Summary
Een methode is beschreven voor fractionering van onoplosbare en oplosbare mutant huntingtin soorten van muis hersenen en cel cultuur. De beschreven methode is nuttig voor karakterisering en kwantificering van het huntingtin eiwit flux en aids in het analyseren van eiwitten homeostase in de pathogenese van de ziekte en in het bijzijn van verstoringen
Abstract
De accumulatie van misfolded eiwitten staat centraal in de pathologie in de ziekte van Huntington (HD) en vele andere neurodegeneratieve aandoeningen. Met name is een pathologische spil van HD de afwijkende accumulatie van mutant HTT (mHTT) eiwit in ultrahoog moleculair gewicht complexen en intracellulaire opneming organen samengesteld van fragmenten en andere eiwitten. Conventionele methodes voor het meten en begrijpen dat de bijdragen van verschillende vormen van mHTT-bevattende aggregaten zijn fluorescentie microscopie, westelijke vlekkenanalyse en filter overlappen testen.
Meeste van deze methoden zijn echter conformatie specifiek, en daarom kan niet kunt oplossen door de volledige staat van mHTT eiwit flux vanwege de complexe aard van de totale oplosbaarheid en resolutie.
Voor de identificatie van geaggregeerde mHTT verschillende complexen en aangepaste formulieren is scheiding en solubilisatie van de cellulaire aggregaten en fragmenten verplicht. Hier beschrijven we een methode om te isoleren en visualiseren van oplosbare mHTT monomeren, oligomeren, fragmenten en een onoplosbare ultrahoog moleculair gewicht (HMW) geaccumuleerde mHTT soorten. HMW mHTT bijgehouden met de progressie van de ziekte, komt overeen met muis gedrag uitlezingen en heeft geweest beneficiair gemoduleerd door bepaalde therapeutische interventies1. Deze aanpak kan worden gebruikt met muis hersenen en perifere weefsels celkweek maar kan worden aangepast aan andere modelsystemen of ziekte contexten.
Introduction
De verstoring van eiwit kwaliteitscontrole netwerken, zodat het juiste vouwen en aantasting van de cellulaire eiwitten is waarschijnlijk centraal in de pathologie in de ziekte van Alzheimer (AD), de ziekte van Parkinson (PD), de ziekte van Huntington (HD), en andere "eiwit misfolding" stoornissen2,3. Een gedetailleerd inzicht in de proteostasis-netwerkonderdelen en hun bijdragen aan de pathologie zijn daarom cruciaal voor de ontwikkeling van verbeterde therapeutische interventies. HD wordt veroorzaakt door de abnormale groei van een herhaling van het CAG binnen het HD-gen wat resulteert in een uitgebreid stuk van polyglutamines (polyQ) in het eiwit huntingtin (HTT)4. Een consistente pathologische functie van HD pathogenese is de resulterende misfolding, accumulatie en aggregatie van HTT in gebieden van de hersenen en perifere weefsels, waarvan is aangetoond te bemoeien op verschillende manieren met de normale cel homeostase en functie 5 , 6. terwijl HTT overal wordt uitgedrukt, middellange Maxomys neuronen in het striatum zijn selectief kwetsbare en meest openlijk waarin dit probleem optreedt met opmerkelijke corticale atrofie ook geassocieerd met HD pathogenese.
De vorming van aggregaten van HTT in de hersenen van HD patiënten en diermodellen heeft meestal geserveerd als een proxy-marker van progressie van de ziekte en dominant-negatieve winst van functie voor mHTT7. Hoewel de precieze mechanismen door welke proteïne misfolding en aggregatie aan mHTT-geïnduceerde toxiciteit bijdragen kunnen onduidelijk blijven, is de vorming van deze insluitsels in de hersenen van HD patiënten en verschillende diermodellen een invariant en onvermijdelijke functie. Insluitsels lijken te bestaan grotendeels uit geaccumuleerde HTT fragmenten met de N-terminal uitgebreid polyQ, die aangeeft dat proteolyse en verwerking van full-length HTT evenals alternatieve splicing8,9 kan spelen een belangrijke rol in de pathogenese van HD. N-terminale HTT fragmenten kan vormen een pathologische vorm van HTT die kan snel aggregaat, ervoor, en versnellen of propageren de aggregatie proces10.
