Summary
Dette manuskript beskriver protokollen for Bimolecular komplementering affinitet rensning (BiCAP). Denne nye metode letter specifikke isolering og downstream proteom karakterisering af enhver to interagerende proteiner, mens bortset fra FN-kompleksbundet individuelle proteiner samt komplekser dannet med konkurrerende bindende partnere.
Abstract
Samling af proteinkomplekser er en central mekanisme bag regulering af mange celle signalering veje. En større fokus på biomedicinsk forskning decifrere hvordan disse dynamiske proteinkomplekser handle for at integrere signalerne fra flere kilder for at lede en bestemte biologiske respons, og hvordan det bliver liberaliseret i mange indstillinger for sygdom. Trods vigtigheden af denne centrale biokemiske mekanisme er der en mangel på eksperimentelle teknikker, der kan lette de specifikke og følsomme deconvolution af disse multi molekylære signaling komplekser.
Her er denne mangel behandlet gennem kombinationen af en protein komplementering assay med en kropsbygning-specifikke nanobody, som vi har kaldt Bimolecular komplementering affinitet rensning (BiCAP). Denne roman teknik letter specifikke isolering og downstream proteom karakterisering af ethvert par af interagerende proteiner, med udelukkelse af FN-kompleksbundet individuelle proteiner og komplekser dannet med konkurrerende bindende partnere.
BiCAP teknikken er at tilpasse til en bred vifte af nedstrøms eksperimentelt assays, og den høje grad af specificitet ved denne teknik giver mulighed for mere nuancerede undersøgelser af mekanikken i protein kompleks forsamling end det er i øjeblikket muligt ved hjælp af standard affinitet rensning teknikker.
Introduction
Protein komplekse forsamling er en central proces i at bevare for spatiotemporelle specificiteten af mange signalsystemer veje1,2. Mens den kritiske karakter af denne lovgivningsmæssige rolle er bredt anerkendt, er der en mangel på eksperimentelle teknikker til rådighed til at granske disse komplekser. De fleste interactomics studier fokusere på interaktioner med individuelle proteiner eller sekventiel berigelse af komplekse enkeltkomponenter. Her præsenterer vi en teknik til isoleringen af et specifikt protein dimer mens undtagen de enkelte fraspaltning af komponent proteiner samt komplekser dannet med konkurrerende bindende partnere3. Vi har kaldt denne teknik Bimolecular komplementering affinitet rensning (BiCAP), da det er en kombination af et tidligere eksisterende protein fragment komplementering assay, Bimolecular fluorescens komplementering (BiFC), med den roman brug af en kropsbygning-specifikke rekombinante nanobody mod normal god landbrugspraksis og derivater heraf (Se tabel of Materials).
En typisk protein-fragment komplementering analysen bygger på udtryk for "lokkemad" og "bytte" proteiner smeltet for at opdele fragmenter af journalister som luciferase4, β-galactosidase5eller grøn fluorescerende proteiner (NGL)6 ( Figur 1A). Gennem samspillet mellem agn og bytte proteiner, split reporter domæner til at refold til en funktionel struktur, så interaktionen mellem agn og bytte proteiner skal visualiseres eller kvantificeres. BiCAP blev tilpasset fra en version af denne teknik, der gjorde brug af fragmenter af normal god landbrugspraksis variant Venus. Fluorescerende proteiner komplementering assays er en populær metode til at visualisere protein-protein interaktioner i en levende celle, men indtil nu har været begrænset til denne ene funktion7. BiCAP repræsenterer et betydeligt fremskridt i denne henseende, da denne teknik ikke kun giver mulighed for visualisering, men også isolationen og forhør i den resulterende protein-protein interaktion.
