Summary
Ce travail montre le potentiel de la technologie de baies (PGA) de glycan imprimées pour l’analyse des anticorps anti-glucides chez de petits animaux en circulation.
Abstract
Le répertoire d’anticorps anti-hydrate de carbone d’un individu donné circulants est souvent associé à son statut immunologique. Non seulement l’état immunitaire individuel détermine le succès dans la lutte contre les signaux de menace potentiels internes et externes, mais aussi l’existence d’un modèle particulier consistant à diffuser des anticorps anti-glycane (et leur variation niveau sérologique) pourrait être un marqueur important de l’apparition et la progression de certaines conditions pathologiques. Nous décrivons ici une méthodologie axée sur l’imprimé glycane Array PGA qui offre la possibilité de mesurer des centaines de glycane cibles à très haute sensibilité ; à l’aide d’une quantité minimale de l’échantillon, qui est une restriction des animaux présents lors de petites commune (rats, souris, hamster, etc.) sont utilisés comme modèles pour portent sur des aspects des maladies humaines. Comme un exemple représentatif de cette approche, nous montrons les résultats obtenus par l’analyse du répertoire des anticorps naturels anti-glycanes chez des souris BALB/c. Nous démontrons que chaque souris BALB/c participent à l’étude, tout en étant génétiquement identique et entretenu dans les mêmes conditions, développe un modèle particulier des anticorps anti-glucides naturels. Ce travail se veut étendre l’utilisation de la technologie de la PGA pour enquêter sur le répertoire (spécificités) et les taux d’anticorps anti-hydrates de carbone, tant en santé au cours de n’importe quel état pathologique en circulation.
Introduction
Les anticorps jouent un rôle central dans notre défense contre l’invasion des agents pathogènes en neutralisant directement les virus1,2 et bactéries2,3, en activant le système de complément4,5 et l’amélioration de la phagocytose,6. En outre, ils sont des éléments essentiels en ciblant le cancer et l’élimination des cellules malignes7et homéostasie entretien8,9.
Troubles du système immunitaire peuvent provoquer des maladies auto-immunes et inflammatoires cancer et10 11. Toutes ces conditions pathologiques idéalement exigent un diagnostic rapide pour un traitement efficace. Dans le cas de maladies auto-immunes, la présence sérologique d’auto-anticorps dans la plupart des cas est un facteur prédictif pour le diagnostic de l’auto-immunité10,12. Ces anticorps réagissent avec la surface cellulaire et extracellulaire auto-antigènes et, ils sont souvent présentes pendant plusieurs années avant la présentation d’une maladie auto-immune10,12. Cancer et déficits immunitaires sont aussi diagnostiqués avec les analyses de sang que soit mesurer le niveau d’éléments immunitaires comme les anticorps ou leur activité11.
L’identification du répertoire des anticorps et leur niveau sérologique en circulation sont primordiales pour définir un pronostic et d’évaluer la progression de l’ensemble des conditions pathologiques mentionnées. Nous avons déjà démontré le potentiel de PGA technique pour l’analyse des anticorps dans différentes espèces animales13–16, circulants réduisant au minimum l’utilisation de grands volumes d’échantillons sérologiques, évitant le problème associés de réaction croisée des anticorps17 et profilage de haut débit permettant d’un vaste répertoire d’anticorps15.