De aanwezigheid van deze insluitsels doet echter niet noodzakelijkerwijs met HTT-geïnduceerde toxiciteit of cel dood11correleren. HTT wordt voorgesteld te ondergaan het proces van een samenvoeging van een oplosbare monomeer door oplosbare oligomere soorten en β-sheet fibrillen tot onoplosbare aggregaten en insluitsels12. Oplossen van deze verschillende eiwit soorten via standaard biochemische tests is een uitdaging op het gebied als gevolg van hun stabiliteit in lage-wasmiddel lysis-buffermengsel en moeilijkheden in het visualiseren met behulp van standaard biochemische tests. Methodologische overwegingen zijn dus cruciaal voor het opsporen van de mate en het patroon van opgebouwde en geaggregeerde mHTT.
Het hier gepresenteerde protocol biedt een methode om te visualiseren van verschillende tussenproducten van HTT, specifiek de vorming van een onoplosbare HMW HTT-soorten, die lijkt te nauw track met HD pathogenese en ziekte progressie1,13 ,14. Zijnde kundig voor oplossen en het bijhouden van meerdere soorten mHTT biedt onderzoekers een biochemische instrument om te studeren van de pathogenese van de ziekte en het evalueren van potentiële therapeutische interventies door hun modulatie en het effect op de pathogenese van de ziekte.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Dierlijke ethiek verklaring - experimenten werden uitgevoerd in strikte overeenstemming met de gids voor de zorg en het gebruik van proefdieren van het National Institutes of Health en een goedgekeurde dierlijke onderzoeksprotocol door de institutionele Animal Care en gebruik Comité ( IACUC) aan de Universiteit van Californië, Irvine, een AAALAC geaccrediteerde instelling. Alle inspanningen waren geleverd om te minimaliseren van dierenleed.
1. bereiding van Lysis Buffers
- Bereiden "Oplosbare" lysis-buffermengsel (10 mM Tris pH 7.4, 1% Triton-X 100, 150 mM NaCl, 10% glycerol) en steriele filter door 0,22 µm filter.
- Meten voor een werkende "Oplosbare" lysis-buffermengsel, N-Ethylmaleimide (NEM) en grondig oplossen in 100 mM phenylmethysulfonyl flouride (PMSF) opgelost in 100% EtOH.
Opmerking: Lysis Buffer remmers: (i) 20 mM N-ethylmaleimide (NEM); (ii) 0.2 mM PMSF; (iii) 1 mM natrium orthovanadate (Na3VO4); (iv) 1 µg/mL leupeptin; (v) 1 µg/mL aprotinin; (vi) 20 mM Natriumfluoride (NaF).
Let op: Draag een gezichtsmasker bij het werken met NEM in het gehele protocol. Werken van lysis-buffermengsel moet geschieden verse om actieve remmers. - Voor oplosbare lysis-buffermengsel met proteaseinhibitors, voeg remmers in de volgende volgorde: Natriumfluoride (NaF), aan tot de streep met koude lysis-buffermengsel, natrium orthovanadate (Na3VO4), Aprotinin en Leupeptin.
- Meten voor een werkende "Oplosbare" lysis-buffermengsel, N-Ethylmaleimide (NEM) en grondig oplossen in 100 mM phenylmethysulfonyl flouride (PMSF) opgelost in 100% EtOH.
- Voor "Onoplosbaar" lysis-buffermengsel, aanvulling op 4% SDS door 500 µL van 20% SDS aan 2 mL lysisbuffermengsel "Soluble" toe te voegen. Laat bij kamertemperatuur.
Opmerking: SDS neerslaat uit bewaard bij 4 ° C; Houd dit op kamer temp. Eindsamenstelling van Lysis Buffer: 10 mM Tris (pH 7.4); 1% Triton X-100; 150 mM NaCl; 10% glycerol; 4% SDS (onoplosbaar, alleen).
2. oplosbare/onoplosbare fractionering Protocol
Opmerking: Zie afbeelding 1 voor een schema.