Figur 1: den strukturelle principal bag BiCAP teknik. (A) en skematisk skitserer hovedforpligtet bag bimolecular fluorescens komplementering viser 'bait' og 'bytte' proteiner markeret med N-terminalen V1 eller C-terminale V2 fragmenter af fuld længde Venus protein. (B) strukturel analyse af samspil interface (cyan) mellem normal god landbrugspraksis nanobody (grøn) og rekombineret Venus, viser placeringen af V1 (grå) og V2 (orange) fragmenter (FBF tiltrædelse 3OGO). Dette tal er genudgives fromCroucher et al.3 Reprinted med tilladelse fra AAAS. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
BiCAP teknik gør brug af to ikke-fluorescerende fragmenter af Venus (opkaldt V1 og V2), som forbinder med en lav grad af affinitet, medmindre en interaktion opstår mellem deres fusion partnere. I dette tilfælde refold to split domænerne i den funktionelle β-tønde struktur af fluorophore (figur 1B)6. Den vigtigste fornyelse af BiCAP kommer fra indførelsen af af rekombinante normal god landbrugspraksis nanobody, som anerkender en tre-dimensionel epitop på β-tønde af normal god landbrugspraksis (og varianter som Venus), som kun er til stede på korrekt rekombineret og foldet fluorophore ( Figur 1B)8. Normal god landbrugspraksis nanobody binder afgørende, ikke til nogen af de individuelle Venus fragmenter. Dette letter isolering af protein dimerer kun efter de to proteiner har dannet et kompleks af deres egen fri vilje, fører til mere repræsentative resultater end dem, erhvervet fra metoder, der gør brug af kemisk induceret, tvungen interaktioner9.
BiCAP er en effektiv teknik, der specifikt fokuserer på multi protein komplekser, som potentielt kan kombineres med en række downstream applikationer til at forbedre granulering af vores forståelse af den rolle, disse komplekser spiller i signaltransduktion . Det omfatter også den vigtige funktion at tillade visualisering af protein interaktioner in situ. Til dato, BiCAP er blevet bevist som en effektiv metode til at analysere interactome receptor tyrosin kinase (RTK) dimerer3, men tilpasningsevne af denne metode betyder, at det kan vedtages i næsten enhver protein interaktion sammenhæng.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. plasmid kloning
Bemærk: For at generere plasmid vektorer med V1 eller V2 tags smeltet til enten N-terminus eller C-terminus af gen af interesse, BiFC destination vektorer har været deponeret hos Addgene [N-terminale tag: pDEST-V1-ORF (#73635), pDEST-V2-ORF (#73636). C-terminale tag: pDEST-ORF-V1 (#73637), pDEST-ORF-V2 (#73638)]. Gen/s af interesse skal være i specifik rekombination kloning kompatibel post vektorer (dvs. pDONR223 eller pENTR221), uden stop kodon, at gå videre med kloning. Mange kompatible kloner er allerede tilgængelige inden for forskellige plasmid samlinger, herunder den mammale genom Collection (https://genecollections.nci.nih.gov/MGC/).
- Udføre en rekombination reaktion for at indsætte gen af interesse mellem attR lokaliteter af passende BiFC destination vektor:
- I en 0,2 mL tube, tilføje 150 ng post vektor, 150 ng BiFC destination vektor og 8 µL TE buffer (pH 8.0).
- Tilføj 2 µL recombinase enzym mix (Se Tabel af materialer). Bland godt og centrifugeres kort.
- Inkuber reaktion i 1 time ved stuetemperatur eller ved 16 ° C natten over.
- Reaktionen standses ved at tilføje 1 µL Proteinase-K løsning og inkubation ved 37 ° C i 10 min.
- Omdanne heat-shock-kompetente celler (Se Tabel af materialer) med LR reaktionsprodukt:
Bemærk: Enhver grundlæggende stamme kan tænkes bruges på dette punkt, så længe det ikke indeholder Ccdb antitoksin, hvilket ville forhindre det særlige udvalg af plasmider, der indeholder insertet.- Tø kompetente celler på is og overføre 50 µL af celler ind i en 14 mL rundbundet polypropylen rør.
- Tilsæt 1 µL af reaktionsprodukt til cellerne og forsigtigt blandes. Ruger i 20 min. på is.
- Heat shock i 42 ° C vandbad til 45 s. straks tilbage til is i 2 min.
- Der tilsættes 1 mL af LB medier og inkuberes med ryster ved 37 ° C i 1 time.
- Plade transformation på en 10 cm agar plade med Ampicillin (100 µg/mL) og inkuberes ved 37 ° C natten over.
- Rensning af BiFC plasmid.
- For at rense plasmid fra en enkelt koloni, tilsættes 100 mL af LB medier til en stor konisk kolbe og tilføje Ampicillin (100 µg/mL). Gennemgå flere kolonier, tilsættes 5 mL af LB medier 14 mL rundbundet polypropylen rør og tilføje Ampicillin (100 µg/mL).