Glycan immunologiques sont principalement conditionnées, entre autres facteurs, par l’origine et la production d’hydrates de carbone, qui déterminent l’affinité et la liaison des ligands15,18,19,20 ,21. Glycan immunologiques peuvent être développées en suspension (microsphères)15,21,22 ou en surfaces activées plat15,21,22, 23,24. Le dernier comprennent PGA et ELISA (le plus classique de ces méthodes). Il n’y a pas beaucoup de données comparant ces méthodologies dans le même cadre expérimental15,25,26,27. Précédemment, nous avons comparé l’efficacité et la sélectivité de ces tests immunologiques aux anticorps anti-glycane profil dans des échantillons de plasma humain individuel15. Pour certains anticorps comme ceux groupe ciblage de sang anti-A/B, tous les tests immunologiques pourraient détecter avec une signification statistique et ils en corrélation positive avec l’autre15,18,21. Pendant ce temps, des anticorps anti-P1 étaient principalement détectées par PGA le pouvoir discriminatif plus élevé, et il n’y avait pas de corrélation dans les décisions rendues par les différents immunologiques glycane15,18, 21. ces différences entre les méthodes étaient principalement liées à l’antigène/anticorps ratio et glycan orientation15. ELISA et suspension sont plus susceptibles à la liaison non-spécifique que PGA parce qu’il y a un excédent d’antigène anticorps dans ces méthodes15. En outre, l’orientation des glycanes dans la PGA est plus restreinte que l’ELISA et suspension de tableaux15. ELISA est commode quand l’étude inclut un panneau limité des glycanes. Ainsi que des baies de la suspension, ELISA offre une flexibilité plus large au sujet de la reconfiguration de l’essai. PGA est privilégiée pour la découverte des approches15,18,21,28. Malgré ces avantages et les inconvénients, les immuno-essais mentionnés trois pourraient servir à étudier les différents aspects des interactions anticorps-glycane. L’objectif final de l’étude est que celle guideront le choix de la méthodologie plus approprié.
Le présent travail vise à étendre l’utilisation de la technologie de la PGA pour l’analyse du répertoire des anticorps anti-glycanes chez de petits animaux en circulation. Comme un résultat représentatif, nous présentons ici un protocole détaillé afin d’évaluer le répertoire des anticorps anti-glucides naturels chez la souris BALB/c adulte par PGA.
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Protocol
1. Glycochips Production
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Préparation de microarray
- Imprimer les glycanes (50 mM) et polysaccharides (10 µg/mL) dans une solution saline tamponnée (PBS, pH 8,5) à 6 réplique sur lames de verre N-hydroxysuccinimide-dérivatisés, utilisant le phosphate 300 mM sans-contact arrayer robotique (drop volume ~ 900 pL). Chaque diapositive contient 4 blocs de sous-tableaux (Figure 1 a, en couleurs) répétés 6 fois. Chaque sous-tableau unique est formé par 112 glycane différentes taches, y compris les contrôles (8 lignes × 14 colonnes) (Figure 1 b).
Remarque : Informations relatives à glycane sont fournies dans le tableau1 supplémentaire. La bibliothèque de glycane utilisée pour les puces d’impression est le résultat d’un effort à long terme synthétique de l’équipe de IBCh ; exemples de synthèse sont décrits dans les publications s’y rapportant29,30,31,32,33,34,35,36 ,37,38. La bibliothèque de glycane inclus des antigènes de groupe sanguin et parmi les plus fréquents des oligosaccharides terminales, ainsi que des motifs de base des mammifères N - et O-glycoprotéines liées et des glycolipides, antigènes d’hydrates de carbone associées à la tumeur, et polysaccharides de bactéries pathogènes. - Incuber les lames dans la boîte de l’humidité (humidité relative ~ 70 %) à température ambiante (25 ° C) pendant 1 h.
- Blocage des microarrays : incuber les lames pendant 1,5 h avec un tampon de blocage à la température ambiante (acide borique 100 mM, éthanolamine 25 mM, 0,2 % (v/v) de Tween 20 dans l’eau ultrapure).
- Laver le glycochip avec de l’eau ultrapure et sécher par voie aérienne.
- Imprimer les glycanes (50 mM) et polysaccharides (10 µg/mL) dans une solution saline tamponnée (PBS, pH 8,5) à 6 réplique sur lames de verre N-hydroxysuccinimide-dérivatisés, utilisant le phosphate 300 mM sans-contact arrayer robotique (drop volume ~ 900 pL). Chaque diapositive contient 4 blocs de sous-tableaux (Figure 1 a, en couleurs) répétés 6 fois. Chaque sous-tableau unique est formé par 112 glycane différentes taches, y compris les contrôles (8 lignes × 14 colonnes) (Figure 1 b).