- Label twee sets van buizen voor elk monster: "Soluble" en "Onoplosbaar".
- Voeg X-µL van ijskoude werken oplosbare lysis-buffermengsel aangevuld met proteaseinhibitors (zie 1.1.1) weefsel.
Opmerking: X = Volume varieert afhankelijk van weefsel bedrag; Zie tabel 1. - Voor de muis hersenweefsel (d.w.z., striatum), dounce langzaam 30 keer in glas 1 mL douncer en Pipetteer in "Onoplosbaar" aangeduid met buis (Houd op ijs).
Opmerking: Wees voorzichtig niet te breken oppervlak van vloeistof na het starten van douncing, zoals bubbels vormen zullen en onvolledige homogenisering kunnen opleveren. - Spoel de cellen één keer met koud, 1 x PBS voor cellen (dat wil zeggen, HeLa, HEK293T). Verwijderen van PBS en minimale volume van lysis-buffermengsel toepassen op cellen en lift met cel schraper.
Opmerking: Hierboven cellijnen, cellen waren uitplaten aan 5 x 105 cellen per 6 goed plaat en uitgegroeid tot in de buurt van confluentie. Een is goed vergelijkbaar met volumes zijn opgebruikt voor muis striatum. - Breng homogenaat of lysate in cel met het label, "Onoplosbaar" buizen en lyse op ijs 1 h (Start klok nadat definitieve buis is verwerkt).
Opmerking: Voor cel lysates, triturate meerdere malen te breken cel bosjes vóór het opstarten van de incubatie. Vorming van luchtbellen vermijden. Kort vortex pulse elk monster voor 1 s halverwege lysing. - Centrifugeer steekproeven bij 4 ° C bij 15.000 x g gedurende 20 min.
- Herstellen bovendrijvende substantie als de breuk "Soluble".
- Verwijder met Pipetteer, wees voorzichtig niet te verstoren, pellet/bewolkt laag zoals dit de breuk vervuilen zal. Pipetteer oplosbare fractie in "Soluble" label buis. Houd op ijs.
- Pellet met 500 µL van lysis-buffermengsel (x2) en centrifuge bij 4 ° C bij 15.000 x g gedurende 5 minuten wassen nadat elk wassen; het is oke als sommige van de bewolkt laag is afgepipetteerde af.
- Verwijder alle resterende was buffer, waardoor alleen de pellet van weefsel na definitieve wassen.
Opmerking: Vanaf dit punt, onoplosbare monsters moeten nu worden bewaard bij kamertemperatuur. - Resuspendeer pellet met X-µL lysis-buffermengsel aangevuld met 4% SDS (Volume kan worden aangepast afhankelijk van de grootte van de pellet; Zie tabel 1).
- Bewerk ultrasone trillingen ten elk monster voor 30 s bij kamertemperatuur met een sonde ultrasoonapparaat (125 watt, 20 kHz, Pulse, Amplitude 40%, Zie Tabel van materialen).
- Monsters (rollend kook) kook gedurende 30 minuten; Kort centrifugeren (15 s) bij 6.000 x g over een monster niet te verliezen.
- Uitvoeren van DC (detergenten compatibel) eiwit assay (Zie Tabel van materialen) of Lowry eiwit assay voor het meten van de eiwitconcentratie (aanbevolen gestarte verdunningen van 1/5 van het monster in de respectieve lysis-buffermengsel voor celkweek en 1/10 voor weefsel lysates).
Opmerking: Eiwit concentraties moet worden gelezen met behulp van een DC of Lowry bepaling als gevolg van de hoge concentratie van wasmiddel. - Aliquot monsters in 50 µL partijen om bevriezen-ontdooien problemen te voorkomen.
Opmerking: Protocol kan worden onderbroken hier vóór verdere biochemische analyse doordat beide fracties bij-20 ° C.
3. westelijke vlek en kwantificering
- Westelijke vlekken zoals gerapporteerd elders uitvoert1,13 door verdunnen 30 µg van voorbeeld 1:1 bij het laden van de buffer (1.6 x laden kleurstof, 1 x verminderen).