- Ved hjælp af en steril podning løkke, vælge en enkelt koloni fra agar plade. Placer podning loop i LB medier og bland kortvarigt.
- Dække toppen af den koniske kolbe med aluminiumsfolie og inkuberes natten over ved 37 ° C under omrystning.
- Producere Transfektion grade plasmid DNA ved hjælp af en standard maxiprep eller midiprep plasmid DNA rensning kit (Se Tabel af materialer)10. Vurdere kvaliteten af DNA af absorbans spektre.
Bemærk: DNA bør have en A260/A280 ratio > 1,8 og en A260/A230 forhold > 2.0. På dette tidspunkt, anbefales det at screene flere enkelte kolonier til at kontrollere for effektiv udtryk for Indsæt og tag.
2. celle kultur og Transfektion
Bemærk: For Transfektion af BiFC vektorer er det vigtigt at opnå en høj effektivitet, og relativt homogen Transfektion. Vektorerne vil sandsynligvis være kompatibel med enhver standard Transfektion reagens, og Transfektion betingelser bør optimeres i overensstemmelse hermed. For at udføre massespektrometri, kultur vi normalt celler inden for 10 cm retter, selv om dette kan også være forholdsmæssigt skaleret til mindre retter eller plader til eksperimenter, der kræver mindre materiale.
- Frø 1,0 × 106 HEK293T celler i en 10 cm parabol med 10 mL af DMEM media, suppleret med 10% FBS og Penicillin/Streptomycin (1: 100).
- Fortynd 2,5 µg af hver BiFC vektor til 500 µL af Transfektion buffer (Se Tabel af materialer) i 1,5 mL microcentrifuge rør.
- Tilsæt 10 µL af Transfektion reagens (Se Tabel af materialer).
- Vortex blanding for 10 s, så kortvarigt centrifuge. Der inkuberes i 10 min. ved stuetemperatur.
- Tilføje DNA Transfektion blanding til pladen, dråbevis. Inkuber celler for en tilstrækkeligt lang tid for BiFC fusion proteiner til at interagere og Venus folde og fluorophore modning, generelt ~ 8-24 timer.
Bemærk: Peak excitation for Venus er 515 nm, og dens peak emission er 528 nm, selvom det ses let ved hjælp af en standard fluorescerende mikroskop sat op til at visualisere normal god landbrugspraksis fluorescens.
3. Prøvetilberedning
-
Høst af lysates
- Før lysate samling, forberede celle lysisbuffer [50 mM Tris-HCl (pH 7,4), 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1% (v/v) nonionisk detergent (Se Tabel af materialer)]. Opbevares ved 4 ° C.
- Umiddelbart inden høst, supplere 10 mL af celle lysisbuffer med protease inhibitor og fosfatase inhibitor (Se Tabel af materialer). Holde suppleret celle lysisbuffer på is.
- Vaske cellerne to gange i iskold PBS. Opsug PBS og tilsættes 1 mL iskold suppleret celle lysisbuffer. Placer skålen på is, sikring af bufferen, der er spredt over hele arealet.
- Der inkuberes i isbad i ca 5 min og derefter bruge en celle skraber (Se Tabel af materialer) at skrabe cellerne og overføre til en pre kølet 1,5 mL microcentrifuge tube.
- Fjern celleaffald ved centrifugering de indsamlede lysate på 18.000 × g for 5 min. ved 4 ° C og overførsel fjernes supernatanten i friske microcentrifuge rør.
Bemærk: på dette tidspunkt i lysate kan bruges umiddelbart, eller opbevares ved-80 ° C. Det anbefales også at holde en alikvot af rå lysate, så effektiviteten af Transfektion og affinitet rensning kan valideres.
-
Affinitet rensning
Bemærk: BiCAP isolation trin udføres ved hjælp af normal god landbrugspraksis nanobody konjugeret til Agarosen perler (Se Tabel af materialer).- Forberede Agarosen perler ved at vaske en passende mængde (20 µL pr. sample) + 10 µL overskydende i 1 mL PBS. Centrifugeres perler på 300 x g og Fjern supernatanten.
- Tilføj 20 µL til hver lysate prøve.