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Glycochip contrôle de la qualité
- Analyser les deux puces à partir de chaque lot à l’aide de 1mg/mL de solution de préparation complexe immunoglobuline (CIP, contenant des IgG, IgM et IgA), 10 µg/mL de solution de biotinylé immunoglobulines de chèvre anti-humain comme un anticorps secondaire (IgM, IgG + IgA), suivie de 1 µg/mL solution du conjugué streptavidine fluorescent correspondant (via le protocole décrit ci-dessous, reportez-vous à l’étape 2).
- Scanner et analyser la glycochips (voir l’étape 3, l’analyse du tableau de glycan).
- Utiliser des lots de microarray avec intra - et inter - chip corrélation supérieure à 0,9.
2. glycane tableau Technique
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Préparer les solutions aqueuses suivantes (dans l’eau ultrapure) et les stocker à température ambiante (25 ° C) :
- Tampon-1 : 1 % (p/v) sérum albumine bovine (BSA) dans du PBS, 1 % (v/v) de Tween 20 et 0,01 % (p/v) NaN3
- Tampon-2 : 1 % (p/v) : BSA dans du PBS, 0,1 % (v/v) de Tween 20 et 0,01 % (p/v) NaN3.
- Tampon-3 : 0,1 % (v/v) de Tween-20 dans du PBS.
- Tampon-4 : 0,001 % (v/v) de Tween-20 dans du PBS.
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Préparation Glycochip et échantillon
- Mettre la boîte de rangement avec les lames sur la table jusqu'à ce qu’ils atteignent la température ambiante (25 ° C).
Remarque : Utilisez des gants en latex sans poudre. Le glycochip doit avoir été manipulé par la partie inférieure de la lame de verre, où se trouve le code à barres. Le code à barres vous aidera à identifier la partie de droite, en évitant le contact avec la surface où les glycanes sont imprimés. - Ouvrir la boîte, prendre la glycochip et le placer dans la chambre d’incubation (25 ° C), déjà conditionnée avec papier filtre mouillé à garder une humidité constante à l’intérieur de la chambre.
- Pendant ce temps, diluer le sérum de souris avec tampon-1 (01:20) dans des tubes de 1,5 mL. Homogénéiser la solution de sérum (5 s) avec un vortex.
Remarque : Le volume nécessaire pour recouvrir complètement une surface unique de glycochip est d’environ 1 mL. - Après l’homogénéisation, incuber le sérum dilué à 37 ° C pendant 10 min dans un bain d’eau pour éviter l’agrégation de l’immunoglobuline. Centrifuger les tubes pendant 3 min à 10 000 x g et 25 ° C, recueillir le surnageant et jeter n’importe quel matériel précipité.
- Placez délicatement le glycochip dans la chambre d’incubation. Il incuber pendant 15 min à 25 ° C avec 1 mL de tampon-3 afin d’éliminer tout matériau résiduel sur la surface de la glycochip.
- Tenez la glycochip en position verticale et il relaver avec quelques gouttes de tampon-3 à l’aide d’une pipette Pasteur en plastique. Retirer soigneusement le tampon de la surface de la glycochip à l’aide de papier filtre.
- Mettre la boîte de rangement avec les lames sur la table jusqu'à ce qu’ils atteignent la température ambiante (25 ° C).
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Réaction : anticorps contraignant
- Placer le glycochip dans la chambre d’incubation. Étalez l’échantillon de sérum dilué sur la surface de la glycochip à l’aide d’une micropipette. Incubez avec agitation orbitale (30 tr/min) à 37 ° C pendant 1,5 h. veiller à ce que tous les endroit sec de la surface glycochip est couvert par l’échantillon de sérum dilué à l’aide de l’embout de la pipette.
- Retirer tout excédent d’échantillon et y plonger le glycochip pendant 5 min dans le tampon-3 à 25 ° C. Ensuite, déplacer le glycochip vers un conteneur avec tampon-4 (5 min) et enfin laver (5 min) le glycochip avec de l’eau ultrapure. Centrifuger le glycochip pendant 1 min à 175 x g et 25 ° C pour éliminer le liquide.
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Détection : anticorps secondaire
- Placer le glycochip dans la chambre d’incubation. Étaler sur la surface de glycochip une solution (5 µg/mL) de chèvre anti-souris (IgG + IgM) conjugué à la biotine dans la mémoire tampon-2. Incubez avec agitation orbitale (30 tr/min) à 37 ° C pendant 1 h.
