| styrofoam pad | 50 mL conical rack | ||
| cookie/baking sheet | Home supply store | ||
| Absorbant underpads | Fisher Scientific | 14-206-64 | |
| 19 L water bath | Fisher Scientific | TSCOL19 | |
| BD Insyte Autogaurd Shielded IV Catheter 24 guage | Becton Dickinson | 381412 | Plastic cathetar with retractable needle |
| Crystallizing dishes 100x50 | VWR | 89000-290 | |
| Polystyrene petri dishes | Sigma Aldrich | P5481-500EA | |
| 50 mL conical tubes | Fisher Scientific | 12-565-270 | |
| graduated pipettes (5 mL) | Fisher Scientific | 170355 | |
| graduated pipettes (25 mL) | Fisher Scientific | 170357 | |
| EasyStrainer 100 μM | Greiner bio-one | 542000 | 100 μm filter |
| EasyStrainer 40 μM | Greiner bio-one | 542040 | 40μm filter |
| Sterile transfer pipettes | Fisher Scientific | 13-711-20 | |
| Refrigerated swinging bucket centrifuge | Sorvall Legend XTR | 75-217-406 | Centrifuge with swinging bucket rotar |
| Galaxy 170R tissue culture incubator | Eppendorf | CO170R-120-0000 | Humidified tissue culture incubator |
| Reagents | |||
| Name | Compound | Grams (g/L) | Millimolar (mM) |
| Buffer 1, pH 7.4 | NaCl | 8.3 | 142 |
| KCl | 0.5 | 6.7 | |
| HEPES | 2.4 | 10 | |
| BSA | 15 | 0.226 | |
| Buffer 2, pH 7.4 | NaCl | 3.9 | 66.74 |
| KCl | 0.5 | 6.71 | |
| CaCl2 | 0.7 | 6.31 | |
| HEPES | 24 | 100 | |
| BSA | 15 | 0.226 | |
| Phenol Red | 0.01 | 0.03 | |
| Buffer 3, pH 7.4 | NaCl | 8 | 137 |
| KCl | 0.35 | 4.7 | |
| MgSO4 | 0.08 | 0.66 | |
| CaCl2 | 0.18 | 1.62 | |
| HEPES | 2.4 | 10 | |
| BSA | 15 | 0.226 | |
| PBS, pH 7.4 | NaCl | 8 | 137 |
| KCl | 0.2 | 2.7 | |
| Na2HPO4-7H2O | 1.15 | 4.3 | |
| KH2PO4 | 0.2 | 1.4 | |
| Other reagents | |||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Percoll (PVP solution) | GE Healthcare | 288555 | |
| Collagenase Type IV | Sigma Aldrich | C5138 | |
| Isoflurane | Abcam | ab144581 | |
| Hepatocyte Growth Medium | |||
| DMEM | Gibco | 11965118 | |
| 10% by volume fetal bovine serum | Gibco | 10437010 | |
| Pen/Strep (2x) | Gibco | 15140148 | |
| Long-term Hepatocyte Growth Medium | |||
| DMEM | |||
| 10% by volume fetal bovine serum | Gibco | 10437010 | |
| Pen/Strep (2x) | Gibco | 15140148 | |
| Glucagon | Sigma | G3157-2mg | 14 ng/mL |
| Insulin | Sigma | I9278-5mL | 0.5 U/mL |
| Hydrocortisone | Sigma | H0888-1g | 7.5 mg/mL |
| Epidermal Growth Factor | BD Biosciences | 354001-100ug | 20 ng/mL |
| LSEC medium | |||
| RPMI | Gibco | 11875119 | |
| 10% by volume fetal bovine serum | Gibco | 10437010 | |
| Pen/Strep (2x) | Gibco | 15140148 |
References
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