- Inkuber prøver i 2 timer ved 4 ° C med ende til rotation.
Bemærk: på dette tidspunkt prøver kan være forberedt på enten SDS-PAGE og western blotting eller analyse af massespektrometri.
-
Forberedelse af BiCAP eluant for western blotting.
- Der centrifugeres perler på 300 x g og vaskes tre gange i celle lysisbuffer.
- Resuspend vasket perlerne i 50 µL af passende fortyndet prøvebuffer (Se Tabel af materialer) og varme prøver ved 95 ° C i 2-3 min.
Bemærk: Prøver forberedt på denne måde kan opbevares ved-20 ° C i flere måneder. - Udføre SDS-PAGE og western blotting11 for både V1 tag og V2 tags (Se tabel over materialer), som godt som enhver anden proteiner af interesse.
-
Forberedelse af BiCAP eluant for massespektrometri.
Bemærk: For analyse af label-fri kvantitativ massespektrometri (LFQ) Det anbefales at forberede prøverne i mindst forsøgsbetingelse for at sikre robuste statistiske effekt.- Der centrifugeres perler på 300 x g og vask seks gange i celle lysisbuffer uden vaskemiddel. Det er nødvendigt at fjerne både den overskydende protein, og også det vaskemiddel, der vil forstyrre massespektrometri analyse. Gå videre til næste trin straks, eller gemme perler på-80 ° C.
- Trypsinize perler i 60 µL Buffer 1 [2 M urinstof, 50 mM Tris-HCl (pH 7,5), 5 µg/mL trypsin]. Tillad perler til at fordøje for 30 min på 27 ° C i en thermomixer ryster på 800 RPM.
- Kort centrifugeres perler, derefter indsamle supernatanten og overførsel til microcentrifuge rør (Se Tabel af materialer).
- Vaske perlerne i 25 µL Buffer 2 [2 M urinstof, 50 mM Tris-HCl (pH 7,5), 1 mM dithiothreitol], for at reducere de bundne proteiner.
- Samle perler og supernatanten ind i et microcentrifuge rør. Tillad fordøjelsen at forekomme natten over ved stuetemperatur.
- Alkylatbenzin prøverne ved at tilføje 20 µL af iodoacetamide (5 mg/mL i ultrarent vand) til hver prøve og Inkuber i mørke i 30 min.
- Hæmme fordøjelsen ved behandling af hver prøve med 1 µL trifluoreddikesyre (TFA). Dette trin vil også forsure prøver under forberedelse til fase deponering.
- Konstruere C18 fase tips ved stabling 6 lag af 1 mm solid fase udvinding C18 (Octadecyl) membran diske (Se Tabel af materialer) i en 200 µL mikropipette tip. Forberede en enkelt tip til hver prøve.
- Våd fase tips med methanol, og Blandingen henstår med 50 µL 0,1% (v/v) trifluoreddikesyre (TFA), 80% (v/v) acetonitril.
- Vask tips med 50 µL 0,1% (v/v) TFA.
- Indlæse de syrnet peptider ind på scenen tips og derefter elueres ved hjælp af 0,1% (v/v) TFA, 80% (v/v) acetonitril i to trin.
- Fordampe prøver ved hjælp af et vakuum koncentrator.
- Du kan eventuelt gemme tørrede peptider ved-80 ° C.
4. massespektrometri.
- Resuspend prøver i 15 µL af 5% myresyre, 2% acetonitril (i ultrarent vand).
- Omhyggeligt indlæse 6 µL til en LC plade og sted i en nanoLC HPLC system (Se Tabel af materialer).
- Pack en 20 cm, 75 µM indre diameter kolonne med 1.9 µm C18 stationær fase partikler (Se Tabel af materialer). Indlæse 5 µL peptid hver kolonne.
- Elueres peptider ved hjælp af en lineær gradient af acetonitril på 250 nL/min over 140 min. og indføre ved nanoelectrospray i en lineær fælde Quadropole (LTQ) hybrid massespektrometer koblet til nanoLC HPLC system.
- Indsamle tandem MS data for top 10 mest rigelige ioner pr scan over 140 minutters tid gradueringsfyld. Randomisere rækkefølgen af dataindsamling og dataudveksling med BSA køre mellem hver prøve at minimere tidsmæssige bias.