Opmerking: 30 µg eiwit per fractie is voldoende, maar kan worden aangepast voor een optimale resolutie. 3 - 8% Tris-acetaat poly-acrylamide gels moeten worden gebruikt voor de onoplosbare breuk. 4 - 12% bis-Tris gels worden aanbevolen voor de oplosbare fractie. - Monsters (rollende kook) gedurende 5 min. Centrifuge kort koken (15 s) bij 6.000 x g monster te verzamelen.
- Breuken door SDS-pagina en westelijke vlek, volgens protocol van de fabrikant voor gereduceerde monsters analyseren.
Opmerking: Onoplosbare breuk verhelpt best wanneer overgezet naar 0,45 µM nitrocellulose membraan. 0,45 of 0,2 µM nitrocellulose kan worden gebruikt voor de oplosbare fractie, afhankelijk van de grootte van de proteïne van belang. Wat optimalisatie kan worden verlangd voor de beste overdracht van HMW materialen. - Vlek membraan met hele eiwit vlek (bijvoorbeeld, MEMcode, zie de Tabel van materialen) te visualiseren van eiwitten laden van efficiëntie.
Opmerking: Western blots kunnen worden geanalyseerd door gemiddelde pixel intensiteit. Oplosbare breuken kunnen worden genormaliseerd op een house-keeping proteïne beste geschikt voor het experimentele systeem. Onoplosbare breuk als relatieve eiwit overvloed werd gecontroleerd door de omkeerbare eiwit kleuring of Histon 3 normalisatie op aparte vlek.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Resolutie van oplosbare en onoplosbare cel lysates na fractionering kan worden opgespoord met behulp van westerse analyse en filter retardatie assays (Figuur 2). Als voorbeeld, HEK293T cellen werden transfected met behulp van transfectiereagens (b.v., lipofectamine 2000) met HTT exon 1 coderen cDNA met 97 glutamine herhaalt15 gevolgd door de poly proline rijke regio en deze cellen mochten uitdrukkelijke voor 44 h. cellen werden behandeld met ofwel 5 µM MG132 te blokkeren van het proteasoom of DMSO als een besturingselement voor 18 h voorafgaand aan de oogst en lysed als hierboven beschreven. Na fractionering protocol, mutant HTT exon 1 wordt omgezet, als een oplosbare monomeer ongeveer 45 kDa op 4-12% Bis-Tris pagina gels en als een HMW onoplosbare geaccumuleerde soort op 3-8% Tris-acetaat-pagina gelen (figuur 2A). Oplosbare monomeer kan worden gekwantificeerd en genormaliseerd naar een house-keeping eiwit (getoond als GAPDH hier). HMW, onoplosbare mHTT wordt gekwantificeerd als relatieve eiwit overvloed door gemiddelde pixel intensiteit. Wanneer behandeld met de MG132-remmer, is er een merkbare afname van de oplosbare monomeer van mHTT samen met een overeenkomstige toename HMW, onoplosbare mHTT.
Onoplosbare breuken kunnen worden geanalyseerd door additionele technieken zoals een Filter retardatie assay voor het oplossen van onoplosbare, fibrillar mHTT16 (figuur 2B). HeLa cellen transfected waren op dezelfde manier als hierboven met 97Q-HTT exon 1, en zijne-SUMO-1 of His-SUMO-2. Cellen met of DMSO of MG132 werden behandeld voor 18u vóór fractionering en geanalyseerd met behulp van westelijke vlek en filter retardatie vitrotests. Gegevens blijkt dat de aanwezigheid van overexpressie SUMO isovorm HMW zowel fibrillary onoplosbare mHTT verhoogt. Toevoeging van MG132 verergert de toename van onoplosbare mHTT soorten. HWM mHTT soorten kunnen ook worden gedifferentieerd door overexpressie of vermindering van de HD ziekte target, PIAS1 in beide HeLa cellen13 en muis striata1 (figuur 2C-D). Knockdown van PIAS1 in de snel voortschrijdende muismodel van HD, de R6/2, met behulp van virale levering van een siRNA tegen PIAS1, vermindert de accumulatie van HMW onoplosbare mHTT. Virale overexpressie van PIAS1 in R6/2 muizen leidt tot een opmerkelijke toename HMW onoplosbare mHTT (figuur 2D)1. De wijziging in oplosbaarheid tussen fracties is kwantificeerbare en geeft aan dat dit protocol modulatie van pathogene mutant eiwit soorten, waardoor dit een geschikte techniek voor pre-klinische biochemische evaluaties van ziekte interventie kunt bijhouden. Veranderingen in de onoplosbare, fibrillar soorten mHTT ook vangen flux tussen eiwit soorten die gemoduleerd door behandeling met MG132 of regulering van potentiële therapeutische doelen, zoals de PIAS11.