- Enlever la fraction libre et répéter les étapes de lavage.
- Après la centrifugation, incuber le glycochip dans l’obscurité à 25 ° C pendant 45 min (30 tr/min) avec 2 µg/mL de la solution de streptavidine marquée fluorochrome correspondante (dans la mémoire tampon-2).
- Dans l’obscurité, retirer la fraction libre et répétez les étapes de lavage.
- Sécher le glycochip par voie aérienne.
Remarque : Glycochip devrait être analysé dès que possible. Mais si il est impossible d’analyser immédiatement après la coloration, les glycochips peuvent être stockées dans un endroit frais et sec dans l’obscurité.
3. analyse du tableau de Glycan
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Analyse du tableau
- Laisser le glycochip sur la table jusqu'à ce qu’il atteigne la température de la pièce dans l’obscurité. Dans le même temps, allumer le scanner de diapositives et le laser (onde d’excitation de 633 nm).
- Tenant la biopuce, glisser le glycochip dans la fente jusqu'à ce qu’il touche le dos.
- Numériser le glycochip (« exécution easy scan ») et enregistrer l’analyse comme un «. Fichier TIFF ».
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Quantification de tableau
- Quantifier le tableau à l’aide d’un système d’analyse ScanArray. Ouvert précédemment les images numérisées, en cliquant sur « Fichier » dans le « groupe configurer & fichier » dans la fenêtre principale (Figure 1 b-D)
- Charger le modèle de fichier de tableau correspondant au format de GAL (disposition des glycanes imprimées sur la lame de verre) (Figure 1).
- Ajuster le modèle de liste d’adresses globale en alignant soigneusement le tableau (grilles) avec les points dans l’image et ouvrir la quantification (Figure 1).
- Sélectionnez les paramètres de quantification :
- Type de quantification : Run Quant facile.
- Méthode de quantification : fixe cercle
- Auto trouver Spots : décochez toutes les options
- Méthode de normalisation : LOWESS (localement pondérée Scatter Plot lissage).
- Enregistrer les données chiffrées comme «. Fichier CSV » (Figure 1). Transférer ces données dans un fichier commun de la feuille de calcul à l’aide de Microsoft Excel ou une autre application appropriée.
- Utiliser l’intervalle interquartile (IQR) comme la principale méthode statistique : calcul de la médiane (2 Quartile) de tous les signaux pour chaque ligand et l’écart interquartile (75e et 25e percentiles ou quartiles supérieurs et inférieurs Q3 et Q1, respectivement).
- Effectuer une exploration interactive des données en utilisant une application explorateur de Clustering hiérarchique.
- Utilisation de paramètres de cluster : liaison moyenne (UPGMA) et la distance euclidienne comme similitude distance mesure. Effectuer un regroupement hiérarchique par rangées sans normalisation.
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Representative Results
Nous présentons ici un résumé des résultats représentatifs provenant de la quantification du répertoire d’anticorps naturels anti-glycanes chez une population de 20 souris BALB/c. La glycochips utilisée dans cette étude contenait 419 glycane différentes structures. La plupart des glycanes ont été synthétisés comme -CH2CH2CH2NH2 entretoise bras O-glycosides, dans plusieurs cas comme glycosides2NH2 ou NHCOCH -2NH2 -CH2CH. Toutes les structures de glycane ont été caractérisées par la haute résolution (700 - ou 800 MHz) spectroscopie de RMN, purifié et testé par HPLC, indiquant leur > pureté de 95 %. Nous ont déterminés simultanément IgM + IgG anticorps anti-glycane en raison d’une restriction d’un montant de sérum de souris. Dans la PGA, nous avons considéré comme des valeurs supérieures à 4 000 RFU comme un signal positif de liaison de l’anticorps (cette valeur est environ 10 % de l’albums glycanes RFU). Les résultats présentés dans cet ouvrage suivent la plupart des lignes directrices pour la déclaration de données microarray glycane39. Seulement 17 % des structures glucidiques démontré ≥ 4, 000 RFU dans la PGA (Figure 2, en rouge). La plupart de la fraction glycane structures exposées dans les glycochips n’étaient pas reconnus par le répertoire d’anticorps anti-glycane de souris BALB/c circulants (Figure 2, en bleu et blanc)28. Le modèle conservé des anticorps anti-glucides naturels de souris BALB/c inclus 12 glycane différentes spécificités, avec des intensités de signal médian très élevé d’anticorps contraignant (≥ 10, 000 RFU tableau1)28.