5. analyse
- Behandle rå MS data ved hjælp af standardindstillingen inden for MaxQuant softwareversion 1.2.7.4 og analysere MaxQuant output ved hjælp af modificeret version af Perseus statistisk analyse arbejdsgang i R software miljø3.
NOTE: Den statistiske analyse arbejdsproces fra dette punkt er sammenfattet i figur 2. Kort, LFQ støtteintensiteter af proteiner ved hjælp af MaxQuant er forvandlet og filtreret efterfulgt af normalisering og imputering. Interagerende proteiner af dimer par identificeres ved sammenligning med en Venus kontrol, at udelukke uspecifik baggrund bindemidler, med Student's t-test og Benjamini-Hochberg korrektion for flere sammenligninger. Datakvaliteten er bekræftet af sammenligninger af individuelle histogrammer, multipel regression og hierarkisk klyngedannelse.
Figur 2: oversigt over statistisk analyse arbejdsprocessen. Blokdiagram af statistisk analyse pipeline bruges til at analysere LFQ intensiteten af proteiner identificeret fra rå massespektrometri, der behandles ved hjælp af MaxQuant. Grønne kasser: filtrering, blå kasser: transformation/normalisere/skalering, brune kasser: data kvalitetskontrol, gule bokse: semi-kvantitative udelukkelse/sammenlignende analyse, grå bokse: statistisk analyse. Dette tal er genudgives fromCroucher et al.3 Reprinted med tilladelse fra AAAS. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Efter brug af rekombination kloning for at generere V1 og V2 tagged gener af interesse med BiFC pDEST plasmider, co Transfektion af to plasmider indeholder en interagerende par af proteiner vil resultere i generation af en Venus fluorescerende signal efter ca. 8-24 timer. I mangel af et positivt signal er det muligt, at protein interaktion ikke kan som følge af valget af cellelinie, en lav Transfektion effektivitet eller at orienteringen af BiFC tags er ikke optimal. Fejlfinding i forbindelse med hvert af disse scenarier er diskuteret nedenfor.
Vi har tidligere observeret en positiv interaktion for en række forskellige protein typer ~ 16 timer efter Co Transfektion af HEK-293T celler. Dette omfatter dimerisation af RTK ERBB2 på plasma membran (figur 3A)3 og binding af Ubiquitin til E3 ligase UBR5, forekommer overvejende inden for kernen (figur 3A)12. Evnen til at visualisere specifikke subcellulære lokaliseringen af disse protein-protein interaktioner, i modsætning til det hele-celle fluorescens af fuld længde Venus protein (figur 3A), er den primære funktion af den eksisterende BiFC teknik. Men den afgørende innovation af BiCAP teknikken er evnen til at specifikt rense og karakterisere disse interagerende proteiner.
Figur 3: BiCAP giver mulighed for visualisering og isolation af interagerende proteiner. (A) Konfokal Fluorescens mikroskopi analyse af fluorescerende signal produceret af fuld længde Venus protein, samspillet mellem ERBB2-V1 og ERBB2-V2 og interaktion mellem V1-UBR5 og V2-Ubiquitin efter Transfektion i HEK-293T celler. Skala barer, 10 µm. (B) HEK-293T celler var transfekteret med en kontrol plasmid som indeholder fuld længde Venus, ERBB2-V1, ERBB2-V2 eller både ERBB2-V1 og ERBB2-V2, efterfulgt af immunoprecipitation med normal god landbrugspraksis nanobody og Western blotting med den angivne antistoffer. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Denne specifikke rensning af BiCAP-protokollen umiddelbart kan iagttages efter Transfektion af en kontrol plasmid indeholder den fuld længde Venus protein, individuelle plasmider indeholder repræsentant V1 eller V2 markeret proteiner eller den Co Transfektion af disse to plasmider (figur 3B). Efter Transfektion af disse plasmider i HEK-293T celler, og en 16 h inkubation viser forberedelse af rå lysates for western blotting med V1 og V2 tag antistoffer, at hver tagged protein er til stede i passende prøven. Men, følgende affinitet rensning med normal god landbrugspraksis nanobody, kun fuld længde Venus kontrol protein og interagerende V1 og V2 tagged proteiner inden for Co Transfektion prøven kan være registreret (figur 3B).