Figuur 1: oplosbare/onoplosbare fractionering protocol en eiwit resolutie. (A) visuele pijpleiding voor fractionering protocol. Het protocol hier beschreven kan worden toegepast op muis weefsels of cellen cultuur monsters maar is geschikt voor aanpassing aan andersoortige monster. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2: vertegenwoordiger resultaten voor Soluble en onoplosbare fractioneringen en analyses. (A) Soluble en onoplosbare breuken uit HEK293T cel lysates opgelost op een 4-12% Bis-Tris en 3-8% Tris-acetaat-pagina gelen, met alle respect. Oplosbare fractie genormaliseerd naar GAPDH laden controle toont schommelingen van mHTT exon 1 oplosbare monomeer op basis van blootstelling aan MG132. Onoplosbare fractie toont dat HMW geaccumuleerde soorten mHTT ook gemoduleerd door MG132 behandeling. (B) analyse van oplosbare en onoplosbare breuken uit HeLa cel lysates met behulp van westelijke vlek en filter retardatie analyses: HeLa cellen werden transfected met zijne-SUMO-1 of SUMO-2 en/of 97Q-HTT exon 1 en behandeld met 5 µM MG132 voor 18 hr.* (C) Oplosbare en onoplosbare fractionering van HeLa cellen overexpressing 97Q-HTT exon 1 en ofwel PIAS1 overexpressie of behandeld met een siRNA tegen PIAS1 Toon regulering van HMW mHTT accumulatie na het moduleren van een potentiële therapeutische target.* (D) Onoplosbare breuken uit muis striata microRNA tegen PIAS1 behandeld en opgelost op 3-8% Tris-acetaat-pagina gelen Toon modulatie van HWM onoplosbare mHTT **. Panelen (B-C) zijn gewijzigd met toestemming13. Deelvenster (D) is met toestemming1gewijzigd. * Herdruk van O'Rourke et al. 13 met toestemming. ** herdruk van Ochaba et al. 1 met toestemming van Elsevier. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
| Weefsel (per halfrond) | Geschatte gewicht (mg) | Volume oplosbaar (µL) | Volume onoplosbare (µL) |
| muis Striatum | 30 | 250 | 150 |
| muis Cortex | 100 | 500 | 250 |
| muis Hippocampus | 30 | 250 | 150 |
| muis Cerebellum | 40 | 250 | 150 |
| muis Skeletal muscle * | 100 | 300 | 150 |
| muis lever (lobe) | 100 | 400 | 200 |
| * bindweefsel vormen melkachtig interface; verwijderen om besmetting te voorkomen | |||
Tabel 1: voorgestelde volumes (X) voor weefsel-specifieke fractionering voor zowel oplosbare en onoplosbare lysis buffers. Het buffervolume van de lysis van de onoplosbare op basis van de hoeveelheid materiaal, dat kan worden aangepast dienovereenkomstig op basis van onoplosbare pellet grootte beginnen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Enkele voorzorgsmaatregelen zijn nodig voor de bovenstaande protocollen om ervoor te zorgen consequent en kwantitatieve resultaten. Eerst, mHTT in beide breuken spontaan zal aggregaten vormen na verloop van tijd op meerdere bevriezen dooi cycli, met name bij een hoge concentratie. Het is dus cruciaal voor aliquots van het eiwit preps bevriezen en ontdooien alleen het benodigde volume voordat u de test uitvoert zoals beschreven in het bovenstaande protocol. Verder, als onoplosbare breuk resulteert in witte neerslaande bij ontdooien, reconstructie kan nodig zijn door een extra 5 s ultrasoonapparaat puls, 5 min kook en opnieuw kwantificatie vóór de analyse via biochemische tests.