Figure 1 : Représentation schématique (pas à l’échelle) de la configuration de groupe de glycan, impression et l’analyse. (A) imprimé micropuces sont développés avec une bibliothèque de 419 glycane différentes structures, suivie par la détection d’un anticorps secondaire fluorescent étiqueté approprié. Chaque diapositive contient 4 blocs de sous-tableaux (en couleurs), répétées 6 fois. Chaque sous-tableau unique est formé par 112 glycane différentes taches (8 lignes × 14 colonnes), y compris les contrôles. (B) un exemple représentatif des images provenant de microchip numérisation à l’aide d’un scanner de fluorescence (troisième partie de l’image). (C) le processus d’alignement de la « grille » aux spots de chaque sous-tableau unique (ajustement de modèle au cours de la quantification). (D), la fluorescence est détecté pour chaque spot et les résultats sont transférés dans un fichier de feuille de calcul commun. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Répertoire des anticorps d’anti-glucides naturels circulants de souris BALB/c. Échantillons de sérum de souris (01:20) ont été incubées avec le glycochips et analysés à l’aide d’un lecteur de ScanArray. Les données ont été analysées avec un système d’analyse microarray et les résultats ont été exprimés en unités de fluorescence relative (RFU) comme l’écart absolu moyen ± médian (MAD). Les couleurs bleues et blanches représentent liaison signaux inférieurs à 4 000 RFU (arrière-plan) ; la couleur rouge représente les signaux ≥ 4, 000 RFU (liaison positive). F : femelle ; M: masculin (n = 20). Ce chiffre a été reproduit de Bello-Gil, d. et al. 28. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
| Glycane ID (#) |
Structure | Nom commun | Médiane et MAD as RFU | Nombre de souris montrant la RFU ≥4000 (%) | |||
| 60 | 6-O-Su-Galβ-spb | 61113 | 1156 | 100 | |||
| 271 | Galβ1-6Galβ1-4Glcβ-sp | 53622 | 1934 | 100 | |||
| 802 | Galβ1-3GalNAc(furc) β-sp | 51348 | 2324 | 100 | |||
| 176 | 3-O-Su-Galβ1-4(6-O-Su) Glcβ-sp | 43008 | 9342 | 100 | |||
| 166 | GlcAβ1-6Galβ-sp | 39105 | 2993 | 85 | |||
| 150 | 3-O-su-Galβ1-3GalNAcα-SP | 37943 | 3232 | 100 | |||
| 437 | GalNAcα1-3(Fucα1-2) Galβ1-3GalNAcβ-sp | A(type 4) | 33886 | 3193 | 90 | ||
| 125 | 6-Bn-Galβ1-4GlcNAcβ-sp | 32674 | 5389 | 95 | |||
| 154 | 3-O-su-Galβ1-3GlcNAcβ-SP | 32651 | 3954 | 100 | |||
| 177 | 3-O-Su-Galβ1-4(6-O-Su) GlcNAcβ-sp | 32496 | 7215 | 100 | |||
| 287 | 3-O-Su-Galβ1-3(Fucα1-4) GlcNAcβ-sp | SuLeun | 20063 | 4962 | 95 | ||
| 234 | Galβ1-4(Fucα1-3) GlcNAcβ-sp | Lex | 13573 | 2635 | 80 | ||
Tableau 1 : structures de glycane de rang supérieur reconnus par l’anticorps naturels des souris BALB/c. Glycanes avec liaison signaux au-dessus de 4 000 RFU dans au moins 80 % des étudié des souris (n = 20). bsignifie sp aminoéthyle, aminopropyl ou glycyl entretoise. cfuranose ; tous les autres monosaccharides sont sous une forme pyranose ; Résidu du FUC a L-configuration, tous les autres monosaccharides - D-configuration. Ce tableau a été modifié par Bello-Gil, d. et al. 28.