Denne selektive rensning af interagerende proteiner kan efterfølges af en række downstream teknikker. I vores seneste publikation3 vi udnyttede BiCAP arbejdsprocessen for at udføre massespektrometri interactome analyse af RTK ERBB2 som enten en homodimer eller en heterodimer med EGFR og ERBB3 (figur 4). Ved at følge vores data analyse rørledningen (figur 2) og visualisere data ved hjælp af Cytoscape13 identificeret vi forskellige delmængder af proteiner, der kommunikerede med alle tre ERBB2 dimerer, eller var specifikt for et par dimerer, eller en individuel dimer. Nærmere analyse af disse interaktion profiler gjort det muligt at identificere nye mønstre af adapter protein bindende regulering dimer-specifikke signaltransduktion begivenheder, som ikke ville have været muligt ved hjælp af standard co-immunoprecipitation tilgange.
Figur 4: analyse af interactome mangfoldighed af ERBB2-holdige dimerer. De receptor lokkemad bruges til BiCAP er vist i orange, kernegruppe af 10 proteiner fælles for interactome i alle tre receptor dimerer er vist med blåt. Interagerende proteiner fælles for to receptor dimerer er vist i grøn, og at en receptor i grå. Dette tal er genudgives fromCroucher et al.3 Reprinted med tilladelse fra AAAS. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
BiCAP er en kraftfuld metode til at isolere bestemte protein dimerer mens undtagen de enkelte komponenter og deres konkurrerende bindende partnere3. BiCAP er baseret på tilpasning af et fluorescens protein komplementering assay kaldet BiFC6. Eksisterende metoder, herunder BiFC og nærhed ligatur assays, har været brugt i udstrakt grad til at visualisere og kvantificere protein interaktioner i levende celler7, men giver ikke et effektivt middel til isolerer og karakteriserer dimerer dannet fra disse interaktioner.
Protein komplementering baseret affinitet rensning teknikker har også fortsat udvikles. Schopp et al. beskrev for nylig et system for protein dimer nærhed mærkning ved hjælp af BioID14. Ved fusing split fragmenter af biotin ligase BirA til to interagerende proteiner, rettet de berigelse af Ago2 indeholdende proteinkomplekser involveret i miRNA-medieret genhæmning. Split-BioID supplerer BiCAP i giver mulighed for selektiv berigelse af proteiner inden for nærhed vifte af BioID, hvor BiCAP beriger direkte komplekse interactors.
BiCAP teknik succes afhænger af effektiv Transfektion af BiFC vektorer. Mens vi bruger rutinemæssigt HEK293T celler som en robust og let at transfect cellelinje, kan brug af denne cellelinie hinder identifikation af potentielt celle-specifikke interaktion partnere. Vi vil derfor anbefale, at valget af cellelinie overvejes nøje til hvert eksperiment, især for undersøgelser med en bestemt sygdom fokus. Ud over dette, bør optimering af Transfektion betingelser også udføres for hver eksperimentelle setup. De værdier, der er skitseret i protokollen er afstemt med vores arbejde på ERBB2 og var kalibreret til at tilnærme niveauer af endogent ERBB2 inden for bryst kræft cellelinjer. Det er klogt, hvornår begynder undersøgelse af et specifikt protein-protein interaktion, til at udføre flere forsøg med varierende mængder af begge konstruktioner for at nå udtryk niveauer der er i overensstemmelse med de tilstedeværende i en fysiologisk eller Patho-fysiologiske indstilling.
Et andet vigtigt element i denne protokol er at fastlægge den korrekte tid for prøver at være høstet følgende Transfektion. Mens dannelsen af proteinkomplekser er generelt en forbigående proces, med de enkelte komponenter kombinere og demontering over tid, har refolded Venus fragmenterne en meget langsom dissociation sats, der ikke måske afspejler deres fusion partneres. Konkret betyder dette at en rimelig stram tidsramme efter Transfektion er nødvendigt at give et realistisk resultat og ansamling af højt over udtrykt protein aggregater. Generelt, når BiFC Fluorescens er observerbare under en standard wide-felt fluorescerende mikroskop (f.eks. ~ 16 timer for ErbB2 dimerer), celler kan være forberedt til høst af lysates eller imaging, selv om dette kan være nødvendigt at være justeret for hver specifik agn og bytte protein.