Kwantitatieve resolutie voor deze test is haalbaar door het normaliseren van de gemiddelde pixel intensiteit van oplosbare fractie aan dat van een besturingselement laden of house-keeping gene binnen elk monster. Zoals hier wordt getoond, werd GAPDH gebruikt als een huis-houden-gen voor de oplosbare fractie als het voornamelijk op het cytosol (Figuur 1 lokaliseert). Andere veelgebruikte house-keeping eiwitten zijn actine, α-tubuline en Erk 1/2. Geschikte normalisatie eiwitten moeten echter worden geoptimaliseerd voor het systeem onderzocht om ervoor te zorgen de steady-state-expressie voor nauwkeurige en uninfluenced normalisatie. Terwijl de onoplosbare fractie als een ruwe nucleaire breuk dient zoals gezien door de aanwezigheid van Histon 3 en gebrek aan GAPDH1, resolutie op 3-8% pagina gels grenzen detecteerbaarheid te vaak gebruikt nucleaire markeringen. De onoplosbare fractie is daarom geschikt voor kwantificering met behulp van de ruwe signaal intensiteitswaarde als een relatieve vertegenwoordiging van eiwit overvloed. Echter hele eiwit markers, zoals omkeerbare eiwit vlekken, worden gebruikt om te controleren voor variaties in eiwit laden en kunnen worden aangepast als een factor van de normalisatie voor onoplosbare breuk.
Bovendien, terwijl fractionering een middel biedt van het oplossen van onoplosbare en oplosbare mHTT-soorten, ondergaat mHTT talrijke conformationele veranderingen in de pathogenese van de ziekte, waarvan sommige zal niet te onderscheiden in de onoplosbare Fractie. Bovendien kunnen sommige conformaties beneficiair bijdragen aan ziekte uitkomst en fungeren als stabiele ontruiming gevorderd. Daarom is het belangrijk om te identificeren van andere mHTT conformeren die correleren met de resultaten voor de pathogenese. Wat optimalisatie mogelijk te visualiseren van andere mHTT tussenproducten. Om aan te pakken dit, kan SDS percentage worden verhoogd tot 20%, als het totaal resistent is tegen lagere concentraties.
Dit protocol toont eiwit fractionering voorwaarden en resulterende vitrotests die verschillende conformaties en fragmenten van mHTT accumulatie en aggregatie in de cultuur van de cel zowel een transgeen muismodel van HD detecteren. Dit soort biochemische eiwit isolatie is voorzag voor de beoordeling van de progressie van de ziekte in andere HD modellen en kan bijdragen aan het groeiende begrip van de dynamiek van de mHTT binnen de cel en hun impact op ziekte pathologie.
Na fractionering, kunnen de monsters op talrijke manieren worden verwerkt. SDS-pagina gevolgd door westelijke vlekkenanalyse lost oplosbare en onoplosbare mHTT soorten om een relatieve beoordeling op niveaus van mHTT soorten1. Het is ook mogelijk om breuken in extra biochemische tests voor de verdere beoordeling mHTT soorten. Bijvoorbeeld kunt agarose gelelektroforese (leeftijd) oplossen en detecteren van oplosbare, oligomere mHTT, terwijl een filter retardatie (FR)-test een krachtig hulpmiddel is voor het detecteren van onoplosbare, fibrillary mHTT soorten16,17.
Een bijkomend voordeel van die deze test presenteert is de beoordeling van eiwit mislocalization pathogenese is gekoppeld. Zoals we in 18 toonden, wordt dit protocol fractionering kunt de visualisatie en het bijhouden van eiwitten zoals Rangap1, die lijken te worden afgezonderd door grote onoplosbare aggregaten en kan niet worden opgelost op een standaard pagina-gel. Bovendien, zoals deze bepaling ook als een ruwe nucleaire/cytoplasmatische scheiding fungeert, kunt een mislocalization van eiwitten, bijvoorbeeld, p65, in HD muis modellen1ook meten.