Supplémentaire tableau 1 : liste des glycanes, leur liaison aux anticorps circulants naturels (IgM + IgG) de souris BALB/c (n = 20), exprimée en unités de fluorescence relative (RFU) médiane ± MAD, ainsi que le nombre d’animaux supérieur à couper ()≥RFU 4000). Ce tableau a été reproduit de Bello-Gil, d. et al. 28. s’il vous plaît cliquez ici pour télécharger ce tableau
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Discussion
Glycan microarrays sont devenus des outils indispensables pour l’étude des interactions de protéine-glycane40. Les auteurs décrivent un protocole basé sur la technologie de la PGA pour étudier le répertoire consistant à diffuser des anticorps anti-glucides chez des souris BALB/c. Puisque PGA offre la possibilité à l’écran un grand nombre de glycanes biologiquement inconnu, c’est une découverte très pratique outil13,15,28. La méthode proposée offre la possibilité de mesurer, dans le même paramètre expérimental, des centaines de glycane structures à l’aide d’une quantité réduite de l’échantillon sérologique (50 µL). Ceci est particulièrement critique dans le cas de petits animaux (petit volume de sang circulant), ou lorsqu’il est nécessaire d’extraire le sang plusieurs fois du même animal expérimental.
Nous avons démontré, comme des résultats représentatifs, que les souris génétiquement identiques n’est pas comme équivalents immunologiques ; parce qu’ils développent des modes différents d’anticorps anti-hydrates de carbone naturels (seulement 12 glycane spécificités ont été conservées). Niveau sérologique pour le reste du répertoire des anticorps anti-glucides naturels varie considérablement selon les animaux examinés. Analyse de la microbiote intestinal des animaux consanguins41 pourrait expliquer cette hétérogénéité42,43,44,45,46. Si la production d’anticorps naturels anti-glycane est médiée par la stimulation antigénique du microbiote, et c’est différent chez les souris consanguines41, spécificité fine de ces anticorps ne seront pas identique.
Le principal inconvénient pour le développement de la PGA est l’accès au bien définis glycane structures40,47. Glycanes produites dans les systèmes biologiques sont hétérogènes40,47,48, et leur biosynthèse s’appuie sur l’expression différentielle des enzymes d’hydrates de carbone, résultant en des mélanges hétérogènes de glycoformes, chacun avec une activité physiologique distincte47. La composition complexe et la configuration des glycanes présents dans les systèmes biologiques font leurs productions contestant40,47,,48. Ainsi que la synthèse enzymatique chimio, glycanes isolés provenant de sources naturelles continueront d’être la principale source de glycanes pour tableaux développement40. Rendements faibles synthétique et le processus de purification complexe de glycoprotéines et de glycosphingolipides faire la production efficace des glycanes grand échelle difficile40,47,,48. Par conséquent, la disponibilité et les prix des glycanes continuent à être une condition très restrictive d’étendre l’utilisation du PGA comme un outil de découverte.
En outre, au sein du protocole, des étapes critiques, surtout concernant la distribution correcte de solutions (sérum, anticorps secondaires) sur toute la surface de la glycochip doivent être exécutés avec prudence. La méthodologie nécessite, au minimum, 1 mL de ces solutions, homogène tremper toutes les zones sèches de la surface de glycochip. C’est essentiel pour obtenir des différences minimes entre les répétitions de glycane et à éviter le fond excessif pendant la quantification.
Malgré les restrictions mentionnées, PGA est un outil très sensible pour les approches liées à l’étude des interactions de protéine-glycane40, ou d’étudier le répertoire d’anticorps anti-glycanes dans un cadre expérimental particulier ou condition13, 15,28. Cette étude peut être extrapolée à différentes espèces (y compris les échantillons humains) 13,15,23,28, fournissant une méthodologie polyvalente permettant d’identifier le répertoire de circulation anticorps anti-hydrates de carbone.