Vores seneste publikation demonstreret nytte af BiCAP til at isolere RTK dimerer3. Denne eksperimentelle setup havde fordel af en kendt orientering for protein interaktion, så den direkte justering af V1 og V2 tags i den intracellulære, C-terminale ende af hver receptor. Tæt justeringen af disse tags er nødvendige for deres re folde, og når undersøger proteiner interaktioner uden en kendt orientering er det afgørende at generere alle varianter af N-terminal og C-terminale tag fusioner for at identificere en kombination der vil resultere i en positiv BiFC signal. Selv med inddragelse af trinnet optimering er der stadig mulighed for en falsk negativ Hvis justeringen af et specifikt protein interaktion helt udelukker enhver interaktion mellem koderne.
Omvendt skal også sørges at forhindre forekomsten af en falsk positiv interaktion. Ved længere tid (> 36 h), vi har tidligere observeret fremkomsten af ikke-specifik baggrund fluorescens med nogle protein interaktion par. Hvor det er muligt, kan ikke interagere kontrol medregnes også sikre specificiteten af observerede protein interaktion og informere en passende tidsramme for analyse efter Transfektion.
BiCAP er en meget fleksibel teknik, der gælder for næsten ethvert par af interagerende proteiner. For at påvise nytten af denne teknik har vi præsenteret interactome data genereret ved anvendelse af massespektrometri. De renset komplekser bør dog være forenelig med enhver ønskede downstream analyse. For eksempel, mens BiCAP-protokollen giver mulighed for rensning af interagerende proteiner, kan det også have genomisk programmer gennem downstream brug af CHIP-seq sammen med proteomics. Anvendelsen af BiCAP i denne indstilling vil give stigende niveauer af detaljer til DNA bindende motiver af bestemte transkriptionsfaktorer, der er også stærkt reguleret gennem komplekse dimerisation mønstre.
BiCAP udgør derfor en robust tilpasning af protein fragment komplementering assays, som gør det muligt for afhøring af biokemiske og genomisk netværk med stærkt forøget opløsning. I fremtiden, vil tilpasning og udvidelse af BiCAP teknik øge vores forståelse af kompleksiteten og plasticitet protein signaling netværk, og deres fintunet rolle i reguleringen af udviklingsmæssige, fysiologiske og sygdomsprocesser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at videregive
Acknowledgments
D.R.C er en Cancer Institute NSW fyr og D.N.S var tidligere en Cancer Institute NSW fyr. De forskningsresultater, der er fremlagt i dette manuskript blev finansieret af Cancer Institute NSW (13/FRL/1-02 og 09/CDF/2-39), NHMRC (Project Grant GNT1052963), Science Foundation Irland (11/SIRG/B2157), NSW kontor for videnskab og medicinalforskning, gæst familie Fellowship og Mostyn Family Foundation. J.F.H. og R.S. var modtagerne af en australsk Postgraduate Award.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| LR Clonase II Plus enzyme | Thermo Fisher Scientific | 12538120 | Recombinase enzyme required for Gateway cloning (Step 1) into pDEST BiFC destination vectors |
| Proteinase K, recombinant, PCR grade | Thermo Fisher Scientific | EO0491 | |
| 14 mL round-bottomed polypropylene tube | Corning | 352059 | |
| Ampicillin | Roche Diagnostics Australia | 10835242001 | Stock solution prepared at 100 μg/mL in distilled water. |
| Miniprep kit | Promega Corporation | A1330 | |
| Maxiprep kit | Life Technologies Australia | K2100-07 | |
| DMEM | Gibco | 11995-073 | |
| FBS | Life Technologies Australia | 10099-141 | |
| Penicillin/Streptomycin | Life Technologies Australia | 15070-063 | |
| jetPRIME transfection buffer | Polyplus | 114-15 | |
| jetPRIME transfection reagent | Polyplus | 114-15 | |
| PhosSTOP (Phosphatase inhibitor) | Sigma-Aldrich | 4906837001 | |
| cOmplete, Mini, EDTA-free Protease inhibitor cocktail | Roche | 11873580001 | |