Een prominente motivatie voor analyse van mHTT aggregatie en accumulatie is de ontwikkeling van nieuwe HD diagnostiek en therapeutics. Verbindingen die remmen of omgekeerde mHTT aggregatie zijn van high-throughput schermen en gerichte tests1,12,19,20,21geïdentificeerd. Echter, gezien de moeilijkheid bij het oplossen van veel van de vormen van mHTT, evaluatie van aggregatie modulatie niet altijd geweest haalbaar. Traditionele lysis methodes kunnen beschikken over Ingehuld cellulaire puin dat potentieel onoplosbare statistische eiwitten bevat, of lysis buffers kunnen niet genoeg wasmiddel voor solubilisatie bevatten. De hier beschreven methode biedt een platform om te isoleren en opsporen van een geaggregeerde vorm van mHTT die kan worden gebruikt als een biochemische merker in cel gebaseerd of preklinische in vivo evaluaties.
De hier beschreven tests kunnen worden toegepast op andere misfolded eiwitten. Als gevolg van de dynamische functie van misfolded eiwitten, kunnen deze tests effectief worden gekoppeld aan andere analyses aan het licht brengen van diepgaande mechanismen van eiwit homeostase en aggregatie. Deze analyses omvat meting van de steady-state niveaus van aggregaten en hun partities in verschillende cel breuken (Figuur 1) of analyse van eiwit vouwen/aggregatie met behulp van gezuiverde recombinante eiwitten. Deze testen zullen bijdragen tot de onderscheiden van directe of indirecte gevolgen van genetische of farmacologische modulatie voor eiwit-afbraak- of aggregatie. Voortbouwend op eerdere in vitro een-synuclein gefractioneerde aggregatie evaluaties22, hebben wij dit werk sindsdien toegepast op Muismodellen van de ziekte van Parkinson om te lossen van diverse conformaties van a-synuclein23. Daarom protocollen in dit werk beschreven kunnen worden toegepast op andere modellen van eiwit misfolding en aggregatie, en kunnen bijdragen tot de ontdekking en ontwikkeling van nieuwe therapieën gericht op geaggregeerde eiwitten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Dit werk werd gesteund door de NIH (RO1-NS090390). Wij zouden ook willen bedanken Dr. Joan Steffanfor technische bijstand en discussie tijdens de ontwikkeling van deze test.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sterile Filter | Millipore | SCGP505RE | Screw cap, sterile vaccum filter |
| 1 mL Tissue Grinder, Dounce | Wheaton | 357538 | |
| Sonicator | Qsonica | Model Q125 | |
| DC Protein Assay | Biorad | 5000111 | Comparable to Lowry assay |
| Tris 1M buffer solution | Alfa Aesar | J60636 | |
| Triton X-100 | Fisher | BP151-100 | |
| NaCl 5M solution | Teknova | S0251 | |
| Glycerol | Fisher | BP229-1 | |
| 20% SDS solution | Teknova | S0295 | |
| N-ethylmaleimide | Sigma | E1271 | |
| Phenylmethylsulfony flouride | Sigma | P7626 | create 100mM stock solution in 100%EtOH, store at 4°C |
| Sodium orthovanadate | Sigma | S6508 | Create 0.5M stock solution in water |
| Leupeptin | Sigma | L2884 | Create 10mg/ml stock solution in water |
| Aprotinin | Sigma | A1153 | Create 10mg/ml stock solution in water |
| Sodium Fluoride | Sigma | S4504 | Create 500mM stock solution in water |
| Anti-HTT | Millipore | MAB5492 | Use 1:1000 for western blot, 1:500 for filter retardation assay |
| Anti-GAPDH | Novus Biologicals | NB100-56875 | Use 1:1000 for soluble western blot |
References
- Ochaba, J., et al. PIAS1 Regulates Mutant Huntingtin Accumulation and Huntington's Disease-Associated Phenotypes In Vivo. Neuron. 90 (3), 507-520 (2016).
- La Spada, A. R., Taylor, J. P. Repeat expansion disease: progress and puzzles in disease pathogenesis. Nat Rev Genet. 11 (4), 247-258 (2010).