Nous prévoyons également la potentialité que cette approche peut apporter dans le diagnostic précoce et traitement dérivé dans certaines conditions pathologiques où les anticorps dirigés aux structures glycane semblent jouer un rôle important.
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Disclosures
Nailya Khasbiullinaet Alexey Nokel sont des employés de Semiotik LLC, qui est le fournisseur de la glycochips utilisée dans cette étude.
Acknowledgments
Ce travail a été soutenu par « Fondo de Investigaciones Sanitarias » (FIS) accorder PI13/01098 d’Institut de santé Carlos III, ministère espagnol de la santé. DB-G a bénéficié d’un poste de chercheur postdoctoral financé par l’Union européenne septième Programme-cadre (7e PC/2007-2013) en vertu de la subvention accord 603049 (TRANSLINK). Travail des NK, NS, NB a été soutenu par grant #14-50-00131 de fondation de la Science russe. DB-G veut exprimer sa gratitude à Marta Broto, J. Pablo Salvador et Ana Sanchis pour l’excellente assistance technique Alexander Rakitko d’assistance dans l’analyse statistique. Avec le soutien de la « Pla de Doctorats industriels de la Secretaria universitats i Recerca del Departament rotatif j’ai Coneixement de la Generalitat de Catalunya (octroyer le numéro 2018 DI 021). Nous remercions CERCA Programme / Generalitat de Catalunya d’appui institutionnel.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antibodies | |||
| biotinylated goat anti-human Igs | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | Ref. #: 31782 | |
| biotinylated goat anti-mouse IgM + IgG | Thermo Fisher Scientific | Ref. #: 31807 | |
| Equipment | |||
| Robotic Arrayer sciFLEXARRAYER S5 | Scienion AG, Berlin, Germany | http://www.scienion.com/products/sciflexarrayer/ | |
| Stain Tray (slide incubation chamber) | Simport, Beloeil, QC, Canada | Ref. #: M920-2 | |
| Centrifuge | Eppendorf, Hamburg, Germany | Ref. #: 5810 R | |
| Pipettes | Gilson, Middleton, WI, USA | http://www.gilson.com/en/Pipette/ | |
| Slide Scanner | PerkinElmer, Waltham, MA, USA | ScanArray GX Plus | |
| Shaking incubator | Cole-Parmer, Staffordshire, UK | Ref. #: SI50 | |
| Biological samples | |||
| BALB/c mice sera | This paper | N/ A | |
| Complex Immunoglobulin Preparation (CIP) | Immuno-Gem, Moscow, Russia | http://www.biomedservice.ru/price/goods/1/17531 | |
| Chemicals, Reagents and Glycans | |||
| Glycan library | Institute of Bioorganic Chemistry (IBCh), Moscow, Russia | N/ A | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, | Ref. #: A9418 | |
| Ethanolamine | Sigma-Aldrich | Ref. #: 411000 | |
| Tween-20 | Merck Chemicals & Life Science S.A., Madrid, Spain | Ref. #: 655204 | |
| Phospahte buffered saline (PBS) | VWR International Eurolab S.L, Barcelona, Spain | Ref. #: E404 | |
| Sodium azide | Sigma-Aldrich | Ref. #: S2002 | |
| Streptavidin Alexa Fluor 555 conjugate | Thermo Fisher Scientific | Ref. #: S21381 | |
| Streptavidin Cy5 conjugate | GE Healthcare, Little Chalfont, Buckinghamshire, UK | Ref. #: PA45001 | |
| Materials | |||
| N-hydroxysuccinimide-derivatized glass slides H | Schott-Nexterion, Jena, Germany | Ref. #: 1070936 | |
| Whatman filter paper | Sigma-Aldrich | Ref. #: WHA10347509 | |
| 1.5 mL tubes | Eppendorf | Ref. #: 0030120086 | |
| Software and algorithms | |||
| ScanArray Express Microarray Analysis System | PerkinElmer | http://www.per | |
| kinelmer.com/microarray | |||
| Hierarchical Clustering Explorer application | University of Maryland, MD, USA | http://www.cs.umd.edu/hcil/hce/ |
References
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