| Cell Scraper | Sarstedt | 83.1832 | |
| GFP-Trap_A | Chromotek Gmbh | gta-100 | GFP nanobody coupled to agarose beads |
| N-terminal GFP monoclonal antibody | Covance | MMS-118P | Will detect the V1 tag within the BiFC vectors |
| C-terminal GFP monoclonal antibody | Roche | 11814460001 | Will detect the V2 tag within the BiFC vectors |
| Sample buffer | Invitrogen | NP0008 | Supplemented with 1 mL β-mercaptoethanol. |
| Sequencing grade modified trypsin | Promega Corporation | V5117h | |
| LoBind microcentrifuge tubes | Point of Care Diagnostics | 0030 108 116 | |
| Iodoacetamide | Sigma-Aldrich | I1149-5G | Prepared at 5 mg/mL in ultrapure water |
| Trifluoroacetic Acid - Sequanal Grade | Thermo Fisher | 10628494 | |
| 3M Empore solid phase extraction C18 disks (octadecyl) - 4.7 cm | Thermo Fisher | 14-386-2 | To prepare stage tips, cut 1 mm disks using an appropriately sized hole punch. Alternatively, pre-prepared stage tips can also be purchased, see below. |
| C18 Stage Tips, 10 µL bed | Thermo Fisher | 87782 | |
| Formic acid OPTIMA for LC/MS grade 50mL | Thermo Fisher | FSBA117-50 | |
| 1.9 μm C18 ReproSil particles | Dr. Maisch GmbH | r119.aq. | Stationary phase particles |
| Acetonitrile OPTIMA LC/MS grade | Thermo Fisher | FSBA955-4 | |
| Easy-nLC HPLC | Thermo Fisher | ||
| LTQ Orbitrap Velos Pro | Thermo Fisher | ||
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | Non-ionic detergent (100%) |
| DH5α cells | Thermo Fisher | Heat-shock-competent cells |
References
- Kolch, W., Pitt, A. Functional proteomics to dissect tyrosine kinase signalling pathways in cancer. Nat Rev Cancer. 10 (9), 618-629 (2010).
- Pawson, T., Kofler, M. Kinome signaling through regulated protein-protein interactions in normal and cancer cells. Curr Opin Cell Biol. 21 (2), 147-153 (2009).
- Croucher, D. R., et al. Bimolecular complementation affinity purification (BiCAP) reveals dimer-specific protein interactions for ERBB2 dimers. Sci Signal. 9 (436), ra69 (2016).
- Cassonnet, P., et al. Benchmarking a luciferase complementation assay for detecting protein complexes. Nat Methods. 8 (12), 990-992 (2011).
- Rossi, F., Charlton, C. A., Blau, H. M. Monitoring protein-protein interactions in intact eukaryotic cells by beta-galactosidase complementation. Proc Natl Acad Sci U S A. 94 (16), 8405-8410 (1997).
- Magliery, T. J., et al. Detecting protein-protein interactions with a green fluorescent protein fragment reassembly trap: scope and mechanism. J Am Chem Soc. 127 (1), 146-157 (2005).
- Hu, C. D., Kerppola, T. K. Simultaneous visualization of multiple protein interactions in living cells using multicolor fluorescence complementation analysis. Nat Biotechnol. 21 (5), 539-545 (2003).
- Kubala, M. H., Kovtun, O., Alexandrov, K., Collins, B. M. Structural and thermodynamic analysis of the GFP:GFP-nanobody complex. Protein Sci. 19 (12), 2389-2401 (2010).
- Fegan, A., White, B., Carlson, J. C., Wagner, C. R. Chemically controlled protein assembly: techniques and applications. Chem Rev. 110 (6), 3315-3336 (2010).
- JoVE Science Education Database. Basic methods in cellular and molecular biology. plasmid purification. J Vis Exp. , (2017).
- Eslami, A., Lujan, J. Western blotting: sample preparation to detection. J Vis Exp. (44), (2010).
- Shearer, R. F., et al. The E3 ubiquitin ligase UBR5 regulates centriolar satellite stability and primary cilia formation via ubiquitylation of CSPP-L. Mol Biol Cell. , (2018).
- Shannon, P., et al. Cytoscape: A software environment for integrated models of biomolecular interaction networks. Genome Res. 13 (11), 2498-2504 (2003).
- Schopp, I. M., et al. Split-BioID a conditional proteomics approach to monitor the composition of spatiotemporally defined protein complexes. Nat Commun. 8, 15690 (2017).