- Reiner, A., Dragatsis, I., Dietrich, P. Genetics and neuropathology of Huntington's disease. Int Rev Neurobiol. 98, 325-372 (2011).
- The Huntington's Disease Collaborative Research Group. A novel gene containing a trinucleotide repeat that is expanded and unstable on Huntington's disease chromosomes. Cell. 72 (6), 971-983 (1993).
- Sassone, J., Colciago, C., Cislaghi, G., Silani, V., Ciammola, A. Huntington's disease: the current state of research with peripheral tissues. Exp Neurol. 219 (2), 385-397 (2009).
- Weydt, P., et al. Thermoregulatory and metabolic defects in Huntington's disease transgenic mice implicate PGC-1alpha in Huntington's disease neurodegeneration. Cell Metab. 4 (5), 349-362 (2006).
- Schulte, J., Littleton, J. T. The biological function of the Huntingtin protein and its relevance to Huntington's Disease pathology. Curr Trends Neurol. 5, 65-78 (2011).
- Gipson, T. A., Neueder, A., Wexler, N. S., Bates, G. P., Housman, D. Aberrantly spliced HTT, a new player in Huntington's disease pathogenesis. RNA Biol. 10 (11), 1647-1652 (2013).
- Neueder, A., et al. The pathogenic exon 1 HTT protein is produced by incomplete splicing in Huntington's disease patients. Sci Rep. 7 (1), 1307 (2017).
- Arndt, J. R., Chaibva, M., Legleiter, J. The emerging role of the first 17 amino acids of huntingtin in Huntington's disease. Biomol Concepts. 6 (1), 33-46 (2015).
- Saudou, F., Finkbeiner, S., Devys, D., Greenberg, M. E. Huntingtin acts in the nucleus to induce apoptosis but death does not correlate with the formation of intranuclear inclusions. Cell. 95 (1), 55-66 (1998).
- Kim, S., Kim, K. T. Therapeutic Approaches for Inhibition of Protein Aggregation in Huntington's Disease. Exp Neurobiol. 23 (1), 36-44 (2014).
- O'Rourke, J. G., et al. SUMO-2 and PIAS1 modulate insoluble mutant huntingtin protein accumulation. Cell Rep. 4 (2), 362-375 (2013).
- Shibata, M., et al. Regulation of intracellular accumulation of mutant Huntingtin by Beclin 1. J Biol Chem. 281 (20), 14474-14485 (2006).
- Apostol, B. L., et al. A cell-based assay for aggregation inhibitors as therapeutics of polyglutamine-repeat disease and validation in Drosophila. Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (10), 5950-5955 (2003).
- Wanker, E. E., et al. Membrane filter assay for detection of amyloid-like polyglutamine-containing protein aggregates. Methods Enzymol. 309, 375-386 (1999).
- Sontag, E. M., et al. Detection of Mutant Huntingtin Aggregation Conformers and Modulation of SDS-Soluble Fibrillar Oligomers by Small Molecules. J Huntingtons Dis. 1 (1), 119-132 (2012).
- Grima, J. C., et al. Mutant Huntingtin Disrupts the Nuclear Pore Complex. Neuron. 94 (1), 93-107 (2017).
- Sontag, E. M., et al. Methylene blue modulates huntingtin aggregation intermediates and is protective in Huntington's disease models. J Neurosci. 32 (32), 11109-11119 (2012).
- Trushina, E., Rana, S., McMurray, C. T., Hua, D. H. Tricyclic pyrone compounds prevent aggregation and reverse cellular phenotypes caused by expression of mutant huntingtin protein in striatal neurons. BMC Neurosci. 10, 73 (2009).
- Shahmoradian, S. H., et al. TRiC's tricks inhibit huntingtin aggregation. Elife. 2, e00710 (2013).
- Kim, Y. M., et al. Proteasome inhibition induces alpha-synuclein SUMOylation and aggregate formation. J Neurol Sci. 307 (1-2), 157-161 (2011).
- Goldberg, N. R. S., et al. Human Neural Progenitor Transplantation Rescues Behavior and Reduces alpha-Synuclein in a Transgenic Model of Dementia with Lewy Bodies. Stem Cells Transl Med. 6 (6), 1477-1490 (2017).
